细胞骨架蛋白基因转录与小分子促小鼠胚胎干细胞定向分化神经元样细胞的相关性

目的：探索细胞骨架蛋白基因转录是否涉及全反式维甲酸（RA）促胚胎干（ES）细胞早期定向分化神经元样细胞,以此构建快速评价药物对ES细胞定向分化神经元的促进或抑制作用。方法：采用悬滴培养法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体,进而贴壁向神经细胞分化。利用RT-PCR法评价神经元呈特征性表达的一类细胞骨架蛋白基因微管相关蛋白（Mtap2）、神经丝（Nefm）和微管蛋白（β-tubulin）转录水平,作为RA促ES细胞定向分化神经元指标,结合光镜和免疫荧光法鉴定神经细胞的形成,由此构建快速评价体系。并在此基础上进一步评价合成化合物库内6个小分子对细胞骨架蛋白基因转录的影响。结果：RA诱导ES细胞定向分化神经元过程,Mtap2和Nefm转录水平均呈上调趋势,其中以Mtap2为甚,增加了1.27倍,并与同期细胞表型改变相一致,但β-tubulin无明显变化。6个合成小分子均使Mtap2转录受到抑制,但Nefm转录水平有不同程度上调,1号和3号化合物尤甚,分别增加了1.4和1.2倍,该上调作用与同期细胞表型改变不尽一致。结论：RA诱导ES细胞定向分化神经元早期,Mtap2和Nefm转录水平均呈上调趋势,其中Mtap2的表达与否与早期细胞表型改变相一致。     

淫羊藿素诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞

目的:采用淫羊藿素(icaritin,ICT)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养微环境,论证ICT提高ES细胞体外定向分化为神经细胞的效应。方法:采用拟胚体培养法,评价ICT对ES细胞体外定向分化为神经细胞的诱导作用;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定神经细胞特异基因和蛋白表达谱。结果:ICT在10-7mol/L浓度时,对ES细胞定向分化为神经细胞表型呈现最佳诱导效应,在分化d8 8时,分化率高达80%(P<0.001),并呈良好的量效和时效关系。分化神经表型者表达神经元特异性微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)基因和神经胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因,同时伴有神经前体细胞特异性标志蛋白(nestin)及β-tubulin Ⅲ和GFAP特异性蛋白阳性表达。结论:应用拟胚体培养微环境调控法,ICT可诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,并与神经发育依赖性特异基因和蛋白表达呈正相关。     

微粒体Ⅱ相代谢酶基因在小鼠胚胎干细胞定向分化肝细胞中的表达

目的:评价微粒体Ⅱ相代谢酶基因在小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)定向分化肝细胞中的表达,为进一步探索酶蛋白表达及其催化活性提供依据。方法:ES细胞体外悬滴培养定向分化成肝细胞表型,RT-PCR法检测肝细胞发育依赖性基因AFP、ALB、CYP7a1的表达,免疫细胞化学法确认成熟肝细胞特异性标记物白蛋白(ALB)表达,RT-PCR法检测上述肝细胞中Ⅱ相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸结合酶系(UGTs)和微粒体谷胱甘肽S-转移酶1(mGST1)基因表达。结果:ES细胞在定向分化至d8时,肝细胞发育依赖性基因AFP和ALB有较高表达,d18时AFP表达甚微而ALB表达显著增加,并伴有成熟肝细胞特异性基因CYP7a1的表达。定向分化呈肝细胞表型时,成熟肝细胞特异性蛋白ALB呈强阳性表达。分化过程中Ⅱ相代谢酶基因UGT1a1、UGT1a9在分化前后均稳定表达;UGT1a6表达呈发育依赖性;UGT2b5未见表达;mGST1在分化前后均有少量表达,但在成熟肝细胞中表达显著增加,与成熟小鼠肝相似。结论:ES细胞体外悬滴培养可定向分化为成熟肝细胞;Ⅱ相代谢酶UGTs、mGST1基因在分化成熟肝细胞表达与小鼠肝细胞相似,可望为Ⅱ相代谢酶代谢深层次研究提供高效模型。     

