重组模型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST—TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽－S－转移酶（GST）的融合基因表达载体。方法：用RT－PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结: 重组模型TNF的GST融合表达及纯化优化,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

膜结合型肿瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染

目的 :研究膜结合型肿瘤坏死因子α(TNFα)在基因转染中的特点及其在肿瘤基因治疗中的作用等特性。方法 :用反转录病毒为载体 ,将含有突变的膜结合型TNFα的质粒 ,用lipofectin法转入包装细胞株crip细胞。又用收集到的病毒上清感染人乳腺癌细胞MDA2 31,采用G418筛选 ,DNA印迹法和聚合酶链反应方法鉴定该基因转染的结果。结果 :经上述方法鉴定表明该外源基因已成功转染人乳腺癌细胞中 ,为进一步研究膜结合型TNFα的功能奠定了基础。结论 :经初步研究表明 ,含有膜结合型肿瘤坏死因子的质粒可以通过lipofectin法成功导入crip细胞 ,且该病毒可成功感染人乳腺癌细胞并整合     

膜结合型瘤坏死因子在人乳腺癌细胞中的转染

目的：研究膜结合型肿瘤坏死因子α（TNFα）在基因转染中的特点及其在肿瘤基因治疗中的作用等特性。方法：用反转录病毒为载体,将含有突变的膜结合型TNFα的质粒,用lipofectin法转入包装细胞株crip细胞。又用收集到的病毒上清感染人乳腺癌细胞MDA231,采用G418筛选,DNA印迹法和聚合酶链反应方法鉴定该基因转染的结果。结果：经上述方法鉴定表明该外源基因已成功转染人乳腺癌细胞中,为进一步研究膜结合型TNFα的功能奠定了基础。结论：经初步研究表明,含有膜结合型肿瘤坏死因子的质粒可以通过lipofectin法成功导入crip细胞,且该病毒可成功感染人乳腺癌细胞并整合。     

人基因重组肿瘤坏死因子单克隆抗体的研制

肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor,TNF)是由激活的巨噬-单核细胞所产生的一种细胞毒因子,在介导内毒索的生物学作用(肿瘤坏死活性,内毒素休克等)中起着关键的作用。制备成TNF的单克隆抗体(McAb),有助于从细胞-分子水平了解TNF的作用机理,并提供一种内毒素休克的有效防治手段。 实验以人基因重组肿瘤坏死因子(rHu-TNF-α,由日本Tejkyo大学Soma教授赠送,比活性5.4×10~7U/mg蛋白质)常规免疫BALB/c纯系小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/1骨髓瘤细胞在pEG作用下进行     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因的构建及序列测定

目的：构建鼠抗人肿坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单链抗体基因。方法：从分泌ｈＴＮＦ－α单抗的小鼠杂交瘤细胞株Ｅ６中获得抗中变区基因的基础上，采用限制性内切酶酶切拼接法，并按ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ的结构将轻，重链可变区基因拼接单链抗体（ＳｃＦｖ）基因，荧光标记测序引物分析其核苷酸序列。结果：构建成长７４７ｂｐ的单链抗体基因。其中连接钛基因长４５ｂｐ，经序列测定和分析表明为拼接正确，完整的抗ｈＴＨＦ０     

抗人跨膜型肿瘤坏死因子-α多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备特异的能区分人跨膜型肿瘤坏死因子（TM—TNF—α）和分泌型肿瘤坏死因子（sTNF—α）的多克隆抗体。方法借助抗原肽预测软件对TM—TNF—α的抗原表位进行预测，合成TM—TNF—α特异的20个氨基酸的多肽，将之与匙孔碱血蓝蛋白（KLH）耦联。BALB／c小鼠皮背部多点注射，收集分离血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术鉴定其特异性。结果成功免疫BALB／c小鼠，ELISA证实该抗血清与免疫多肽有良好的结合，而与sTNF-α、白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）无交叉反应，流式细胞术显示该抗血清可与细胞系U937表达的TM—TNF—α发生特异性结合。结论成功制备了TM—TNF—α特异性多克隆抗体。为制备TM—TNF—α特异性单克隆抗体莫定了基础，为区分TM—TNF—α和sTNF—α的生物学作用提供了有力的工具。     

重组人肿瘤坏死因子突为体的构建和表达

运用ＰＣＲ技术，对天然人肿瘤坏死因子α（ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｔｏｒ－α，ＴＮＦ）基因进行改造，去了天然ＴＮＦＮ端的７个氨基酸，同时以Ａｒｙ％８Ｌｙｓ＾９Ａｒｇ＾１０Ｐｈｅ６５１５７分别取代了原来的ＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｅｕ形成 的突变体ＴＮＦＡ。交突变体克隆于表达载 ｐＢＶ２２０后，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中得到了表达，表达产物的分子量１７ＫＤ。表达量为菌体总蛋白量的１５％。     

