重组腺相关病毒载体介导成纤维细胞生长因子2基因诱导缺血心肌血管新生

探讨重组 2型腺相关病毒载体介导 2型成纤维细胞生长因子基因诱导家兔缺血心肌血管生成的作用。实验对象为 2 0只新西兰兔 ,手术建立心肌缺血模型后随机分为成纤维细胞生长因子基因治疗组和对照组 ,分别向缺血区域心肌注射成纤维细胞生长因子腺相关病毒或磷酸盐缓冲液。 4周后取心肌及肝、肾等器官组织标本 ,采用逆转录聚合酶链反应检测目的基因mRNA的表达 ;制作组织学切片以观察组织病理改变 ,于高倍镜下计数缺血区域微血管数目。结果发现转染的 2型成纤维细胞生长因子基因在缺血心肌中有表达 ,成纤维细胞生长因子基因治疗组缺血区域单个高倍视野内的微血管数为 12 .0± 1.4条 ,对照组为 4 .5± 1.5条 ,二者差异具有显著性 (P <0 .0 1)。 2型成纤维细胞生长因子基因治疗组的肝脏、肾脏、脾脏、角膜和睾丸标本中均未发现 2型成纤维细胞生长因子基因的表达 ,病理检查也未发现组织结构异常。说明腺相关病毒载体介导的 2型成纤维细胞生长因子基因可以有效地转染入家兔缺血心肌 ,并具有明显的诱导缺血心肌血管生成的作用 ,且基因表达仅限于心肌。     

rhbFGF研制及促冠状动脉血管新生作用时间的研究

目的　探讨重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhb FGF)促冠状动脉血管新生的作用时间。方法　开胸结扎兔冠状动脉左前降支 (L AD) ,建立急性心肌梗死动物模型 ;制备 rhb FGF蛋白 ,将其直接四点注入兔缺血心肌内 ,通过病理切片观察缺血心肌内血管新生情况。结果　结扎 L AD后 6周及 12周 ,rhb FGF组与生理盐水对照组 (NS)病理切片 ,随机观察 10个高倍视野无平滑肌小血管计数分别为 6周 (W) :41.13± 10 .0 4,30 .33± 3.2 1,P<0 .0 1;12 W:5 0 .5 0± 9.2 0 ,32 .6 3± 7.2 5 ,P<0 .0 1;有平滑肌血管计数分别为 6 W:16 .2 5± 5 .2 3,10 .75± 4.2 5 ,P<0 .0 1;12 W:16 .88± 4.87,11.2 5± 5 .0 9,P<0 .0 1。结论　缺血心肌内注射 rhb FGF可促进冠状动脉血管侧支新生 ,其作用时间可能小于 12 W。     

骨髓基质细胞的血管新生作用及对心功能的影响

目的　观察骨髓基质细胞在缺血心肌内诱导血管新生的作用及对心功能的影响。方法　复制兔心肌梗死动物模型 ,3d后将体外分离扩增的自体骨髓基质细胞用荧光标记物DAPI标记后移植到梗死周围缺血区心肌 (细胞移植组 ,n =8) ,对照组注射等量培养基 (n =6 )。 4W后 ,先进行心脏超声检查分别测定对照组和细胞移植组左室射血分数 (EF)和短轴缩短率 (FS) ,然后采集移植区心肌标本 ,用荧光示踪方法观察移植细胞在缺血坏死区心肌存活的情况 ,用CD31单克隆抗体免疫组化染色法测定毛细血管密度。结果　细胞移植组心肌组织和小血管内壁均可见蓝色荧光的DAPI标记的移植细胞 ;细胞移植组心肌毛细血管密度显著高于对照组 [(16 3 0 0± 2 5 85 )vs (96 0 0± 16 6 1) ,P <0 0 5 ];细胞移植组EF较对照组增高 [(0 5 0± 0 0 3)vs(0 4 6± 0 0 3) ,P <0 0 5 ],短轴缩短率FS也高于对照组[(2 7 0 2± 1 2 7)vs (2 3 85± 1 6 9) ,P <0 0 5 ]。结论　体外扩增的骨髓基质细胞可在缺心肌内存活 ,并能促进缺血组织血管新生、改善心功能。     