大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇（2-ME）预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚（BHA）诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管联合蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、1-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞(NSC)的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化、鉴定。方法取出生1~3dSD大鼠全脑,分离、培养NSC并诱导分化了GABA能神经元,用免疫荧光染色进行鉴定。结果培养24h后,由单细胞发展成2~4细胞神经球,随时间延长球体增大,神经球均有Nestin阳性细胞;用含10%血清分化液分化1d后,神经球开始贴壁,伸出细长突起,部分可和周边神经球伸出的突起连接。神经球周边见大量散在贴壁的双极或多极细胞,免疫荧光染色可见NSE、GABA阳性细胞。加了分化液的实验组GABA阳性细胞分化率为(30·25±2·12)%,而对照组分化率为(1·14±1·39)%。结论成功从新生大鼠脑组织中分离、培养了NSC,并能较大比率分化GABA能神经元。     

人胚胎间充质干细胞向平滑肌细胞定向分化标志蛋白的选择

目的:选择平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)特异性标志蛋白,作为判断人胚胎间充质干细胞(mesenchymalstem cell,MSC)是否向SMC方向分化的指标.方法:采用免疫细胞化学、免疫荧光、Western印迹和RT-PCR等方法,检测SMC分化早、中、晚期标志蛋白smooth muscle(SM)-α-actin、calponin、SM-myosin heavy chain(SM-MHC)在人胚MSC中的表达情况.结果:各实验均证明SM-α-actin和calpomn蛋白在人胚MSC中表达.各种实验方法在人胚MSC中均检测不到SM-MHC蛋白及其mRNA的表达.结论:SM-MHC是一个有价值的SMC特异性标志物,可以做为判断人胚MSC向SMC方向分化与否的指标.     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的：探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法：贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离，扩增培养，待细胞融合，传代培养，检测细胞的生长曲线，表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果：克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上，表达CD13，CD29，CD59，不表达CD11，CD14，CD31、CD34，CD45，CD80，CD86，CD117，HLA－DR；传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论：该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞，并保持分化潜能，克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

Junctophilin 1在小鼠胚胎干细胞定向分化心肌细胞及大鼠胚胎心肌发生中的表征

目的:评价膜连接蛋白Junctophilin 1(JP1)亚型在哺乳动物心肌发生过程中,基因转录和蛋白表达特征,为心肌发育生物学及心脏再生医学相关生命现象本质提供实验依据。方法:小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞相继制成单细胞悬液和悬滴,收集拟胚体转至培养皿中悬浮分化培养。每隔2 d收集细胞供分子生物学评价,并于心肌分化成熟期(第17天),免疫荧光成像原位检测JP1与心肌小节蛋白α-Actinin和Troponin-T是否呈共表达,流式细胞术定量确认JP1阳染率。另以大鼠胎心为研究对象,大鼠受精后第14天起,每隔2 d取胎心直至分娩新生鼠,供RT-PCR和免疫印迹实验用。结果:ES细胞分化过程中,JP1在基因转录层面全程表达,至第11天达高峰。蛋白层面呈一过性表达,在第9天达高峰,此后迅速下降,至分化培养第15天消失,分化成熟期未见表达。大鼠胎心表达趋势与ES细胞分化过程基本一致,但JP1蛋白表达持续在出生后。在分化终端,流式细胞术显示JP2和肌小节蛋白双染率达16.59%,而未见JP1阳染细胞。结论:JP1基因在小鼠ES细胞定向分化心肌细胞全程均有转录,但JP1仅在分化早期有一过性表达。大鼠胎心JP1表达趋势与ES细胞分化过程基本相一致。     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

未分化胚胎细胞转录因子1与恶性肿瘤关系的研究现状

未分化胚胎细胞转录因子1(UTF1)是干细胞相关基因之一,是参与胚胎干细胞分化的重要转录因子,能促进干细胞的自我更新及分化,调控胚胎细胞和生殖细胞的增殖分化。目前,对UTF1的研究大多在干细胞和生殖细胞中,而关于UTF1与肿瘤关系的研究成果较少。越来越多的证据显示,干细胞相关基因的异常表达与肿瘤发生、转移、复发及耐药性等密切相关。其转录和表观遗传胚胎程序可以在癌细胞中重新激活,使癌细胞具有干细胞表型,并参与肿瘤的发生、发展。为获得更好的疗效,部分学者长期致力于寻找各种有效的肿瘤标志物,其中UTF1在恶性肿瘤的诊断、治疗及预后方面具有重要的潜在应用价值。     

Therapeutic potential of motor neurons differentiated from embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells

