环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中MMP-9表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9;MMP-9)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,用3%环氧氯丙烷处理48h的去细胞支架材料作为实验组;用0.2%戊二醛处理48h的去细胞支架材料作为对照组。将培养的人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchy-mal stem cells;hBMSCs)种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valves;TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,免疫组化检测MMP-9表达的阳性率。结果hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-9的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-9表达,对防止组织工程心脏瓣膜钙化的形成有一定作用。     

环氧氯丙烷防止去细胞生物瓣膜钙化的初步研究

目的研究环氧氯丙烷对去细胞生物瓣膜钙化的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的去细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组,用3%环氧氯丙烷处理24h的去细胞猪主动脉瓣膜支架作为实验组。将培养的人骨髓基质干细胞（hBMSCs）种植于去细胞支架上,分别行Western blot及原位杂交方法测定人骨髓基质干细胞分泌基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）的功能。结果人骨髓基质干细胞在实验组去细胞瓣膜表面生长良好,MMP-2,9的表达比对照组降低,有统计学意义（P〈0.05）。结论环氧氯丙烷处理的去细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制人骨髓基质干细胞的MMP-2,9的表达,对防止去细胞猪主动脉瓣膜支架钙化的形成有一定作用。     

液氮冻融联合胰蛋白酶消化脱细胞法构建猪心脏瓣膜支架的研究

目的探讨液氮冻融联合胰蛋白酶消化脱细胞法构建猪心脏瓣膜支架的效果。方法将新鲜的猪心脏瓣膜剪成约1cm×1cm的小块,按随机数字表法分为实验组、对照组和未处理组,每组设5个重复标本。3组标本经液氮冻融后,实验组采用0.6%胰蛋白酶和5%十二烷基硫酸钠（SDS）各处理3d;对照组采用5%SDS处理6d;未处理组置于无菌0.9%氯化钠溶液中常温静置6d。通过HE染色和丽春红-苦味酸染色、残留DNA定量及α-Gal抗原检测确定脱细胞效率。将脱细胞的猪心脏瓣膜在大鼠皮下包埋2周,通过茜素红染色观察其抗钙化潜能。结果实验组的猪心脏瓣膜标本细胞成分基本去除,细胞外基质结构完整;残留DNA含量、α-Gal抗原分别为（55.6±16.8）滋g/g、0.02±0.01,明显低于对照组的（750.4±178.1）滋g/g、0.14±0.02（均P＜0.01）。大鼠皮下包埋2周后,实验组钙化结节明显少于对照组（P＜0.01）。结论应用液氮冻融联合胰蛋白酶消化构建的脱细胞猪心脏瓣膜基质可能是组织工程瓣膜的良好支架。     

骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的：探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)和脱细胞天然嚣唾支集体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性。方法：髂嵴穿刺抽取狗骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs．DMEM培养液体外培养扩增，免疫组化染色及流式细胞术分析鉴定分化细胞表型。采用去污剂和酶消化法制作脱细胞猪主动脉瓣膜支架，将BMSCs分化细胞接种于瓣膜支架上构建TEHV。分别行石蜡包埋切片H-E染色、免疫组化染色、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学结构并鉴定细胞类型。结果：BMSCs分化细胞呈梭形，α-SMA及Vimentin染色阳性，其α-SMA表达与血管壁肌成纤维细胞相近。异种瓣膜支架细胞去除完全，纤维支架结构保留完整。石蜡切片示：BMSCs在脱细胞支架上呈复层生长，α-SMA阳性。扫描电镜示TEHV表面光滑，细胞层完整．透射电镜示其细胞成分为有活性的分泌型细胞．呈梭形，复层生长。结论：BMSCs的自然分化细胞具有肌成纤维细胞的特性，种植于脱细胞瓣膜支架上构建TEHV简便可行。TEHV的在体改建尚需进一步研究。     

不同方法脱猪主动脉瓣细胞效果比较

目的:比较不同脱细胞方法处理猪主动脉瓣叶的效果,探讨组织工程心脏瓣膜生物支架的最佳制备方法.方法:取猪主动脉瓣膜,消毒后随机分组.Ⅰ组瓣叶不做处理,作为对照组.Ⅱ组Triton X-100、核酸酶(DNaseⅠ、RNase Ⅰ)处理.Ⅲ组采用低浓度胰蛋白酶、EDTA、核酸酶、DCA处理.Ⅳ组用DCA、核酸酶处理.对各组脱细胞瓣叶进行大体、光镜、电镜观察及理化检测.结果:Ⅳ组方法不可完全去除细胞成分,Ⅱ、Ⅲ组方法可完全去除细胞成分,但Ⅱ组瓣叶原有的超微结构有所改变.结论:低浓度胰蛋白酶、EDTA、核酸酶、DCA联合应用是理想的组织工程心脏瓣膜生物支架制备方法.     