重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a的克隆与表达

目的:寻找具有更强抗肿瘤活性和(或)较低毒副作用的TNF α突变蛋白.方法:应用巨引物二轮PCR技术对rh-TNFα的第80 、9 0和92位氨基酸编码的密码子进行定点突变, 经过DNA序列测定证实DNA突变准确后,将突变基因的cDNA插入pBL载体,转化大肠杆菌DH5α,获得表达rh-TNFα-D3a的工程菌.[ HT5W 〗结果:经巨引物二轮PCR获得表达TNFα突变蛋白的基因突变,经序列测定结果与设计一致,重组蛋白表达量占细菌总蛋白18.0％,大部分为可溶性,占rh-TNFα-D3a 总量的60％以上.重组蛋白经纯化,纯度＞98％.rh-TNFα-D3a对L929细胞表现出较高的细胞毒性,比活性大于5×108 IU/mg.与野生型的rh-TNFα相比,rh-TNFα-D3a的毒性降低为野生型的1/10,同时其保留了TNFα的抗肿瘤活性.结论:rh-TN F-αD3a是一个毒性较低,具有较强抗肿瘤作用的衍生物.     

肿瘤坏死因子基因多态性与2型糖尿病相关性探讨

目的:探讨2型糖尿病(NIDDM)患者中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNFβ)基因多态性与2型糖尿病相关性。方法:利用聚合酶链式反应技术对59例2型糖尿病患者及103例正常对照者的肿瘤坏死因子基因进行扩增以cfoI进行限制性酶切图谱分析。结果:正常人群和NIDDM人群中TNFβ基因型均以TNFβ1/2型最为多见,TNFβ基因型分布和等位基因频率在正常和NIDDM人群组间和组内比较均无显著差异(P>0.05)。结论:TNF基因多态性可能在NIDDM及代谢紊乱的发生发展中不起重要作用。     

Hsv-tk、重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的构建pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体,观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达.方法应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK-rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间,成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α,并在该载体转染人喉癌细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况.结果酶切鉴定证实TK-rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间,并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK-rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达.结论pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK-rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位,为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件.     

人肿瘤坏死因子α基因cDNA直接注入小鼠骨骼肌表达的初步研究

本实验将带有人肿瘤坏死因子α基因（ＴＮＦ－α基因）ｃＤＮＡ的重组表达质粒直接注入小鼠骨骼肌内，观察了外源基因在小鼠体内的表达情况。双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ法显示，实验组小鼠肌注１５ｄ后血浆中ＴＮＦ蛋白含量逐渐增高并达高峰，然后开始下降。ＲＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ结果显示，肌注２０ｄ时实验组中ＥＬＩＳＡ阳性的小鼠，其肌注处肌肉组织有ＴＮＦ－α基因表达。由此表明，直接将外源ＤＮＡ导入骨骼肌细胞内是基因转移     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的效果

目的 探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rh-TNFR:FC)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗类风湿性关节炎(RA)的效果.方法 选取2018年6月至2019年12月河南科技大学第一附属医院收治的115例RA患者作为研究对象,按照随机数表法分为对照组(n=57)与联合组(n=58).对照组采取单纯MTX治疗,联合...     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎

目的观察重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白（rhTNFR：Fc）对类风湿关节炎（rheumatoid arthfitis,RA）患者的治疗效果。方法将40例活动性类风湿关节炎患者随机分为试验组和对照组。对照组20例,受试者每周口服2次甲氨蝶呤（MTX）（7．5mg/次）;治疗纽20例,受试者每周口服2次MTX（7．5mg／次）,同时每周2次皮下注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（25mg／次）。连续用药12周。观察药物对类风湿关节炎炎症活动指标的影响。结果治疗组RA症状及病情活动的指标在2周起即有明显的下降,起效速度较对照组有明显优势。结论重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白与MTX连用能较好的降低RA症状及病情活动的指标,比单用MTX效果好。     

重组人肿瘤坏死因子突变体的构建和表达

运用ＰＣＲ技术，对天然人肿瘤坏死因子α（ｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ一α，ＴＮＦ）基因进行了改造，去除了天然ＴＮＦＮ端的７个氨基酸，同时以Ａｒｙ￣８Ｌｙｓ￣９Ａｒｇ１０Ｐｈｅ１５７分别取代了原来的ＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｅｕ，形成新的突变体ＴＮＦ△。将突变体克隆于表达载体ｐＢＶ２２０后，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中得到了表达，表达产物的分子量为１７ＫＤ。表达量为菌体总蛋白量的１５％。Ｌ９２９细胞的杀伤活性为２．２×１０６Ｕ／ｍｌ，是天然ＴＮＦ活性的七倍。本工作对研制高效低毒副作用的ＴＮＦ制剂具有重要意义。     

