survivin反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究

目的研究survivin反义寡核苷酸(ASODN)对胆囊癌细胞凋亡的诱导作用。方法采用脂质体介导survivinASODN转染人胆囊癌细胞株GBC SD,采用流式细胞仪技术检查细胞凋亡变化,采用电镜技术观察细胞的形态变化,采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测survivin基因表达的变化。结果脂质体介导转染survivinASODN后,胆囊癌细胞内survivinmRNA表达相对系数为0.512±0.011,明显低于未转染者的0.980±0.012(P<0.01),平均下调了47.83%(P<0.01),凋亡细胞比率为(26.28±3.91)%,明显高于未转染者的(0.50±0.23)%,P<0.01,电镜下可见胆囊癌细胞呈典型凋亡样改变。结论survivinASODN转染后能下调survivin的表达,可有效诱导GBC SD细胞凋亡。     

p33ING1b真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建pCDNA3/p33ING1b真核表达质粒并探讨其对肝癌细胞SMMU7721生长的抑制作用.方法将p33ING1b cDNA正反义亚克隆至pCDNA3真核表达载体上,并经磷酸钙共沉淀法分别转染至SMMU7721细胞中.转染后48h,用0.8g/LG418筛选出阳性克隆,检测转染后细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率的变化及应用流式细胞仪分析细胞凋亡率的改变.结果重组pCDNA3/p33ING1b正反义表达质粒构建成功.经正义p33ING1b质粒转染的SMMU7721细胞生长速度减慢,快速增长期比对照组推迟2d,软琼脂克隆形成率为(69.0±12.0)‰,较转染空载体(90.0±10.5)‰及反义表达质粒(149.0±15.0)‰的SMMU7721细胞减少,细胞凋亡率(22.53%)亦比空载体组(8.95%)及反义组(7.75%)上升.结论重组pCDNA3/p33ING1b质粒能在SMMU7721细胞内表达,且能抑制SMMU7721细胞的生长并促进其凋亡.     

survivin基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡与细胞周期的调控作用

目的研究survivin基因反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期、细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法采用脂质体介导survivin基因反义寡核苷酸转染人肝癌SMMC-7721细胞,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,RT-PCR方法检测cyclin B1 mRNA的表达。结果survivin反义寡核苷酸转染后细胞内cyclin B1表达由0.36±0.03增加至0.91±0.03,同时G2-M期细胞及凋亡细胞比例分别由5.81%及0.7%明显增加至42.11%及31.35%,同时细胞超微结构呈典型凋亡样改变。结论survivin基因反义寡核苷酸转染细胞后可以通过诱导cyclinB1的表达,导致G2-M期阻滞,从而诱导细胞凋亡的发生。survivin基因反义寡核苷酸转染可以作为治疗肝癌的重要新方法。     

Survivin反义寡核苷酸对肝门部胆管癌细胞株FRH-0201作用的研究

目的 探讨survivin反义寡核苷酸抑制survivin基因表达对肝门部胆管癌细胞FRH-0201的作用.方法 脂质体介导survivin ASODN转染肝门部胆管癌细胞FRH-0201;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;RT-PCR、Western印迹法检测survivin mRNA及蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 survivin反义寡核昔酸作用后肝门部胆管癌细胞FRH-0201 survivinmRNA及蛋白表达水平较未转染组显著下降(mRNA:0.51±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05;蛋白:1.82±0.16 vs 3.08±0.27,P<0.05),细胞出现凋亡形态学变化.细胞凋亡率增高(11.50±1.49%vs 0.39±0.08%,P<0.05).结论 survivin反义寡核苷酸能有效下调survivin基因表达,诱导肝门部胆管癌细胞凋亡.     