转化生长因子-β1对体外构建组织工程瓣膜的实验研究

目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在组织工程心脏瓣膜(TEHV)体外构建中的作用。方法经胰酶/EDTA、去污剂Triton X-100和核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,然后在其表面种植大鼠肌成纤维细胞,构建TEHV。实验组培养基中添加TGF-β1(10ng/ml),对照组采用普通培养基。体外培养2周后取瓣叶,行HE染色和扫描电镜观察,并检测羟脯氨酸、DNA含量及瓣叶最大负荷力,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测瓣膜细胞MMP-13和TIMP-1mRNA的表达。结果HE染色和扫描电镜显示实验组较对照组的细胞联合紧密且细胞外基质更丰富,羟脯氨酸含量和DNA含量增高,最大负荷力提高,MMP-13mRNA和TIMP-1mRNA的表达增强。结论TGF-β1在TEHV体外构建过程中具有积极作用,能为种子细胞生长提供有利因素,促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高瓣膜的最大负荷力。     

经单宁酸处理脱细胞猪心脏瓣膜性能及形态学研究

目的：对比加单宁酸和传统的去氧胆酸钠法去除细胞后心脏瓣膜形态学及性能差别,为构建组织工程心脏瓣膜提供实验依据。方法：应用两种方法处理6～7月龄猪主动脉心脏瓣膜。光学显微镜、透射电镜观察脱细胞基质改变、DNA含量测定。结果：两种方法处理后,显微镜检和透射电镜见单宁酸-去氧胆酸钠法对基质破坏较少;两组均可以完全脱去瓣膜细胞。结论：经单宁酸处理能更好地保护去除瓣叶组织细胞外基质,提高其性能。     

血红素加氧酶-2基因敲除对Fe2+诱导的小鼠脑氧化应激损伤中基底节细胞的保护作用

目的:以人体骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,以去细胞猪主动脉瓣为支架,体外三维构建组织工程心脏瓣膜(TEHV).方法:以胸外科术中切除的肋骨为骨髓来源,采用1.073 g/ml的Percoll梯度分离液离心法获取BMSCs,体外培养扩增、鉴定;以0.05%胰酶 0.02?TA消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,将体外培养扩增的BMSCs种植于支架上,体外三维培养,应力环境下构建TEHV,观察TEHV细胞分泌的一氧化氮(NO)及内皮素(ET-1)水平、免疫组化特征及光镜和电镜下的结构.结果:人BMSCs为梭形,α-SMA及Vimentin染色阳性,CD-31及Ⅷ因子染色阴性,其分泌NO及ET-1分别为(104.1±5.9)μmol/L及(40.9±7.6)ng/L,明显较正常人血管内皮细胞低(P＜0.01);猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;应力条件下体外三维构建的TEHV上活细胞数较静态下构建明显增多(P＜0.01),H-E染色示人BMSCs在支架上生长良好,形成完整的细胞层,扫描电镜示瓣膜表面细胞层完整,细胞呈梭形生长.结论:人BMSCs作为种子细胞已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可作为一种有前途的种子细胞构建自体TEHV;体外三维应力条件下构建TEHV效果明显优于静态培养.     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

以改良方法制作软骨细胞外基质构建高质量组织工程软骨

目的：探讨应用改良方法制作的软骨细胞外基质（extracellular matrix,ECM）能否构建高质量组织工程软骨。方法：应用传统匀浆?脱细胞方法制作软骨ECM粉末,在此基础上通过物理研磨颗粒筛选获得细腻的软骨细胞外基质粉末（fine extracellular matrix,FECM）。将两种粉末通过冷冻干燥法制成ECM支架和FECM支架作为对照组和实验组。以软骨组织工程中成熟应用的聚乳酸聚羟基乙酸聚合物［poly（lactic?co?glycolic acid）,PLGA］支架为阳性对照组。取等量大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）种植于ECM支架和FECM支架,同时将BMSCs诱导分化为软骨细胞后种植于PLGA支架,然后将3种细胞?支架复合物移植入裸鼠皮下,28 d后取出样本并进行相关检测。结果：FECM支架孔径均一,结构规整,其构建的组织工程软骨在大小、色泽、糖胺多糖（sGAG）分泌以及胶原沉积等方面均远优于对照组构建的组织工程软骨,与阳性对照组无明显差异。结论：由改良方法制作的FECM支架在无外源性转化生长因子?β1（transforming growth factor?β1,TGF?β1）情况下可构建出高质量的组织工程软骨,具有潜在的临床应用价值。     

