ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,以及探讨分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因的表达。方法:在构建融合蛋白之前,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROTV5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗肝癌ScFv基因5′端,其3′与人的肿瘤坏死因子TNFα基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFvTNFα基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人肝癌细胞命名为HCC/ScFvTNFα,以PCR,RTPCR以及Westernblotting对ScFvTNFα基因修饰的HCC9204细胞进行鉴定。结果:运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFvTNFαDNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用ANTHEPROTV5蛋白质分析软件分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。经酶切及PCR分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFvTNFα)SN,并获得高滴度产毒细胞株,以及Westernblotting分析证明ScFvTNFα基因融合蛋白的表达。结论:利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。     

sFv及重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的 :构建pEGFP sFv rhTNF α表达载体 ,观察其在成骨肉瘤细胞 990 1中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM T Easy测序后 ,以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv rhTNF α ,并将其亚克隆至pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体pEGFP sFv rhTNF α ,并在该载体转染人成骨肉瘤细胞 990 1后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实sFv rhTNF α融合基因片段已克隆到pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人成骨肉瘤细胞 990 1中观察到sFv rhTNF α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP sFv rhTNF α表达载体便于观察转染细胞中sFv rhTNF α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 ,为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

sFv及重组人IFN—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体，观察其在成骨肉瘤细胞9901中的瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增交经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv-rhIFN－α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，成功构建表达载体pEGFP-sFv-rhIFN－α，并在该载体转梁人成骨肉瘤细胞9901后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实sFv-rhIFN－α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转梁人成骨肉瘤细胞9901中观察到sFv-rhIFN－α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体便于观察转染细胞中sFv-rhIFN－α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

单链抗体及其融合蛋白在肿瘤诊治中的应用

单链抗体由于分子量小,免疫原性低,组织穿透力强,特异性好等优点,与单克隆抗体相比,在肿瘤的诊断和治疗方面展示了更好的应用前景.全文对近年来单链抗体及其融合蛋白在肿瘤导向诊断和治疗,肿瘤基因治疗和肿瘤疫苗方面应用研究进展做一综述.     

scFv-sTRAIL融合蛋白靶向诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展

随着分子生物学技术的进步和在分子水平上对恶性肿瘤发病机制认识的不断加深,以细胞受体、表面抗原、关键基因和细胞内调控分子为靶点的分子靶向治疗已成为辅助传统治疗的合理选择。抗体导向治疗是一种新颖的分子靶向治疗手段。目前已研发多种抗体导向类抗癌药物,这类药物由特异性识别肿瘤细胞的靶向部分和杀伤肿瘤的效应部分组成,因而具有较强的靶向杀伤肿瘤细胞作用,同时可有效降低药物对局部正常组织和全身的系统性毒性作用。利用基因工程技术将人类血清可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(serum-soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand,sTRAIL)与抗肿瘤单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)融合,构建scFv-sTRAIL融合蛋白,是一种理想的抗体导向治疗策略。通过scFv与肿瘤细胞所特有的细胞表面抗原的特异结合,加强sTRAIL在肿瘤病灶的富集,靶向诱导肿瘤细胞凋亡,从而获得增强抗体的疗效和更高的药物安全性。     

Snail/GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

引言上皮型钙粘附素(E-cadherin,E-cad)介导的粘附系统的破坏,是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤[1]。而锌指转录因子Snail,具有下调E-cad的作用[2],本研究通过制备Snail抗体,为进一步开展E-cad的功能研究和应用奠定了基础。1材料和方法1.1主要试剂和菌株主要试剂购自北京中山公司;大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。1.2 pGEX-4T-1/Snail原核表达载体的克隆从人血管内皮细胞提取总RNA,在逆转录酶作用下,合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板,用上游引物5′-CT-GCAGGACTCTAATCCAG-3′(含有EcoRI内切酶位点)和下游引物5′-ATCCTTGGCCTCAGAGAGC-3′(含有Sal I内切酶位点),进行PCR扩增,得到Snail C-末端377bp的DNA片断;酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后,用玻璃奶法(自制)纯化回收,与pGEX-4T-1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌,提取质粒并酶切鉴定重组体。1.3融合蛋白的诱导表达与纯化1.3.1表达鉴定表达质粒Snail/pGEX-4T-...     