Degeneration of motor neurons (MN) caused by disease or injury leads to paralysis and is fatal in some conditions. To date, there are no effective treatments for MN disorders; therefore, cell therapy is a promising strategy to replace lost MN. Embryonic stem (ES) cells isolated from the inner cell mass of mammalian blastocysts self-renew and are pluripotent because they differentiate into cell types of the three germinal layers. Reprogramming of adult cells to a state similar to ES cells, termed induced pluripotent stem (iPS) cells, has been recently reported. It is well established that pluripotent cell types can give rise to specialized phenotypes, including neurons. Mouse, monkey and human MN can be differentiated from ES and iPS cells using procedures generally involving embryoid bodies formation and stimulation with retinoic acid and Sonic hedgehog. Differentiated MN express characteristic molecular markers such as Islet1, HB9 and Choline acetyltransferase, exhibit electrophysiological maturity and are able to form synaptic contacts similar to neuromuscular junctions in vitro. Furthermore, transplanted MN promote functional recovery in animal models of neurodegenerative diseases and MN injury. The potential clinical applications of stem cell-derived MN was enhanced after iPS cell derivation, which makes possible the generation of patient-specific pluripotent cells for autologous cell replacement therapies and may be used for drug development and disease modeling. This review summarizes MN differentiation protocols from ES and iPS cells in regard to neuronal differentiation efficiency, expression of MN markers and functional properties in vitro, as well as their therapeutic effects after grafting.     

ES细胞体外定向分化为睾丸间质样细胞模型的建立

目的:建立小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞体外分化为睾丸间质样细胞(leydig-like cells)的模型。方法:采用脂质体转染方法将含类固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF-1)基因片断的质粒转入小鼠ES-D3细胞,并在RA和8Br-cAMP作用下,体外诱导ES-D3细胞分化为睾丸间质样细胞,以空质粒转染组做阴性对照;通过光镜观察转染SF-1的ES-D3细胞定向分化为睾丸间质样细胞过程中的形态变化;用RT-PCR及Western Blot法检测分化过程中类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR),胆固醇侧链裂解酶P450scc(CYP11A1)和3β-羟甾脱氢酶1(3β-HSD1)表达情况;免疫荧光法检测睾丸间质样细胞特异性蛋白P450scc及3β-HSD1表达。结果:ES-D3细胞转染SF-1质粒24 h,即检测到SF-1基因表达。转染成功的ES-D3细胞在RA和8Br-cAMP诱导分化48 h后出现睾丸间质样细胞。分化而来的睾丸间质样细胞胞体大而圆润,长有触角,呈纺锤形;且表达睾丸间质样细胞特异性蛋白P450scc和3β-HSD1,同时StAR表达显著增加,而对照组细胞未表达睾丸间质样细胞特异性标志物StAR、P450scc和3β-HSD1。结论:通过对ES-D3细胞转染SF-1质粒并予以RA和8Br-cAMP诱导,成功建立ES-D3细胞定向分化为睾丸间质样细胞模型。     

脉冲电磁场诱导小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化

目的 观察脉冲电磁场对小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化的影响.方法 将小鼠4 d龄胚胎干细胞(embry-onic stem cells,ESCs)衍生的胚胎体单细胞按5×104ml-1接种到细胞培养板,在DMEM基础培养液中使胚胎体单细胞贴壁培养.于第14～21天时,分别给予脉冲电磁场、化学诱导剂以及联合刺激.采用茜素红染色、骨钙素免疫组织化学染色、成骨分化关键因子Osterix和Cbfa-1/Runx-2的相对定量RT-PCR检测等方法观测成骨分化情况.结果 茜素红染色和RT-PCR结果均显示:脉冲电磁场组、化学诱导组以及联合培养组的成骨诱导效果均比空白对照组显著增加,其中又以联合培养组成骨诱导效果最明显.骨钙素免疫组化染色也显示:联合培养组中骨钙素分泌最多.结论 脉冲电磁场可以促进小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化,而且脉冲电磁场和常规化学诱导剂联合应用会产生协同效应,其成骨诱导效果优于两者单独应用.     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES cell）体外培养可以分化成为外胚层组织,并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分化方法。     

胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响

目的探讨由胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）诱导的内皮细胞（endothelial cells,Ec）与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响。方法提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组。A组：胚胎干细胞诱导组;B组：胚胎干细胞诱导组;C组：胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞（Ec）诱导组;D组：ESCs和诱导的EC联合培养诱导组。通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响。结果通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义（p〉0.05）,骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组（p〈0.05）。结论以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用。     

Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro

Objective To investigate an method for hepatic differentiation from embryonic stem cells (ES cells) in vitro and the resulting differentiation ratio, in order to develop a procedure for producing a new type of hepatocyte for hepatocyte replacement therapy in the treament of liver failure.Methods ES cells from Balb/C mice were cultured and maintained in an undifferentiated state in gelatin-coated dishes using Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 1000 U/ml leukemia inhibitory factor (LIF). Then, LIF was withdrawn from the DMEM to allow the ES cells to develop into embryonic bodies (EBs). EBs were plated onto tissue culture dishes, and growth factors such as acidicfibroblast growth factor (aFGF) and hepatocyte growth factor (HGF) were added to the medium to promote directional differentiation. The course of development and differentiation was observed dynamically using an inversion microscope. The expression of hepatic proteins, such as α-fetoprotein (AFP), albumin (ALB), cytokeratin 8 (CK8), cytokeratin 18 (CK18), in cytoplasm was analyzed by immunocytochemistry (ICC). The concentration of ALB in the medium was determined dynamically by radioimmunoassay (RIA). Results ES cells replicated as clones, without differentiating, in DMEM containing LIF. They developed into EBs in medium without LIF. Our ICC assay showed that differentiating cells did not express hepatic proteins, such as AFP, ALB, CK8, and CK18 until day 7, day 9, day 11, and day 11, respectively (up to 2 days later when growth factors are not present). The concentration of AFP in the medium was first detected on day 8, at a concentration of 3.4 ng/ml, and increased to 22.8 ng/ml by day 15. The concentration of ALB in the medium was 0.2 μg/ml on day 11, and increased to 2.2 μg/ml by day 15. ALB-positive cells under ICC manifest morphological structures were consistent with normal mouse hepatocytes. The differentiation ratio of hepatocytes in the ES cell differentiation system was 30％ on day 15 (significantly lower without the presence of growth factors).Conclusions ES cells can differentiate into mature hepatocytes. Growth factors, such as aFGF and HGF, can enhance this differentiation and produce sufficient numbers of functional hepatocytes. This method may be a reliable new way of differentiating ES cells into hepatocytes for use in replacement therapy in the treament of liver failure.     

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为软骨样细胞的初步研究

目的全反式维生素A酸(RA)联合转化生长因子-β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-2(BMP2)等多种因子定向诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)分化,探索这几种细胞因子对ESC的成软骨定向诱导分化作用.方法小鼠ESC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养扩增,在1 ×10.mol/L全反式RA条件下制备拟胚体(EB),贴壁后联合应用TGF-β1及BMP2诱导分化,经形态学、免疫细胞化学和RT-PCR检测细胞性质.结果 ESC在悬浮培养下,经RA初步诱导后给予TGF-β1及BMP2等因子继续诱导,贴壁后EB周边可爬出多角形分化细胞,诱导分化细胞和EB表达Ⅱ型胶原和软骨发生早期特异性转录因子Scleraxis.结论在RA预诱导EB分化后,TGF-β1和BMP2等因子可定向诱导小鼠ESC表达软骨特异性相关基因和蛋白,为胚胎干细胞成为软骨组织工程种子细胞提供了可能.     

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为软骨样细胞的初步研究

目的 全反式维生素A酸(RA)联合转化生长因子-β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-2(BMP2)等多种因子定向诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)分化,探索这几种细胞因子对ESC的成软骨定向诱导分化作用。方法 小鼠ESC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养扩增,在1×109mol/L全反式RA条件下制备拟胚体(EB),贴壁后联合应用TGF-β1及BMP2诱导分化,经形态学、免疫细胞化学和RT-PCR检测细胞性质。结果 ESC在悬浮培养下,经RA初步诱导后给予TGF-β1及BMP2等因子继续诱导,贴壁后EB周边可爬出多角形分化细胞,诱导分化细胞和EB表达Ⅱ型胶原和软骨发生早期特异性转录因子Scleraxis。结论 在RA预诱导EB分化后,TGF-β1和BMP2等因子可定向诱导小鼠ESC表达软骨特异性相关基因和蛋白,为胚胎干细胞成为软骨组织工程种子细胞提供了可能。