上调PTEN蛋白表达对大肠癌细胞周期与细胞凋亡的影响

目的探讨PTEN蛋白过表达对大肠癌细胞周期与细胞凋亡的影响。方法构建PTEN真核表达质粒pc-DNA3.1-PTEN,稳定转染大肠癌LoVo细胞。Western blot鉴定转染效果,采用PI标记法进行细胞周期实验,Annexin V-FITC标记法进行细胞凋亡实验。结果 Western blot结果显示,稳定转染表达质粒可显著增强PTEN蛋白的表达(P<0.05)。与阴性组及转染空白载体的实验组相比,细胞周期实验显示,PTEN表达增加使大肠癌细胞出现明显的G1期阻滞,S期细胞数量减少(P<0.05)。细胞凋亡实验显示,PTEN表达增加可使大肠癌细胞对5-FU诱导凋亡的敏感性增加(P<0.05)。结论上调PTEN蛋白表达可引起大肠癌LoVo细胞周期阻滞,凋亡增加,PTEN可能成为大肠癌基因治疗的新靶点。     

肿瘤抑制因子PTEN与心肌肥大关系的研究

目的 观察肿瘤抑制因子PTEN在心肌肥厚大鼠心肌组织以及在血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞中的表达,探讨PTEN在心肌肥大发生发展中的作用以及相关机制。方法采用腹主动脉狭窄术制备压力超负荷心肌肥厚动物模型,及血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大模型,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法、Western blot及免疫组化等方法,分别检测各组PTEN mRNA和蛋白表达的变化,以及PTEN蛋白在心肌细胞中的定位。结果(1)与对照组相比,心肌肥厚组大鼠左室肌PTEN mRNA和蛋白表达均明显减少;血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大组PTEN蛋白表达明显减少。(2)与心肌肥厚组相比,卡托普利组大鼠左室心肌PTEN mRNA和蛋白表达增加,接近对照组。(3)免疫组化实验结果显示心肌细胞胞核内有阳性免疫产物生成,提示PTEN蛋白定位于心肌细胞核内。结论PTEN在心肌肥大发生发展中可能起负调控作用,该作用与肾素-血管紧张素系统密切相关。     

米托蒽醌和多西紫杉醇联合用药对乳腺癌治疗的影响

目的探讨米托蒽醌与多西紫杉醇联合对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法建立人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤生长情况,计算抑瘤率,免疫组化法检测组织中增殖细胞核抗原（PCNA）和Ki67的表达,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）的表达。结果在米托蒽醌与多西紫杉醇共同处理条件下MCF-7细胞成瘤实验的抑瘤率明显上升。用药后,PCNA和Ki67蛋白阳性率降低,PTEN蛋白表达上升。结论米托蒽醌联合多西紫杉醇可能通过改变细胞凋亡相关基因的表达,进而对抑制或逆转乳腺癌的发展起到有一定的作用。     

罗格列酮和二甲双胍治疗对胰岛素抵抗KKAy糖尿病小鼠肝及横纹肌组织PTEN蛋白表达的影响

目的观察罗格列酮和二甲双胍治疗后胰岛素抵抗KKAy糖尿病小鼠肝及横纹肌组织PTEN蛋白表达的变化。方法 KKAy小鼠制备糖尿病模型后随机分为未治疗组、罗格列酮治疗组及二甲双胍治疗组。C57BL小鼠普通饲料喂养,为对照组。4周后处死小鼠,Western blot检测肝及横纹肌PTEN蛋白、胰岛素刺激后磷酸化473Akt的表达并进行定量分析。结果罗格列酮及二甲双胍处理后KKAy糖尿病小鼠肝及横纹肌组织磷酸Akt升高倍数与KKAy糖尿病小鼠相比均无明显变化(P0.05),罗格列酮和二甲双胍处理后肝及骨骼肌PTEN蛋白表达与糖尿病未治疗组相比差异没有统计学意义(P0.05)。结论罗格列酮和二甲双胍不会影响PI3k-Akt通路活性及PTEN蛋白的表达,两者改善血糖和胰岛素抵抗可能与胰岛素敏感组织PTEN蛋白的表达无关。     

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的 检测真核表达克隆pcDNA3.1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)的水平和有效性.方法 采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段,构建到T载体中,并转接到pcDNA3.1中;同时设计引物进行全基因测序;采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因,通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3.1-NMNAT1的表达水平和表达有效性,并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法.结果 成功钓取了小鼠源NMNAT1基因,测序结果显示与数据库序列完全匹配,pcDNA3.1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系,48 h以后收取细胞,经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测,结果显示表达克隆pCDNA3.1-NMNAT1能同时在mRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因.结论 成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA,与Pubmed序列完全一致,并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质.     