碱性成纤维细胞生长因子基因对心肌梗死后冠状血管新生及血管结构的影响

为探讨心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子基因对心肌梗死后冠状血管新生和血管结构的影响。以碱裂解法大量制备质粒 ;采用开胸结扎兔冠状动脉左前室间支法 ,建立兔急性前壁心肌梗死模型。模型制备成功后将动物分为治疗组 (n =1 9)和对照组 (n =1 8) ,并于心肌内分别注射pcDNA3 碱性成纤维细胞生长因子 1 0 0 μg和pcDNA31 0 0 μg,饲养至第 2、6和 1 2周末处死 ;免疫组织化学法观察蛋白表达 ;病理切片观察梗死心肌组织学变化、缺血心肌内血管新生和血管管壁及管腔变化情况。结果发现 :(1 )实验中描记的心电图证实兔急性心肌梗死模型制作成功。 (2 )免疫组织化学观察注射pcDNA3 碱性成纤维细胞生长因子处心肌组织在 6周内有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。 (3)病理切片行图象分析计算血管密度发现 :治疗组毛细血管密度和小动脉密度显著高于对照组。 (4 )实验第 6周治疗组与对照组动脉平均管壁厚度分别为 1 9.8± 9.9μm比 1 8.9± 9.6 μm (P >0 .0 5 ) ;1 2周分别为 2 8.3± 1 1 .5 μm比 2 4 .1± 1 1 .3μm (P <0 .0 1 ) ;6周比值分别为 0 .31± 0 .1 6比 0 .2 4± 0 .1 2 (P <0 .0 1 ) ;1 2周分别为 0 .34± 0 .1 5比 0 .2 5± 0 .0 9(P <0 .0 1 )。实验结果提示 ,心肌内注射碱性成纤维细胞生长     

重组腺病毒相关病毒携带人血管内皮生长因子165诱导家兔缺血心肌血管生成的研究

目的　将携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF 16 5 )cDNA的重组腺病毒相关病毒 (rAAV)载体注入家兔缺血心肌 ,观察血管内皮生长因子 (VEGF)的血管生成效应。方法　制作家兔急性心肌梗死模型 ,将rAAV hVEGF 16 5注入缺血心肌。 4周后取注射部位心肌 ,用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)和免疫组织化学、Westernblot方法检测目的基因的表达 ,并计数注射部位心肌毛细血管数目 ,评价外源VEGF的生物学活性。结果　注射rAAV VEGF部位心肌VEGFmRNA及其蛋白的表达可持续 8周 ,而且比对照组增加。远隔脏器未见外源VEGF的播散和表达。注射rAAV VEGF部位毛细血管密度比对照组增加。结论　rAAV hVEGF 16 5可以有效地转染成年家兔心肌组织 ,外源基因稳定长期表达 ,同时能够刺激新血管生成 ,并具有良好的安全性。     

新型血清型1型重组腺相关病毒载体携带血管内皮生长因子基因促血管生成的实验研究

目的探讨采用腺相关病毒血清型1型的衣壳蛋白构建的“假毒粒”型重组腺相关病毒（rAAV）1载体介导血管内皮生长因子（VEGF）促血管新生的可行性、有效性。方法以每个细胞10^5vg rAAV1-绿色荧光蛋白（GFP）及rAAV1-VEGF载体量感染C2C12细胞（小鼠成肌细胞）分化的肌管,荧光显微镜下观察rAAV1-GFP的转染效率。ELISA法检测rAAV1-VEGF转染后细胞上清中VEGF表达量。构建小鼠后肢缺血模型,术后10天每只小鼠股部缺血骨骼肌内注射3×10^11vg的rAAV1-VEGF载体,载体转染后1个月ELISA法检测小鼠缺血骨骼肌中VEGF蛋白表达量。载体转染后6周免疫组化检测小鼠缺血骨骼肌中毛细血管及小动脉新生情况。结果rAAV1-GFP感染后120h60％～80％的肌管可表达GFP。rAAV1-VEGF载体感染后第3天细胞上清中分泌的VEGF表达量达到高峰,VEGF浓度为（567．7±16．8）ps／ml。小鼠缺血骨骼肌中rAAV1-LacZ载体转染后1个月转染效率可达100％。rAAV1-VEGF载体转染后1个月平均VEGF浓度为（205．4±36．1）pg／mg总蛋白,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01,n=5）。rAAV1-VEGF载体转染有效促进了血管新生（P〈0．001,n=6）,载体转染6周缺血骨骼肌中毛细血管计数与小动脉计数分别为（147．0±13．3）／mm^2,（17．0±1．2）／mm^2。结论新型“假毒粒”型rAAV1-VEGF载体可能是治疗缺血性心血管疾病更为优越的基因治疗载体。     