用聚合酶链反应技术构建人可溶性肿瘤坏死因子受体cDNA克隆

肿瘤坏死因子受体（ＴＮＦＲ）是肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）发挥其生物学作用的关键性物质。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增并改造５５ＫＤＴＮＦＲｃＤＮＡ，成功地扩增出编码可溶性肿瘤坏死因子受体成熟肽的序列，并在该序列的５’端和３’端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ识别序列，使之便于与载体重组，为获得亚克隆及在大肠杆菌高效表达奠定基础。     

肿瘤坏死因子α及基因多态性、循环瘦素与2型糖尿病胰岛素抵抗的相关性

目的　探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)及其第 30 8位 G→ A变异、循环瘦素与 2型糖尿病 (2型 DM)胰岛素抵抗的相关情况。　方法　 (1)测定全部受试对象的体质量指数 (BMI)及空腹静脉血糖 (FPG)、血清甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)等指标。 (2 )采用放射免疫的方法检测 2型 DM患者 70例和健康对照组 6 0例空腹血清胰岛素 (FINS)、TNF-α及瘦素水平。用HOMA胰岛素抵抗指数 (HOMA- IR=FPG× FINS/ 2 2 .5 )评价 2型 DM患者的胰岛素抵抗情况。 (3)采用饱和氯化钠法提取所有受试者外周血基因组 DNA。 (4 )以聚合酶链反应(PCR)扩增 TNF- α基因第 30 8位特异性片段 ,扩增产物用限制性内切酶 N co 酶切 ,酶切产物用 12 %聚丙烯酸胺凝胶电泳 ,于紫外灯下确定基因型。 (5 )以 HOMA- IR为因变量 ,以年龄、BMI、TG、TC、HDL、TNF- α基因型、血清 TNF- α及瘦素水平为自变量进行多元逐步回归分析 ,探讨胰岛素抵抗的影响因素。以瘦素为因变量 ,以年龄、BMI、TG、TC、HDL、FPG、FINS、TNF-α及 TNF-α基因型为自变量进行多元逐步回归分析 ,探讨瘦素的影响因素。　结果　 (1) 2型 DM组与正常对照组 FPG (mmol/ L )分别为 11.0 3± 4 .89,5 .2 0± 5 .14 (P <0 .0 1) ,TNF-α(ng/ m L )为 1.2 6± 0 .2 8,1.15± 0 .2 4 (P     

前列腺素E2对跨膜型和分泌型肿瘤坏死因子胞毒作用的影响

研究比较前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）对两型肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）胞毒效应。跨膜型ＴＮＦα（ＴＭ－ＴＮＦα）和分泌型ＴＮＦα（Ｓ－ＴＮＦα）在杀伤靶细胞的同时,可引起靶细胞释放大量ＰＧＥ２（Ｐ〈０．０１）。用环氧化酶抑制剂消炎痛可部分或大部分阻断ＴＭ－ＴＮＦα诱导靶细胞产生的ＰＧＥ２（Ｐ〈０．０１）并县也可抑制ＴＭ－ＴＮＦα的细胞效应（Ｐ〈０．０１）,其抑制程度与ＰＧＥ２阻断程度一致。但消炎痛却不能     

肿瘤坏死因子与肿瘤基因治疗

<正>肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)是迄今发现的抗瘤作用最强的细胞因子,体内外实验均显示了强大的抗肿瘤作用。因此,TNF的研究备受人们的关注。现重点介绍近年来有关TNFα结构与功能关系的研究进展及TNFα在肿瘤基因治疗中的应用情况。     

肿瘤坏死因子α基因启动子区-308位点多态性与2型糖尿病的相关性研究

目的探讨肿瘤坏死因子α基因启动子区-G308A多态性与2型糖尿病的相关性。方法利用PCR-RFLP方法对宁夏汉族100例2型糖尿病患者及101例正常对照者的TNF-α基因启动子区-308位点基因多态性进行分析。结果T2DM组和对照组的TNF-α基因启动子区-308位点GA＋AA基因型频率分别为15.0%和10.89%;A等位基因频率分别为7.5%和5.45%,两组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论肿瘤坏死因子α基因启动子区-G308A多态性与宁夏汉族人群2型糖尿病发病无明显相关性。