X射线照射后鼻咽癌细胞株DNA修复基因MGMT表达的变化

目的 探讨X射线照射后鼻咽癌CNE细胞株对DNA损伤的修复机制.方法 利用免疫细胞化学和蛋白免疫印迹（Western blot）方法,检测X射线照射后CNE细胞株MGMT表达情况.结果 Western blot显示,与照射前比较,照射后MGMT表达强度呈增强趋势.结论 X射线照射可能诱导CNE细胞株MGMT基因的表达,参与细胞照射后DNA损伤修复过程.     

小鼠甲胎蛋白基因的克隆表达鉴定及稳定表达甲胎蛋白的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因并进行表达鉴定,构建小鼠AFP真核表达载体并建立稳定表达甲胎蛋白的小鼠肿瘤细胞株．方法:从HePal-6细胞中提取总RNA进行 RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于 pcDNA3．1中构建真核表达载体pmAFP,进行酶切、测序和表达鉴定,pmAFP稳定转染 EL-4细胞建立EL-4(mAFP)细胞株,RT-PCR 检测EL-4(mAFP)细胞mAFP mRNA的表达,Western blot检测mAFP蛋白表达,将EL- 4(mAFP)N胞种植于6只小鼠背部皮下观察成瘤情况．结果:RT-PCR成功克隆出小鼠AFP基因,酶切、测序和表达鉴定证实真核表达载体 pmAFP构建成功,RT-PCR及Western blot检测证实EL-4(mAFP)细胞中有mAFP mRNA及蛋白的表达,5只小鼠背部皮下种植处有肿瘤形成,22 d肿瘤体积为2 279．97±235．13 mm3．结论:小鼠mAFP基因克隆成功,真核表达载体构建成功,建立的EL-4(mAFP)细胞株能有效表达小鼠甲胎蛋白,在小鼠体内成瘤性良好．     

Mdm2、PTEN、p53基因和L型感染在小鼠肿瘤中的表达及相关性研究

目的探讨金黄色葡萄球菌（金葡菌）L型感染C57小鼠致瘤后．Mdm2癌基因及PTEN、P^53抑癌基因在小鼠肿瘤中的表达及相关性研究。方法动物实验观察金葡菌L型感染90只C57小鼠后10只小鼠发生肿瘤；13只小鼠引起癌前病交。革兰染色、免疫组化及原位杂交检测小鼠肿瘤和癌前病变中金葡菌L型检出率和Mdm2、PTEN、P^53蛋白及cDNA基因的表达。结果10只小鼠肿瘤及13只小鼠癌前病变中金葡菌L型及其eDNA基因阳性表达与正常对照组有明显差异（P〈0．005—0．05）；Mdm2、P^53蛋白和cDNA基因的阳性表达与正常对照组有明显差异（P〈O．05），呈正相关。PTEN蛋白和cDNA基因的阳性表达小鼠肿瘤及癌前病变与正常肝组织对照有显著性差异（P〈O．01—0．05），呈负相关。结论金葡菌L型感染可能与Mdm2、PTEN、p^53基因协同表达，在小鼠肿瘤发生和发展中起重要作用。     

miR-205对黑色素瘤A375细胞增殖、黏附和迁移的影响及机制探讨

目的探讨miR-205对人皮肤恶性黑色素瘤细胞系A375增殖、黏附和迁移的影响及其可能机制。方法将miR-205 mimics用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染A375细胞,CCK-8法测细胞增殖变化;细胞黏附实验和划痕实验检测细胞黏附和迁移能力变化。Western blot检测PTEN、总AKT和磷酸化AKT蛋白表达变化。结果上调miR-205表达后实验组的细胞增殖、黏附和迁移能力均比空白对照组和阴性对照组减低(P均<0.05);Western blot结果显示上调miR-205表达能增加PTEN蛋白表达,减低磷酸化AKT蛋白水平,但对非AKT蛋白表达无影响。结论 miR-205可能通过调控PTEN/AKT通路抑制黑色素瘤细胞的增殖、黏附和迁移能力。     

SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选、安全性和免疫原性研究

目的 利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法 参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pSTKE中,构建pSTKE-RBDEP。将pSTKE-RBDEPI与天坛株痘苗病毒VTT共转染鼠肾细胞BHK-21中,通过同源重组,并以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,通过多次绿色荧光噬斑筛选获得重组病毒rVTT△TK-RBDEPI。利用RT-PCR和Western blot检测rVTT△TK-RBDEPI目的基因的转录和目的蛋白的表达情况;通过ELISA和ELISPOT检测rVTT△TK-RBDEPI免疫小鼠SARS-CoV-2与痘苗病毒载体特异性抗体水平和特异性淋巴细胞IL-4与IFN-γ的表达情况,确定rVTT△TK-RBDEPI的免疫原性。结果 经过10次绿色荧光噬斑筛选、RT-PCR与Western blot鉴定获得1株能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTT△TK-RBDEPI,且rVTT△...     

幽门螺杆菌hpaA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

摘要 目的 在乳酸菌中表达幽门螺杆菌(HP)hpaA基因,口服免疫小鼠后检测其免疫原性。方法 PCR方法从基因组中扩增基因hpaA,将其克隆至表达载体pNICE:sec,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的hpaA蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。将雌性ICR(CV级)小鼠随机分为4组,分别用PBS、携带空质粒的乳酸菌、携带pNICE:sec-hpaA的乳酸菌、灭活的HP灌胃。免疫7次后检测其特异性IgG和IgA的产生。结果 扩增hpaA基因并构建了重组原核表达质粒pNICE:sec-hpaA,转化乳酸菌NZ9000后经nisin诱导可表达Mr分子量约29KD的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的9.3%,Western blot分析其能与幽门螺杆菌抗血清特异性反应,具有良好的免疫原性。携带pNICE:sec-hpaA质粒的乳酸菌刺激产生的IgG水平明显高于携带空质粒组,与灭活HP组没有明显的差异,但其刺激产生的IgA水平明显高于其它组（P<0.05）。结论 表达hpaA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,能够刺激小鼠产生特异的IgG和IgA,可作为幽门螺杆菌口服疫苗候选抗原。为乳酸菌作为抗原递送载体的研究和HP口服疫苗的开发提供一定的实验基础。     

胃癌细胞PTEN基因启动子区甲基化与蛋白表达的关系及意义

目的探讨胃癌细胞中抑癌基因PTEN5’启动子区CpG岛甲基化状态与其蛋白表达的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法检测不同分化程度的胃癌细胞（HGC-27，MGC-803，BGC-823，SGC-7901）中PTEN基因启动子区域甲基化状态。并通过Western blot法检测该4种细胞中PTEN蛋白的表达。结果除SGC-7901外，其他三种胃癌细胞PTEN基因都有不同程度的甲基化，并随着胃癌细胞分化程度的降低。PTEN启动子区甲基化逐渐增强（P〈0．01）；PTEN蛋白表达逐渐减弱（P〈0．01）。PTEN蛋白表达与其启动子区高甲基化之间呈负相关。结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因失活，使其蛋白表达减少甚至缺失，这可能是导致胃癌发生、发展的重要机制之一。     

抑癌基因PTEN与胃癌细胞分化及侵袭力的机制研究

采用Boyden小室法测定三种不同分化胃癌细胞(SGC-7901、BGC-823、MGC-803、HGC-27)的体外侵袭力、运动力,RT-PCR检测胃癌细胞的PTEN mRNA表达水平,Western blot法检测胃癌细胞FAK、P-FAK蛋白表达水平.发现随着细胞分化程度的升高,PTEN mRNA表达明显增多,P-FAK蛋白表达明显减少,细胞侵袭力和运动力亦明显减弱(P＜0.01或P＜0.05),FAK蛋白表达无明显变化.认为PTEN mRNA、P-FAK蛋白表达水平在评价胃癌细胞体外运动侵袭力方面具有重要价值;PTEN基因可能通过FAK蛋白途径影响胃癌的侵袭转移.     