基因工程抗体与IL-2融合蛋白研究的进展

利用基因重组技术构建抗肿瘤的小抗体／JL-2融合蛋白是肿瘤导向治疗中的一种新探索，这种策略治疗可增加肿瘤局部的IL-2浓度，减少其毒副作用．延长蛋白在体内的半衰期，更好地发挥IL-2介导的免疫细胞的抗肿瘤作用。本文就此融合蛋白的构建策略及表达、纯化的技术作一介绍。     

抗体细胞因子融合蛋白治疗肿瘤的研究进展

抗体细胞因子融合蛋白保持了抗体和细胞因子两者的功能，能在肿瘤微环境浓集并直接增大抗体的抗肿瘤效应和／或宿主的抗肿瘤免疫。综述了IgG融合IL—2、GM—CSF和IL—12融合蛋白的结构、生物学特性和用于治疗人类肿瘤的潜能。     

肿瘤基因工程抗体研究进展

综述单链抗体、抗体融合蛋白、抗独特型抗体、双特异性抗体的研究进展，显示它们在临床肿瘤治疗方面的良好应用前景。     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠GMCSF融合蛋白(6B11mGM)的构建、表达和特性研究

抗独特型抗体能够模拟肿瘤抗原,调节机体免疫功能,已成为肿瘤免疫治疗研究中一个十分重要的研究领域.本中心制备的卵巢癌抗独特型抗体6B11能模拟卵巢癌抗原诱导特异性抗肿瘤免疫应答.为降低鼠源性单抗进入体内引起的不良免疫反应,本中心已成功制备了基因工程抗独特型单链抗体(6B11ScFv).为了增加6B11ScFv的免疫原性,又构建了6B11ScFv与人GM-CSF融合蛋白(6B11GM).但由于缺     

Recombinant single-chain antibody fusion construct targeting human melanoma cells and containing tumor necrosis factor

Fusion constructs targeting tumor cells have significant potential applications against both solid tumors and hematologic malignancies. We developed a fusion construct of tumor necrosis factor (TNF) and a single-chain antibody (scFvMEL) recognizing the gp240 antigen on human melanoma cells. The scFvMEL/TNF construct, like TNF itself, was found to exist in solution primarily as a trimer of 45 kDa monomers (trimeric molecular weight = 135 kDa). The fusion construct bound specifically to gp240 antigen-positive but not to antigen-negative cells. The TNF component of the construct was biologically active (specific activity = 1 x 10(7) U/mg) compared with free TNF (specific activity = 2.6 x 10(7) U/mg) and was more cytotoxic to antigen-positive A375-M melanoma cells (IC(50) = 100 pM) than TNF alone (IC(50) = 1,000 pM) and, additionally, was active against AAB-527 melanoma cells (IC(50) = 20 nM) resistant to TNF itself (IC(50) > 1,000 nM). The augmented cytotoxicity was mediated by antibody-specific binding to the cell surface. Both A375-M and AAB-527 cells were shown to express TNFR1 and TNFR2 on the cell surface. The TNF moiety of the fusion construct was efficiently delivered into cells in time-dependent increase in cytosol as assessed by immunofluorescent staining of human melanoma cells. Radiolabeled scFvMEL/TNF localized effectively in human melanoma xenografts in nude (nu/nu) mice with a tumor:blood ratio of approximately 8 at 72 hr after administration. Our studies suggest that because of its unique biologic activity and low antigenic potential, scFvMEL/TNF makes an excellent cytotoxic protein for potential clinical treatment of human melanoma.     

AntiMRP3(scFv)-sTRAIL靶向诱导多形性成胶质细胞瘤的凋亡

目的:观察抗人类多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)的单链抗体与可溶性坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble TNF-related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)的融合蛋白antiMRP3(scFv)-sTRAIL对多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)U251细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法:MTT法检测不同浓度antiMRP3(scFv)-sTRAIL(3.9063～250 nmol/L)作用后U251细胞的存活率。给予亲代antiMRP3(scFv)或TRAIL活性中和抗体mAb 2E5预孵育,应用IC50剂量的antiMRP3(scFv)-sTRAIL作用U251细胞,流式细胞仪检测U251细胞的凋亡率,Western blotting检测U251细胞中caspase-3的激活及其关键底物DNA裂解因子(DNA fragmentation factor,DFF)的降解。结果:随着antiMRP3(scFv)-sTRAIL浓度的增加,U251细胞的存活率逐渐降低[(84.84±0.2)%～(19.93±1.8)%];IC50剂量(62.5 nmol/L)的antiMRP3(scFv)-sTRAIL单独或给予antiMRP3(scFv)、mAb 2E5预孵育后处理,致U251细胞的凋亡率分别为(58.0±1.3)%、(14.9±1.7)%和(17.4±3.0)%;antiMRP3(scFv)或mAb 2E5预孵育均可阻断U251细胞中antiMRP3(scFv)-sTRAIL诱导的caspase-3的激活及DFF的裂解。结论:AntiMRP3(scFv)-sTRAIL促进sTRAIL靶向识别并诱导GBM细胞凋亡,为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。     

P53 fusion protein expression in prokaryote and preparation of monoclonal antibody to P53

Objective: Conventional immunohistochemistry (IHC) is available to assess P⁵³ mutations, and expensive imported anti-P⁵³ monoclonal antibody has been used in China, it is necessary to study a new monoclonal antibody. Methods: The P⁵³ DNA fragment enconding N-terminal 180 amiao acide was obtained by PCR and was cloned into P^GEX-2T plasmid expressing glutathione S-transferase (GST). The P⁵³-GST fusion protein expressed by JM109 was used for immunizing BALB/C mice. We have raised one hybridoma strain secreting McAb to human P⁵³ (named M126). Results: The IHC analysis of 52 paraffin-embedded sections from human breast cancer with M126 and P_AB1801 (Zymed Co.) has showed that the positive immunoreactions were 25 cases (48%) and 22 cases (42.3%) respectively. The staining of M126 was stronger and preferable to P_AB1801. Conclusion: M126 can be instead of P_AB1801 for studying immunohistochemical analysis on P⁵³ protein.     