心肌内注射腺病毒介导血管内皮生长因子基因的血管生成实验研究

目的探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的血管生成作用. 方法在猪冠状动脉回旋支起始处放置Ameroid闭合器,制备慢性心肌缺血模型,28 d时行选择性冠状动脉造影,观察回旋支狭窄程度.开胸,治疗组(6只)在缺血区心肌内多点注射含人VEGF165基因的重组腺病毒载体(Ad-VEGF165);对照组(6只)在缺血区心肌内多点注射含细菌半乳糖苷酶基因的重组腺病毒载体(Ad-β-gal).转染重组腺病毒载体28 d时重复行冠状动脉造影后,处死猪,取缺血区心肌,做组织学检查;应用酶标法检测血浆中VEGF浓度,采用Rentrop分级、缺血区心肌侧支血管积分和心肌碱性磷酸酶染色法评价血管生成作用. 结果与对照组比较,基因转染3 d时治疗组血浆VEGF增高[(114.6±5.4)pg/ml对(60.3±1.8)pg/ml,P<0.001],7 d时血浆VEGF为(128.4±3.0)pg/ml对(70.9±5.3)pg/ml,P<0.001,14 d后恢复到基线水平.与对照组比较,基因转染28 d时治疗组Rentrop分级增高(2.8±0.4对1.3±0.8,P<0.001),侧支血管积分增高(4.8±0.8对1.7±0.8,P<0.001),缺血区毛细血管密度增高(210±19对62±6,P<0.001). 结论心肌转染Ad-VEGF165后,缺血心肌表达VEGF,产生了血管生成作用.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子对缺血心肌血管结构的作用观察

目的　观察重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhb FGF)对缺血心肌血管结构的作用。方法　建立兔急性心肌梗死模型 ,将 rhb FGF直接四点注射入兔缺血心肌内 ,通过病理切片图像分析观察缺血心肌血管管壁及管腔变化情况。结果　 rhb FGF组与生理盐水组平均管壁厚度分别为 6周 :(2 0 .70± 9.94 ) μm,(18.88± 9.6 5 ) μm,P>0 .0 5 ;12周 :(2 9.87± 12 .96 )μm,(18.13± 11.33)μm,P<0 .0 1;管壁管腔比值分别为 6周 :0 .2 5± 0 .12 ,0 .2 4± 0 .0 2 ,P>0 .0 5 ;12周 :0 .33± 0 .14 ,0 .2 4± 0 .0 9,P >0 .0 5。结论　 rhb FGF促缺血心肌血管新生到一定时期 (可能小于 12周 ) ,血管数量不再增长 ,只是血管管腔增大 ,管壁增厚 ,发生血管重构。     

碱性成纤维细胞生长因子预防球囊成形血管再狭窄

目的 :探讨实验性兔髂动脉粥样硬化狭窄模型于血管成形后 ,给予碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) ,对改善血管内皮功能及对再狭窄的预防作用。方法 :建立髂动脉狭窄模型兔 6 0只 ,2 0只用于成形前 (10只 )和成形后即刻 (10只 )管腔面积的组织学分析 ,余 40只随机分成 b FGF组和对照组 ,于血管成形后 4周两组兔均处死 ,行体外血管反应性测试和管腔面积的组织学分析。结果 :由乙酰胆碱诱导的内皮依赖性最大舒张反应 (Emax)b FGF组 [(41± 8) % ]大于对照组 [(12± 9) % ],P <0 .0 5 ;由硝普钠 (SNP)诱导的内皮非依赖性血管 Emax b FGF组 [(88± 7) % ]大于对照组 [(6 6± 5 ) % ],P <0 .0 5 ;血管成形后 4周对照组腔面积 [(0 .5 4± 0 .2 6 ) mm2 ]小于b FGF组 [(1.0 8± 0 .32 ) mm2 ],P <0 .0 5 ,比成形后即刻 [(1.2 0± 0 .2 8) mm2 ]狭窄 5 5 %。结论 :实验性髂动脉粥样硬化狭窄模型兔于血管成形后给予 b FGF,在促进内皮依赖性及非依赖性血管舒张功能恢复的同时 ,有预防成形血管近期再狭窄发生的作用     