PTEN基因的沉默对骨髓间充质干细胞体外生物学特性和体内移植治疗心肌梗死的影响

目的:研究PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学性状的影响,并观察其在心肌梗死区域的存活和增殖情况.为干细胞移植治疗心肌梗死提供更优良的种子细胞.方法:通过脂质体法将PTEN基因特异的siRNA转染入骨髓间充质干细胞.RT-PCR法和Western blot法检测PTEN基因RNAi前后的mRNA和蛋白表达的变化.体外实验采用MTT法描绘细胞生长曲线,流式细胞仪(PI单染法)检测细胞周期,制备细胞缺血缺氧模型,流式细胞仪(Annexin V和PI双染法)检测各组细胞对缺血缺氧的耐受情况.体内实验通过制备动物心肌梗死模型,移植骨髓间充质干细胞,采用荧光显微镜观察细胞的存活和增殖情况.结果:RNAI组的PTEN基因的mRNA和蛋白表达均明显下降,PTEN基因被明显抑制.体外实验:MTT法显示RNAI组的细胞生长活力明显增强.RNAI组的细胞周期向右偏移.RNAI组对缺血缺氧的耐受能力明显增强.体内实验:荧光显微镜显示RNAI组移植的骨髓间充质干细胞在心肌梗死区域的数量明显增多.结论:PTEN基因的沉默能有效地促进骨髓间充质干细胞的增殖,使细胞周期向右偏移,同时能抑制细胞凋亡,增强细胞对缺血缺氧的耐受能力.体内实验也证实,PTEN基因的沉默后的骨髓间充质干细胞更容易在心肌梗死区域存活和增殖,为干细胞移植治疗心肌梗死提供新的思路.     

结肠特异性基因RELMβ的克隆及其真核表达载体构建

目的:观察克隆小鼠结肠特异性基因RELMβ,并构建其真核表达载体.方法:采用Western blot、Northern blot方法检测RELMβ基因在小鼠不同脏器中的表达;从小鼠结肠组织中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增RELMβ全长cDNA,克隆至T载体后进行核酸序列分析,并将其正向插入到真核表达载体pcDNA3.1/Zeo( )的限制性内切酶位点EcoR I:重组子在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下瞬时转染小鼠胚胎纤维母细胞NIH/3T3、结肠癌细胞系CT26,Western blot及RT-PCR法检测细胞RELMβ表达水平.结果:RELMβmRNA和蛋白特异表达于小鼠结肠,而其他脏器未见表达.成功克隆了小鼠RELMβ全长cDNA(318 bp),与已报道序列的同源性高达99%,获得GenBank登录号DQ157777.真核表达载体pcDNA3.1-RELMβ转染细胞后,细胞内RELMβmRNA和蛋白水平均显著增高(P<0.01).结论:从小鼠结肠组织中克隆出RELMβ特异性表达基因,为深入研究RELMβ基因的生物学作用及其在结肠疾病靶向治疗中的作用奠定了基础.     

PTEN基因对MKN45胃癌细胞系p-AKT和p-ERK表达的影响

目的探讨PTEN基因对MKN45胃癌细胞增殖及磷酸化的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)和磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-ERK)表达的影响,分析可能的作用机制。方法体外培养胃癌细胞株MKN45,通过质粒转染技术建立过表达PTEN的稳定细胞株MKN45/PTEN,空载体细胞株作为阴性对照组,未转染细胞为正常对照组。应用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PTEN的转染效果,MTT法检测细胞的增殖率,蛋白质印迹法(Western blot)检测p-AKT和p-ERK蛋白水平的表达变化。结果 PTEN在MKN45/PTEN细胞中表达量明显高于阴性对照组和正常对照组(P0.05)。PTEN在72 h和96 h明显抑制MKN45细胞的增殖,细胞增长缓慢,与阴性对照组和正常对照组的差异有统计学意义(P0.05)。MKN45/PTEN组p-AKT和p-ERK的相对表达量显著低于阴性对照组及正常对照组(P0.05)。结论 PTEN对胃癌细胞的体外增殖有抑制作用,可能通过p-AKT和p-ERK发挥作用。     

