MTS1真核表达载体的构建和鉴定

多肿瘤抑制基因(MTS1)表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物,使Rb蛋白磷酸化受阻,细胞不能由G1期进入S期,进而抑制细胞分裂增殖.为进一步开展消化道肿瘤防治研究,我们构建了MTS1真核表达载体,现报告如下.     

IL-37b基因克隆及其真核的表达载体构建

目的 克隆IL-37b编码区基因,并构建其真核表达载体.方法 通过RT-PCR扩增IL-37b编码区基因,DNA测序鉴定后,将阳性克隆提取质粒,通过酶切连接将目的片段定向克隆至真核表达载体pcDNA 3.1,通过菌落PCR和DNA测序等进行鉴定.结果 凝胶电泳显示RT-PCR扩增出1条大小约650 bp特异条带,DNA测序结果显示获取了大小为654 bp的IL-37b编码区基因.PCR和DNA测序对所构建的真核表达载体鉴定结果表明IL-37b编码区基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1.结论 成功克隆了IL-37b编码区基因,并成功构建其真核表达载体,为下一步IL-37b生物学作用的深入研究奠定了基础.     

人BRCA1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人BRCA1基因真核表达载体,为BRCA1基因高表达乳腺癌细胞株的研究奠定基础.方法 从胎盘中提取总RNA,设计引物,RT-PCR方法克隆BRCA1基因,以羧基端插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体中.通过DNA序列测定,菌液提取质粒,酶切鉴定插入基因片段的正确性.提取无内毒素质粒pcDNA3.1-BRCA1并转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定高表达BRCA1细胞株.提取细胞总蛋白,Western blot方法鉴定BRCA1的表达.结果 从人胎盘组织中成功克隆出BRCA1基因N端933个碱基.测序及提取质粒酶切鉴定证实pcDNA3.1-BRCA1中含有插入方向、片段大小和DNA序列均正确BRCA1基因N端933个碱基序列.转染后细胞株中BRCA1表达水平明显高于转染前,P＜0.01.结论 成功构建了人BRCA1基因的真核表达载体.获得稳定高表达BRCA1的MDA-MB-231细胞株.     

BTBD10基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

目的构建BTBD10重组真核表达载体,观察BTBD10在HEK293细胞中的定位。方法利用PCR方法扩增BTBD10全长,经HindIII和BamHI酶切后连接入pGFP-C3真核表达载体,构建pGFP—C3-BTBD10重组表达质粒,转染HEK293细胞,利用激光共聚焦显微镜观察BTBD10在细胞中的定位。结果经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框。激光共聚焦显微镜观察到空质粒pGFP—C3转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pGFP-C3-BTBD10重组载体后,可见绿色荧光分布于HEK293细胞膜一侧的细胞浆中,提示BTBD10定位于细胞浆中。结论成功构建人BTBD10真核表达载体,BTBD10定位于哺乳细胞的细胞浆中,可能发挥蛋白之间的相互作用。     

人白细胞介素-10真核表达载体的构建及其在兔滑膜细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素-10(hIL-10)高效真核表达载体,观察其在家兔滑膜细胞(RSCs)中表达.方法 提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA作为模板,根据基因库(NM 000572)中hIL-10全长开放读框设计特异性引物,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法扩增hIL-10 mRNA全长开放读框,扩增产物定向克隆人真核表达载体pcDNA4/HisMaxA,并对克隆人真核表达载体的扩增产物进行酶切及DNA测序鉴定,构建的真核表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10经阳离子脂质体介导转染兔滑膜细胞RSCs.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后12、24、48、72 h和7、14 d RSCs培养上清中hIL-10水平.结果 RT-PCR产物约0.54 kb,克隆人真核表达载体pcDNA4/HisMaxA的扩增产物经酶切及DNA测序鉴定与读码框架序列无差别.转染后12 h到第7天细胞培养上清检测出hIL-10,且水平显著性高于对照组(F=21.878,P＜0.01).结论 hIL-10真核高效表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10构建成功.     

人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达

目的构建高效表达球状脂联蛋白的真核表达载体，为研究脂联素、球状脂联蛋白在2型糖尿病及动脉粥样硬化中的作用奠定基础。方法克隆人脂联素基因，构建球状脂联蛋白基因的真核表达载体，转染人脐静脉内皮细胞株（HUVEC），Western blot检测上清中球状脂联蛋白的表达。结果测序结果表明克隆的人脂联素基因序列正确;构建的球状脂联蛋白基因真核表达载体能有效转染HUVEC，并在上清中检测到该基因的表达。结论完成人脂联素基因克隆，成功构建了人球状脂联蛋白基因真核表达载体，并在HUVEC中获得分泌表达，为研究球状脂联蛋白对2型糖尿病的干预作用提供了可能。     