内皮抑素转基因治疗裸鼠人肝癌的实验研究

目的构建表达人内皮抑素的重组真核表达载体,研究阳离子脂质体介导转染内皮抑素基因对裸鼠人肝癌生长的抑制作用。方法将含有IL-2信号肽和人内皮抑素基因全长cDNA插入真核表达载体pcDNA3.0产生重组质粒pCD-sEndo,脂质体Dosper介导将pCD-sEndo质粒转染至人肝癌细胞株SMMC-7721,RT-PCR和Western blot检测内皮抑素的表达。建立裸鼠人肝癌模型,按随机数字表法随机分成4组,分别瘤内注射Dosper+pCD-sEndo(Dosper+pCD-sEndo组)、Dosper+pcDNA3.0(Dosper+pcDNA3.0组)、Dosper(Dosper组)和生理盐水(生理盐水组),分时段测量肿瘤的体积;注射结束后1周处死动物,切取肿瘤,免疫组化检测肿瘤组织微血管密度(MVD),TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡指数(AI)。结果成功构建携带人内皮抑素基因和IL-2信号肽的真核表达质粒pCD-sEndo并经酶切鉴定证实;体外转染内皮抑素基因的SMMC-7721细胞,RT-PCR可以检测到内皮抑素mRNA表达,Western blot显示转染细胞培养液中有内皮抑素蛋白表达,而转染空白质粒者中没有;体内实验中,Dosper+pCD-sEndo组裸鼠肿瘤生长受抑,于第12 d起明显小于Dosper+pcDNA3.0组、Dosper组和生理盐水组(P<0.05)。Dosper+pCD-sEndo组平均MVD为6.2±2.5,明显低于生理盐水组(32.8±6.4)、Dosper组(27.8±6.4)和Dosper+pcDNA3.0组(25.5±5.5),P<0.05;Dosper+pCD-sEndo组肿瘤细胞平均AI为24.5±7.3,生理盐水组、Dosper组和Dosper+pcDNA3.0组分别是7.6±2.5、9.5±3.0和11.2±3.6,前者明显高于后三者(P<0.05)。结论瘤内注射携带内皮抑素基因的阳离子脂质体,可减少裸鼠体内种植性人肝癌的微血管数目,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长。     

RNA干扰抑制PC-3细胞survivin基因表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的:研究RNA干扰抑制人前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡的效果。方法:设计、构建针对survivin基因的RNAi表达载体,分别以质粒A、B组,阴性序列组和空白对照E组用脂质体法转染PC-3细胞,应用RT-PCR及Western印迹、流式细胞术检测其对survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡的效果。结果:各组细胞survivin蛋白的表达强度分别为(18.94±0.63)%、(16.35±0.23)%、(46.41±0.76)%、(46.20±1.47)%。各组细胞中survivin mRNA的表达强度分别为(27.94±1.43)%、(24.51±1.37)%、(49.46±0.71)%、(48.49±1.32)%。各组细胞凋亡率分别为(12.80±1.33)%、(16.48±1.00)%、(3.03±0.62)%、(2.96±0.41)%。统计学表明构建的两种阳性表达载体均有效抑制了survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡。结论:RNAi可有效抑制PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达,并诱导细胞凋亡。     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

DNA甲基转移酶1、3b基因共下调对人胆管癌细胞生长的抑制效应

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞QBC-939生长的影响。初步探讨DNMT1、DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将两者联合转入人胆管癌细胞QBC-939,Western blot检测转染前后相应蛋白的表达变化,噻唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化,裸鼠皮下种植细胞观察成瘤大小。结果(1)Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低；(2)联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,其中以前者为甚；(3)联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G_1期,使细胞凋亡率从(1．63±0．27)%分别增加到(18．47±1．46)%和(6．19±0．78)％；(4)联合转染反义DNMTl、DNMT3b基因和单独转染反义DNMTl能使裸鼠皮下种植成瘤体积减小。生长延缓,前者效果更为明显；(5)在上述效应检测中,联合转染空质粒和单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论(1)通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,可同时下调DNMT1和DNMT3b在QBC-939细胞中的表达,并能在体内外抑制胆管癌细胞的生长,促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DN—MT1反义基因。(2)在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,两者可能通过甲基化途径与胆管癌的发生有关。     