重组腺相关病毒2型载体-血管内皮生长因子165改善小型猪慢性心肌缺血的研究

目的应用重组腺相关病毒2型载体(recombinant adenovirus-associated virus2,rAAV2)介导血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染,观察其促进小型猪慢性缺血心肌血管生成并改善心肌血流灌注和心功能的有效性。方法小型猪左冠状动脉回旋支(LCX)放置血管缩窄环,建立慢性心肌缺血模型。5周后行心电图、冠状动脉造影和心脏核磁共振成像检查确认LCX闭塞或相应心肌的缺血。动物随机分为实验组和对照组,每组8只,分别在心肌内直接注射rAAV2-VEGF165(1×1012virus genome)或磷酸盐缓冲液。治疗后3个月和6个月,观察心肌VEGF mRNA和蛋白的表达;6个月后,观察心肌毛细血管和小动脉密度,行冠状动脉造影进行LCX血流分级,应用心脏核磁共振成像观察心肌灌注及左心室功能。结果放置血管缩窄环后5周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞或LCX支配区域的心肌缺血。基因治疗后3个月,实验组心肌VEGF mRNA和蛋白表达显著高于对照组;6个月时,实验组VEGF表达水平较3个月时下降。基因治疗后6个月,VEGF组心肌毛细血管密度和小动脉密度[分别为(1404.06±250.48)/mm2和(167.81±36.29)/mm2]均高于对照组[分别为(976.88±344.79)/mm2和(116.56±34.48)/mm2](P<0.05);潘生丁负荷后心肌灌注成像显示VEGF组心肌灌注明显优于对照组(P<0.05),且较治疗前有改善(P<0.05);两组左心室功能在治疗前后均无明显变化。结论在小型猪慢性心肌缺血模型中,心肌内注射rAAV2-VEGF165后外源VEGF基因的表达至少可持续3个月;rAAV2-VEGF165能够促进缺血心肌毛细血管和小动脉生成并改善心肌灌注。     

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠肢体缺血的研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)介导的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)移植对血管新生的影响.比较单纯干细胞移植与联合基因治疗的疗效.方法 全骨髓培养法提取培养MSC;rAAV-VEGF165转染MSC中,酶联免疫吸附试验(ELISA)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达;以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型,40只大鼠随机分为4组,每组10只.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS);干细胞组移植等量MSC,转染术后7 d组和转染术后10 d组分别于结扎7 d和10 d后的缺血区移植转染VEGF基因的MSC,移植6周后做Ⅷ因子染色检测血管新生情况.结果成功培养出MSC,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.在转染rAAV-VEGF165后转染组1、3、5、7、9 d上清液中VEGF165分泌水平分别为(131.98±6.00)、(263.96±4.58)、(540.85±5.97)、(208.98±5.06)、(174.45±5.00)ng/L,明显高于未转染组的(68.72±1.99)、(76.47±4.98)、(89.86±1.99)、(84.93±8.97)、(68.71±5.98)ng/L[t值分别为14.14、51.16、79.28、27.56、26.07,(均P＜0.05)],且5 d时达到高峰,此后表达开始下降.琼脂糖凝胶电泳可见在579 bp处见到高亮度条带,证明rAAV-VEGF165成功转染进MSC细胞中.转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化.Ⅷ因子染色示转染术后10 d组动物缺血区毛细血管密度[(9.35±2.72)条/视野]明显高于对照组[(1.05±0.50)条/视野]和干细胞组[(3.10±1.43)条/视野](均P＜0.01),较转染术后7 d组[(6.95±1.69)条/视野]亦有一定程度的升高(P＜0.05).结论 MSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体,且联合应用效果高于单独移植MSC,移植最佳时间为术后10 d.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究

目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)移植对缺血心肌的血管生成作用。方法于2004年5月至2005年8月取第四军医大学西京医院分离、培养Wistar大鼠的MSCs,用真核表达载体pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染MSCs。45只近交系Wistar大鼠随机均分为转染组(MSCs/VEGF组)、对照组(MSCs组)、无血清培养基组(DMEM组),结扎前降支建立急性心肌梗死模型后在梗死区边缘区行5×106细胞移植,DMEM组行等量培养基注射。细胞移植前行CM-DiI标记。移植1个月后行心脏B超测量射血分数值,组织化学染色评价新生血管密度。结果培养的MSCs呈典型贴壁生长成纤维样外观,pcDNA3.1(-)/hVEGF165能有效转染大鼠MSCs,移植1个月后MSCs/VEGF组较其余各组左室射血分数(LVEF),再生血管密度明显增加,差异均有显著性(P<0.01)。结论VEGF基因转染MSCs移植能显著促进缺血心肌血管再生,进而改善心脏功能。     