P21真核表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖的影响

目的:构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法:采用基因定点诱变技术获得核定位信号突变型P21基因.采用DNA重组技术,将突变型P21基因亚克隆至pDsRed1-C1真核表达质粒中,重组为pDsRed1-C1-P21NLS-.酶切鉴定及DNA测序,脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-P21NLS-的表达,荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位,台盼蓝拒染法检测质粒转染HepG2细胞生长曲线.结果:成功克隆了核定位信号野生型及突变型P21基因,成功构建TpDsRed1-C1-P21WT及pDsRed1-C1-P21NLS-重组质粒,酶切片段分别为4.7和0.5 kb,酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸序列数据库比对表明,核定位序列中共9个核苷酸发生变异,由CGAAAACGG突变为GCGGCCGCG,测序成功.高效表达的红色融合蛋白,野生型主要定位于细胞核:而突变型主要定位于细胞质.野生型P21抑制HepG2细胞的生长;突变型促进HepG2细胞的生长,二者差异具有统计学意义(P<0.01).结论:P21的亚细胞定位,对HepG2细胞增殖影响具有明显差异.胞核P21抑制肿瘤生长,而胞质P21促进肿瘤生长.     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

Jagged1真核表达质粒构建及其对VSMC增殖凋亡的影响

目的:构建大鼠Jagged1真核表达质粒,探讨Jagged1对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响。方法:大鼠Jag-ged1真核表达质粒重组构建及鉴定:XbaⅠ酶切含全长大鼠Jagged1基因的质粒pBOS-SN3T,获得目的基因片段,胶回收后定向连接至线性化的真核表达载体质粒pCMV-IRES-GFP中,得重组质粒,命名为p-Jagged1。组织块法培养大鼠主动     

人色素上皮源性因子基因真核表达载体的构建及在大鼠眼内的表达

目的构建人色素上皮源性因子(PEDF)基因真核表达载体,并观察其在大鼠眼内的表达。方法将PEDF基因克隆到真核表达载体PcDNA3.0中,采用阳离子脂质体包裹pcPEDF,注射到SD大鼠玻璃体腔内。结果测序鉴定、酶切及琼脂糖电泳分析pcPEDF中含有PEDF基因,用免疫组化方法检测证实PEDF在大鼠视网膜神经细胞中表达。结论成功的构建了含有人PEDF基因的真核表达载体,并能持续、稳定地在大鼠视网膜神经细胞中表达。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响.方法 采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响.结果结果 GCRG213正向和反向克隆正确插人真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率.结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素.     

染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的构建人染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒。方法以通过全基因合成的FHIT cDNA为模版,用PCR技术扩增,扩增片段用BamHI/Xho I双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,用DNA测序法鉴定重组质粒。结果质粒DNA测序显示与文献报道的人FHIT cDNA序列一致。结论成功构建出含人FHIT基因的真核表达质粒。     

血管内皮生长因子真核表达载体的构建及其在培养鼠心肌细胞中的表达

目的　构建血管内皮生长因子 (VEGF1 6 5)真核表达载体 ,并检测其在鼠心肌细胞中的表达。方法　应用DNA重组方法 ,将编码hVEGF1 6 5全长cDNA克隆于真核表达载体pCR3中 ,构建pCR3.hVEGF1 6 5真核表达载体 ,使用脂质体包裹的方法将真核表达载体pCR3.hVEGF1 6 5转染至培养鼠心肌细胞中 ,采用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、Southernblot、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定法检测VEGF1 6 5基因在心肌细胞中的表达和分泌。结果　将构建好的真核表达载体pCR3.hVEGF1 6 5转染心肌细胞后 ,VEGFmRNA及蛋白水平明显增高。结论　成功构建了真核表达载体pCR3.hVEGF1 6 5,其转染心肌细胞后能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体。方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达。结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB,furB基因可以在COS-7细胞中表达。     

HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。     

血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建及其在心肌细胞中的表达

目的 :构建血管内皮细胞生长因子 （ VEGF1 65）真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,并通过转染心肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用 DNA重组方法 ,将编码 h VEGF1 65全长 c DNA克隆于真核表达载体 pc DNA3 .1（ -）中 ,构建 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒 pc D-NA3 .1（ -） /h VEGF1 65瞬时转染培养的大鼠心肌细胞中 ;采用 RT-PCR,ELISA,Western blot及免疫组化染色等方法检测 VEGF1 65基因在心肌细胞中的表达情况 ;应用 MTT法检测转染后细胞上清液中 VEGF1 65的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65转染心肌细胞后 ,VEGF m RNA及蛋白表达水平明显增高 ,转染后的心肌细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒 pc DNA3 .1（ -） /h VEGF1 65,其转染心肌细胞后可获得较高水平 VEGF蛋白的表达 ,所表达出 VEGF蛋白具有生物学活性     

人Ⅱ型大麻受体真核表达体系构建及其在 HEK293细胞中的表达

目的：构建人Ⅱ型大麻受体（ hCB2）基因GV230真核表达质粒,并检测hCB2基因在HEK293细胞中的表达。方法利用人脑皮质细胞的总RNA为模板,RT-PCR获得cDNA,通过酶切、连接及测序鉴定正确后,再将目的片段插入真核表达载体GV230,构建重组表达质粒GV230-hCB2,阳性克隆用脂质体瞬时转染HEK293细胞。激光共聚焦扫描显微镜和Western blotting法检测hCB2基因表达产物在细胞的表达情况。结果扩增出hCB2基因片段,成功构建了重组表达质粒,并检测到目的蛋白在转染细胞中表达,观察到hCB2受体在胞膜分布和表达。结论成功构建GV230-hCB2质粒,该质粒在HEK293细胞中能表达hCB2蛋白,此为进一步研究hCB2生物学功能奠定了实验基础。