去细胞组织工程心脏瓣膜构建的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法:测定瓣叶去细胞前、后的生物力学性能;观察去细胞瓣叶上内皮细胞生长情况。结果:瓣叶去细胞可获得完整无细胞的纤维支架,瓣叶去细胞前、后的生物力学性能无差异;内皮细胞在去细胞瓣叶表面生长,形成一层基本连续的细胞层。结论:去细胞瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程瓣膜;内皮细胞种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

直接染色法观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长

为了快速观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长状况，采用去细胞猪主动脉瓣叶为支架，将新生牛主动脉内皮细胞种植于其上，第3、7天取瓣叶行H－E直接染色，并以常规切片H－E染色和扫描电镜作为对照。结果发现，该3种方法观察所见细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步。提示，瓣叶H－E直接染色可方便快捷地观察种植细胞的生长状况。     

体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine aortic valve scaffold，APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells，RBMSCs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理，去除猪主动脉瓣细胞成分，并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定；在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞，行形态学检查和免疫组化测定。结果光镜及电镜证实，猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除，获得完整无细胞的纤维网状支架；瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化；种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层。结论种植RBMSCs于ACPAV上，可体外构造组织工程人工心脏瓣膜。     

猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究

目的：初步探索猪主动脉组织工程瓣膜的制备方法。方法：经胰酶－EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣的细胞成分，测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性，并在其表面种植BAECs。结果：猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全被去除，获得完整无细胞的纤维网状支架，瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化，瓣膜近端存留的主动脉壁中的细胞一半被去除；种植的BAECs在去细胞瓣膜表面、主动脉内膜形成一连续的细胞层。结论：猪主动脉瓣膜去细胞后获得的纤维支架适宜血管内皮细胞的生长，可以用来构建组织工程瓣膜。     

猪脱细胞主动脉瓣叶不同方法预处理后种植内皮细胞的比较研究

目的:猪脱细胞主动脉瓣叶经不同的方法预处理后,种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs),观察细胞的增殖状态。方法:猪脱细胞主动脉瓣叶分别经纤维连接蛋白(Fn,50 μg/ml)预铺、胎牛血清(FCS)浸泡、无血清DMEM浸泡预处理12 h,采用间隔24 h、3次种植的方法种植 BAECs,于种植后第4天、第7天进行细胞计数,并行MTT法和~3H-TdR掺入量检测比较细胞的增殖状态。同时于第7天取瓣叶进行组织学检测,观察瓣叶表面内皮细胞覆盖情况。结果:种植后第4天和第7天,采用Fn预铺、FCS浸泡预处理的脱细胞瓣叶,其细胞计数、MTT的光密度和~3H-TdR掺入值明显高于无血清DMEM预处理组(P<0.01)。瓣叶经H-E染色,可见Fn预铺、FCS浸泡预处理组内皮细胞的覆盖情况优于无血清DMEM浸泡组。结论:Fn或FCS预处理能明显增加内皮细胞在脱细胞瓣叶表面的黏附和增殖,有利于组织工程心脏瓣膜的体外构建。     

改良去细胞方法对猪源性逆转录病毒的影响

目的观察改良的去细胞方法对猪主动脉瓣膜的猪源性逆转录病毒的影响。方法用0．1％胰酶消化猪主动脉瓣后,再用TritonX-100-DNA酶／RNA酶洗脱消化,结合溶液渗透压改变等去除细胞;取新鲜猪瓣、猪外周血标本和去细胞猪瓣各20只,降主动脉内移植去细胞猪瓣后的犬外周血10例,以PK15细胞系为对照,采用PCR和RT-PCR法检测猪源性逆转录病毒。结果经去细胞处理后猪瓣内的细胞成分完全去除,纤维支架和力学性能保持良好;新鲜猪瓣及猪外周血标本均检测到219bp的扩增条带,与Medline公布的猪源性逆转录病毒有90％～95％同源性;去细胞猪瓣及移植了去细胞猪瓣犬的外周血,均未测到该病毒。结论改良的去细胞方法可以去除猪心瓣膜的猪源性逆转录病毒,能够有效预防该病毒物种间的交叉感染。