血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建及其在心肌细胞中的表达

目的 :构建血管内皮细胞生长因子 （ VEGF1 65）真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,并通过转染心肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用 DNA重组方法 ,将编码 h VEGF1 65全长 c DNA克隆于真核表达载体 pc DNA3 .1（ -）中 ,构建 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒 pc D-NA3 .1（ -） /h VEGF1 65瞬时转染培养的大鼠心肌细胞中 ;采用 RT-PCR,ELISA,Western blot及免疫组化染色等方法检测 VEGF1 65基因在心肌细胞中的表达情况 ;应用 MTT法检测转染后细胞上清液中 VEGF1 65的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65转染心肌细胞后 ,VEGF m RNA及蛋白表达水平明显增高 ,转染后的心肌细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,其转染心肌细胞后可获得较高水平 VEGF蛋白的表达 ,所表达出 VEGF蛋白具有生物学活性     

Gamma-glutamylcysteine ethyl ester for myocardial protection in dogs during ischemia and reperfusion

Objectives. The aim of this study was to examine the infarct-limiting effects of gamma-glutamylcysteine ethyl ester, a newly discovered synthetic precursor of glutathione biosynthesis, in a canine model of myocardial infarction.Background. Reduced glutathione plays an important role in protecting cells against damage induced by reactive oxygen species during myocardial ischemia and reperfusion. Gamma-glutamylcysteine ethyl ester is capable of penetrating into cells in its intact form and increasing intracellular glutathione levels.Methods. Dogs were subjected to a 90-min coronary occlusion followed by 5 h of reperfusion. An intravenous bolus injection of gamma-glutamylcysteine ethyl ester (3 or 10 mg/kg body weight) was administered immediately before reperfusion. Regional myocardial blood flow was measured with the use of colored microspheres.Results. Gamma-glutamylcysteine ethyl ester effectively reduced infarct size in a dose-dependent manner (mean ± SEM 26.4 ± 3.5% in the low dose group [3 mg/kg, n = 10] and 19.0 ± 3.4% in the dose group [10 mg/kg, n = 10]; each p < 0.05 vs. the value in the control group [40.6 ± 4.8%, n = 10]). There were no differences between the control and treated groups in hemodynamic variables or regional myocardial blood flow either during the ischemic period or after reperfusion. The reduced glutathione content of ischemic myocardium in the control group (0.62 ± 0.11 μmol/g, p < 0.01) was significantly lower than that in nonischemic myocardium (1.46 ± 0.07 μmol/g), and it was preserved by treatment in a dose-dependent manner (3 mg/kg, 0.83 ± 0.06 μmol/g; 10 mg/kg, 0.92 ± 0.14 μmol/g; each p < 0.05 vs. control level). There were no differences in oxidized glutathione content between nonischemic and ischemic myocardium or among the three groups.Conclusions. Gamma-glutamylcysteine ethyl ester, a precursor of glutathione, significantly attenuates myocardial ischemia and reperfusion injury when administered immediately before reperfusion.     

人血管内皮生长因子裸质粒DNA心肌注射促进缺血心肌侧支循环形成的研究

目的 :观察人血管内皮生长因子 (h VEGF)裸质粒 DNA直接心肌注射对大鼠急性心肌缺血后侧支循环形成的影响。方法 :建立大鼠左冠状动脉结扎的急性心肌缺血模型 ,取缺血边缘区以先期构建的真核表达质粒 pc DNA3/ h VEGF1 6 5和真核载体 pc DNA3的 DNA分别多点心肌注射。给药后 4周先行大鼠冠状动脉造影 ,再取材分别行苏木精 -伊红染色、平滑肌肌动蛋白 (SMA)染色和 Northern Blot分析。结果 :给药后 4周冠状动脉造影示治疗组左室造影剂聚集较对照组明显增加 ;SMA染色示治疗组新生血管数目明显多于对照组 ;Northern Blot分析显示治疗组 VEGF m RNA表达较对照组明显增强。结论 :pc DNA3/ h V EGF1 6 5裸质粒 DNA心肌注射能转染心肌细胞并持续表达至少 4周 ,促进了缺血心肌血管新生和侧支循环形成     