树舌多糖GF对小鼠HepA癌细胞PTEN蛋白表达的影响

目的探明树舌多糖（GAPS）GF对小鼠HepA癌细胞PTEN蛋白表达的影响。方法昆明种小鼠随机分肿瘤组和树舌多糖组。接种后各组肌肉注射给药，分别给予生理盐水和树舌多糖GF。连续10d，于末次给药24h，处死小鼠，剥离肿瘤组织。Dot blot技术检测各组样品PTEN蛋白的表达量。结果肿瘤组检测结果为阴性，树舌多糖组检测结果为阳性。结论树舌多糖GF抗肿瘤的作用靶点之一可能为抑癌基因PTEN。     

JAK/STAT1信号转导途径在MRL/lpr狼疮鼠不同器官中的活化研究

目的探讨Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录激活子1(STAT1)信号转导途径在MRL/lpr狼疮鼠肾脏、肺脏、脑等不同器官中的活化和作用。方法实验组是12周龄以上已经发病的MRL/lpr雌性小鼠．对照组是未发病的同龄MRL/lpr雌性小鼠。采用免疫组织化学方法研究肾脏中磷酸化STAT1的组织分布情况。采用Western blot方法研究STAT1磷酸化蛋白表达,采用SYBR greenⅠre- M-time定量聚合酶链反应(PCR)研究SOCS-1 mRNA的表达；并与肺脏、脑相对比。结果MRL/lpr狼疮鼠STAT1磷酸化蛋白在各器官均明显活化。肾脏和肺脏的STAT1磷酸化蛋白活化较脑组织明显；肾脏、肺脏和脑组织的SOCS-1基因的表达均升高．但肾脏的SOCS-1基因表达升高程度低于肺脏和脑组织。结论JAK/STAT1信号转导途径的异常可能参与和促进了系统性红斑狼疮(SLE)各器官病理损害的发生；狼疮肾炎的病理损害还可能与SOCS-1的负反馈调节作用降低有关。     

MERS-CoV E蛋白诱导293T细胞自噬的研究

目的本研究旨在探讨中东呼吸综合征冠状病毒包膜蛋白(MERS-CoV E蛋白)诱导293T细胞自噬其及作用机制。方法构建表达载体pEGFP-E、pEGFP-ERT、pEGFP-ORF5-E,分别将其转染293T细胞,采用荧光显微镜和Western blot方法检测目的蛋白的表达,采用Western blot方法检测LC3的表达量,采用Real-time PCR(RT-PCR)和Western blot方法检测自噬相关基因Atg4,Atg5,Atg7,P62,PI3KC3的表达情况。结果成功构建pEGFP-E、pEGFP-ERT、pEGFP-ORF5-E表达载体,在293T细胞中可检测到目的蛋白的表达。转染后24 h,与阴性对照组相比,pEGFP-E实验组LC3 II的表达量显著高于转染pEGFP-N1阴性对照组(P0.05),但转染pEGFP-E的实验组自噬相关基因(P62、PI3KC3、Atg4、Atg5、Atg7)的mRNA水平以及相应蛋白的表达量与阴性对照组相比,差异无统计学意义(均P0.05),这表明在293T细胞中过表达MERS-CoV E蛋白能增加LC3 II的表达,但并不引起自噬相关基因转录和相应蛋白表达水平的变化。结论 MERS-CoV E蛋白可诱导293T细胞自噬,其机制不依赖于Atg蛋白。     

pEGFP-C3-hNIS重组质粒的构建及其在人胃癌BGC-823细胞的表达

目的构建人钠碘转运体（hNIS）基因真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并研究重组hNIS基因在人胃癌BGC-823细胞中的表达情况。方法采用Trizol一步法从甲状腺手术患者的甲状腺组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到hNIS的可编码区基因,并克隆到T载体上,测序后亚克隆到真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3的多克隆位点,获得重组真核表达载体pEGFP-C3-hNIS。分别将pEGFP-C3-hNIS重组质粒（实验组）和pEGFP-C3（对照组）瞬时转染至人胃癌BGC-823细胞中,转染48 h后,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达情况,并通过Western blot方法检测hNIS基因的蛋白表达水平。结果序列分析证实克隆片段与GenBank公布的hNIS基因序列（序列号：NM-000453）相似性达99.90%。转染48 h后,实验组与对照组细胞均可观察到较强绿色荧光信号,用hNIS基因特异性抗体检测表明实验组hNIS表达水平明显高于对照组。结论成功构建hNIS真核绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C3-hNIS,并能在人胃癌BGC-823细胞中高表达。