靶向性抗肿瘤融合蛋白EGF-E4orf4的表达及其细胞毒性的初步分析

背景与目的:人表皮生长因子(human epidermal growth factor,EGF)是受体起作用刺激细胞增殖和分化的重要生长因子。正常细胞的表面有,但很多肿瘤尤其是实体瘤细胞表面则有异常高水平的EGF受体的表毒早期区4第4编码蛋白,即腺病毒E4orf4蛋白(adenovirus early region ding frame 4 protein)可以特异地诱导肿瘤细胞发生不依赖p53表达的种新型的细胞毒因子。本研究旨在利用EGF的靶向性和E4orf4蛋白的,在分子水平设计合成一个融合蛋白,使其具有组成部分各自的生物学     

融合蛋白Kininogen D560-148 TRAIL114-281的表达及其抑制血管新生和诱导细胞凋亡的作用

目的:采用原核表达系统表达人Kininogen D560-148-TRAIL114-281融合蛋白,并对其生物学活性进行研究.方法:PCR技术扩增Kininogen D560-148和TRAIL114-281的编码序列,分别构建原核表达载体pMAL-Kininogen D560-148(pMAL-KD5)、pMAL-TRAIL114-281(pMAL-TRAIL)和pMAL-Kininogen D560-148-TRAIL114-281(pMAL-KT),重组质粒分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT,并经亲和层析纯化.MTT法检测细胞的增殖,管状形成实验检测内皮细胞血管形成,流式细胞仪和电镜检测细胞凋亡.结果:成功构建原核表达载体pMAL-KD5、pMAL-TRAIL和pMAL-KT,并获得纯化的融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT.融合蛋白MBP-KT与MBP-KD5、MBP-TRAIL相比可显著抑制内皮细胞ECV304和胰腺癌细胞SW 1990的增殖、明显抑制ECV304细胞体外管腔的形成,同时,MBP-KT剂量依赖性地诱导SW1990细胞凋亡.结论:融合蛋白Kininogen D560-148-TRAIL114-281既能诱导肿瘤细胞凋亡又能抑制血管生成,为进一步开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.     

多靶向VEGF-EGFR的Fc融合蛋白EVP1的构建及其结合特性【创新点评：一种富有潜力的多靶向抗体类肿瘤治疗药物】

目的:构建能同时靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的Fc融合蛋白EVP1,并分析其多靶向结合功能,为后续的抗肿瘤研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增Herin基因和Flt-1基因Ig样第二结构域(Flt-1D2)编码序列,全序列合成带有点突变的人IgG1的Fc段编码序列,利用重组PCR方法将Herin、Flt-1D2和Fc基因依次连接,构成Herin-Flt-1D2-Fc基因(命名为EVP1基因)。再将EVP1编码基因插入质粒pDC659,构建携带EVP1基因的腺病毒穿梭质粒pDC659-EVP1。将质粒pDC659-EVP1与腺病毒骨架载体pPE3-F35共转染至293细胞,包装获得表达EVP1融合蛋白的非增殖型腺病毒Ad5/35-EVP1,经PCR鉴定,扩增、纯化病毒,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用MOI=11的腺病毒Ad5/35-EVP1感染293细胞,4 d后收集细胞培养上清液。采用硫酸铵盐析法和Protein G亲和层析对融合蛋白EVP1进行纯化。Western blotting检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的含量。采用间接免疫荧光实验和Octet Red 96生物分子相互作用分析仪对融合蛋白EVP1的靶向结合特性进行定性和定量检测。结果:成功包装出腺病毒Ad5/35-EVP1,滴度为5.4×109PFU/ml。腺病毒Ad5/35-EVP1-293细胞系统能有效表达融合蛋白EVP1;MOI=11时,融合蛋白EVP1的表达量为(1 613.94±24.65)ng/ml。蛋白EVP1与高表达EGFR的A431细胞和高表达HER2的人卵巢癌SK-OV-3细胞有良好的结合能力,与抗原EGFR、HER2、VEGF结合的亲和力常数Kd分别为4.55、18.70和0.63 nmol/L。结论:成功制备多靶向融合蛋白EVP1,它能高效结合VEGF、EGFR受体家族成员,具有良好的抗肿瘤临床应用价值。     

Preparation of monoclonal antibody to P53 and its clinical application

Objective:The aim of this study was to prepare monoclonal antibody against P53, a kind of tumor suppressor protein,and use the antibody initial y in clinical immunoassay. Methods:Monoclonal antibody wa...