VEGF_(165)和Angiopoietin-1 cDNA治疗缺血心肌的实验研究

目的探讨血管内皮生长因子165(VEGF_(165))和血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang1)基因导入对心肌缺血的治疗作用。方法分别构建编码VEGF_(165)和Ang1的真核表达载体。结扎SD大鼠冠状动脉前降支后1周,将缺血模型随机分为实验组(n=7)和对照组(n=7),在缺血区周围心肌内分别注射VEGF_(165)和Ang1的重组质粒和空质粒。1周后收取心脏,通过Langendorff心脏灌注模型实验,测定离体心脏的心功能。用免疫组织化学方法测定心肌注射区血管密度。结果正确构建了重组质粒pSecTag-VEGF和pSecTag-Ang1,并能在HEK293细胞中特异地表达出VEGF165和Ang1。同对照组相比,治疗后1周实验组左心室收缩压(LVSP)从(34.15±5.78)mmHg(1mmHg=0.133kPa)升高到(39.33±6.10)mmHg;左心室舒张末压(LVEDP)从(15.85±1.79)mmHg降低到(9.09±1.98)mmHg(P<0.05);左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)从(1413.52±417.73)mmHg/s升高到(1939.28±710.22)mmHg/s;左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)从(600.39±55.59)mmHg/s升高到(1030.53±401.22)mmHg/s(P<0.05);左心室做功(LVW)从(8213.88±303.68)mmHg/min升高到(15416.67±233.43)mmHg/min(P<0.05);冠状动脉流量(CF)从(3.2±0.31)mL/min升高到(4.09±0.80)mL/min(P<0.05),心肌注射区毛细血管数分别从(25±5)条/mm2增加到(46±8)条/mm2(P<0.05)。结论VEGF_(165)和Ang1基因导入能增强缺血心肌的血管新生和侧支循环的形成,改善心功能。     

Transfection of bone marrow mesenchymal stem cells using green fluorescence protein labeled hVEGF165 recombinant plasmid mediated by liposome

ObjectiveTo study the role of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in construction of vascularized engineered tissue.MethodshVEGF165 was amplified via RT-PCR before recombinant with pShuttle- green fluorescence protein;green fluorescent protein (GFP)-CMV. Then the recombinant shuttle plasmid was transfected into BMSCs with Lipofectamine^TM 2000 for packaging and amplifying. hVEGF165 mRNA expression in BMSCs cells was tested. Results: The sequence of hVEGF165 in pShuttle-GFP-hVEGF165 plasmid was confirmed by double-enzyme cleavage method and sequencing. hVEGF165 was highly expressed in BMSCs.ConclusionsThe GFP/hVEGF165 recombinant plasmid vector was constructed successfully and expressed effectively in host cells, which may be helpful for discussing the possibility of the application of VEGF165-BMSCs in tissue engineering and ischemic disease cure.     

重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在培养大鼠心肌细胞中的表达

目的探讨2型腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子165基因在离体心肌细胞中的表达及表达产物的生物活性。方法构建携带人血管内皮生长因子的2型腺相关病毒载体(rAAV-2/hVEGF165),感染大鼠原代心肌细胞,采用逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和酶联免疫吸附测定等方法检测心肌细胞人血管内皮生长因子165的表达,应用MTT法检测转染后细胞上清液中血管内皮生长因子165的生物学活性。结果逆转录聚合酶链反应检测结果发现感染的心肌细胞可表达人血管内皮生长因子165 mRNA;免疫印迹法检测结果表明感染的心肌细胞中有人血管内皮生长因子165,酶联免疫吸附测定法检测到血管内皮生长因子蛋白分泌水平为546.5±15.6pg/L,未转染组未检测到血管内皮生长因子蛋白的分泌;还发现感染的心肌细胞上清具有明显的促人内皮细胞增殖作用。结论2型腺相关病毒载体介导的人血管内皮生长因子165可有效转染大鼠心肌细胞,且表达产物具有促内皮细胞增殖作用。     

VEGF真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建血管内皮生长因子（vascu lar endothelial growth factor,VEGF）真核表达载体,并研究其在骨髓间充质干细胞（m esenchym al stem cells,MSCs）中的表达情况。方法运用DNA重组技术,构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,将载体转染大鼠MSCs,RT-PCR,ELISA及免疫细胞化学等方法检测VEGF在大鼠MSCs中的表达情况,MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF的生物活性。结果成功构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,其转染后的大鼠MSCs中VEGF表达水平明显增高,转染后细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论VEGF真核表达载体转染大鼠MSCs后能有效增加VEGF表达,并表现出较强的促内皮细胞增殖作用。