冬凌草甲素和survivin反义核苷酸对前列腺癌细胞作用的研究

目的探讨冬凌草甲素联合survivin反义核苷酸(反义链)对前列腺癌PC-3细胞株增殖和凋亡以及survivin m RNA和蛋白的影响。方法常规培养PC-3细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测survivin反义链联合冬凌草甲素对PC-3细胞增殖的影响;流式细胞仪(FCM)检测PC-3细胞凋亡率;以Calcu Syn药效学软件计算联合指数(CI)评价survivin反义链联合凌草甲素对PC-3细胞的联合效应,并通过荧光定量PCR和Western blot方法检测PC-3细胞survivin基因和蛋白表达变化。结果 survivin反义链转染PC-3细胞后,可以显著抑制PC-3细胞增殖,且能诱导PC-3细胞凋亡;冬凌草甲素联合survivin反义链对PC-3细胞增殖抑制率较两者单用组明显增强,显示出协同效应(Fa0.8);冬凌草甲素和survivin反义链联用对PC-3细胞凋亡诱导作用更为显著(P0.01);荧光定量PCR及Western blot显示反义链和冬凌草甲素均使survivin m RNA和蛋白表达下降,两者联合使survivin m RNA和蛋白表达下降更明显(P0.01)。结论 survivin基因反义链和冬凌草甲素均能明显抑制PC-3增殖、诱导细胞凋亡和下调survivin基因和蛋白表达;两者联合作用有协同效应。     

生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞的抑制作用

目的研究生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞系HS746T的抑制作用。方法应用SurvivinASODN转染胃癌细胞,设空白、脂质体和正义链对照组,100、200和400nmol/L反义链组。电镜下观察细胞超微结构,流质细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Westernblot法检测转染后2～48h细胞凋亡指数(AI),生长抑制率(IR),SurvivinmRNA和蛋白表达的变化。结果转染后反义链组均能够下调SurvivinmRNA含量和蛋白表达,凋亡细胞增多。转染后24h100、200和400nmol/L反义链组AI为14.8%、19.4%及53.8%;IR(%)为45.98±2.99、50.96±3.38、72.79±2.48,反义链组高于其他对照组。结论Survivin反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞增殖。     

组织因子对结直肠癌细胞肺转移作用的研究

目的 探讨组织因子表达对结直肠癌细胞血行转移能力的影响。方法 利用构建有正义／反义组织因子cDNA（TFcDNA）的真核表达载体pcDNA3.1／Zeo，以脂质体法转染LOVO细胞，采用Western印迹分析检测转染成功LOVO细胞的组织因子蛋白表达水平。18只裸鼠（Babl／cnu／nu）随机分成3组，分别将转染了正义／反义TFcDNA的LOVO细胞及未转染的LOVO细胞通过尾静脉接种至裸鼠体内。8周后观察裸鼠发生肺转移的数目，以肺转移的数目反映LOVO细胞的转移能力。结果 转染了正义TFcDNA的LOVO细胞的组织因子表达水平及肺转移数目较未转染的LOVO细胞升高（P〈0.05，P〈0.01）；转染了反义TFcDNA的LOVO细胞的组织因子表达水平及肺转移数目较未转染的LOVO细胞相比则降低（P〈0.05，P〈0.01）。结论 组织因子可以增加人类结直肠癌细胞的体内血行转移能力。     

乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响

目的观察乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆（pcDNA-X/QSG7701）及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆（pcDNA3.0/QSG7701）。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701（P〈0.05）。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞（P〈0.05）。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO／5-Fu多药耐药的研究

目的：探讨短发夹RNA（shRNA）沉默多药耐药MDR）基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白（P-gp）的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果：与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为（2.304±0.232）μmol/L,且差异有统计学意义（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为（5.767±0.694）%（P〈0.05）;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）。结论：靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。     

组织因子对大肠癌细胞侵袭及血行转移的影响

目的分析组织因子（TF）表达对人类大肠癌细胞侵袭和血行转移能力的影响。方法利用构建有正义／反义组织因子cDNA（TFcDNA）的质粒pcDNA3．1／Zeo,以脂质体法转染人类大肠癌细胞HT-29细胞及LoVo细胞;转染成功的HT-29细胞及LoVo细胞采用Western Blot检测TF表达水平,通过裸鼠皮下成瘤观察细胞体内侵袭能力的变化;通过建立裸鼠体内肺转移及肝转移模型观察细胞体内血行转移能力的变化。结果转染了正义TFcDNA的HT-29细胞及LoVo细胞的TF表达水平较未转染的HT-29细胞及LoVo细胞升高,转染了反义TFcDNA的HT-29细胞及LoVo细胞的TF表达水平则降低;转染了正义TFcDNA的HT-29细胞的体内侵袭能力较未转染的HT-29细胞增强,转染了反义TFcDNA的HT-29细胞的体内侵袭能力则减弱;转染了正义TFcDNA的LoVo细胞的体内血行转移能力较未转染的LoVo细胞增强,转染了反义TFcDNA的LoVo细胞的体内血行转移能力能力则减弱。结论TF可以促进人类大肠癌细胞的侵袭和血行转移的能力。     

pcDNA3.0-CBP真核表达质粒的构建及对肺腺癌SPC-A1细胞的影响

目的 观察外源性CBP基因稳定转染对人肺腺癌SPC-A1细胞体外生长的影响.方法 构建CBP真核表达质粒pcDNA 3.0-CBP,应用pcDNA 3.0-CBP和空载体质粒pcDNA3.0(-),脂质体转染法转染体外培养的人肺腺癌细胞株SPC-A1,G418(800mg/L)筛选出抗性克隆.Western blot检测转染前后CBP蛋白水平变化,噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长抑制作用,Transwell体外侵袭实验和Wound-healing实验对细胞进行侵袭和迁移能力研究.结果 转染CBP基因的细胞株有目的 基因整合和相应蛋白高表达.MTT检测pcDNA 3.0-CBP转染组活细胞吸光度(0.2787±0.0786)低于未转染组(0.5089±0.1301)和pcDNA 3.0(-)空载体转染组(0.4804±0.1547).pcDNA 3.0-CBP转染组与两对照组吸光度的差异有统计学意义(P<0.01).细胞侵袭实验表明pcDNA 3.0-CBP转染组穿透滤膜数(3.52±0.77)明显少于未转染组(8.17±0.86)和空载体转染组(8.22±1.30),转染组与两对照组侵袭力的差异有统计学意义(P<0.01).细胞迁移实验转染组细胞迁移数(71.30±7.68)明显少于未转染组(119.40±8.38)和空载体转染组(111.41±12.56),转染组与两对照组迁移力的差异有统计学意义(P<0.01).结论 外源性CBP基因稳定转染可抑制人肺腺癌SPC-A1细胞的恶性表型,可能通过对Src家族激酶(SFKs)的负反馈调节抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭.     

RNAi载体抑制survivin基因在胰腺癌PANC-1细胞中的表达

目的:观察survivin特异性RNAi载体对胰腺癌PANC-1细胞中survivin mRNA和蛋白的表达的抑制作用。方法:将U6启动子驱动的survivin特异性RNAi质粒载体和阴性对照质粒分别转染PANC-1细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测survivin mRNA和蛋白的表达。结果:转染survivin特异性RNAi载体24 h和48 h后,PANC-1细胞survivin mRNA表达抑制率分别为(52.67±3.51)%和(75.33±3.06)%,蛋白表达抑制率分别为(58.00±3.61)%和(76.67±4.73)%;与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:以U6为启动子的survivin的RNAi载体,能有效地抑制胰腺癌细胞株PANC-1中survivin的表达。