6B11ScFv-mHSP70融合蛋白诱导抗卵巢癌免疫应答的体外实验研究

目的 既往研究证实,6B11抗独特型单链抗体（6B11ScFv）具有模拟卵巢癌相关抗原OC166-9的作用。本文研究6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70（mHSP70）构建而成的融合蛋白（6B11ScFv-mHSP70）在体外抗卵巢癌免疫应答,探讨其作为卵巢癌疫苗的可能性。方法 以大肠杆菌表达6B11ScFv-mHSP70融合蛋白,经变性复性后纯度达95%。采用ELISA检测其免疫学活性。采集HLA-A2阳性的女性健康志愿者的外周血单个核细胞,用6B11ScFv-mHSP70刺激并培养。采用CCK-8法、LDH释放法分别观察淋巴细胞增殖情况和对卵巢癌细胞系的细胞毒作用,流式细胞术检测6B11ScFv-mHSP70刺激前后淋巴细胞表型的改变。结果 6B11ScFv-mHSP70具有特异性结合卵巢癌单抗COC166-9及抗小鼠-HSP70抗体的双重免疫学活性;可以刺激人外周血淋巴细胞的增殖;并对HLA-A2阳性、OC166-9表达阳性的卵巢癌细胞系有细胞毒作用;经6B11ScFv-mHSP70刺激后,实验组的淋巴细胞表型与未经蛋白刺激的对照组相比：CD4＋T细胞明显增加,CD8＋T细胞略有增加。CD4＋/CD8＋的比率明显增加,CD4＋CD25＋T细胞占CD4＋T细胞的比率明显下降,差异有统计学意义。结论 6B11ScFv-mHSP70融合蛋白在体外可诱导特异性抗卵巢癌的细胞免疫反应,有可能作为抗独特型疫苗用于卵巢癌的主动免疫。     

CXCL5通过上调Cyclin D1促进卵巢癌细胞增殖

目的:研究CXCL5对卵巢癌细胞增殖的影响及其分子机制。方法:Western blot法检测卵巢癌细胞株中CXCL5表达;构建CXCL5敲低和过表达稳转卵巢癌细胞株,Western blot法验证效率。平板克隆试验、CCK-8、流式细胞术检测CXCL5对卵巢癌细胞增殖能力的影响。Western blot法检测细胞增殖相关蛋白及Akt和Erk等上游分子表达。结果:Western blot法结果显示,CXCL5在卵巢癌细胞株中表达。敲低CXCL5表达后,卵巢癌细胞增殖能力较对照组明显下降(P0.05);过表达CXCL5卵巢癌细胞的增殖能力较对照组明显提高(P0.05)。敲低CXCL5表达后Cyclin D1表达下调,过表达CXCL5后Cyclin D1表达上调,差异均有统计学意义(P0.05),而Cyclin C和Cyclin E表达无显著变化。敲低CXCL5表达后,p-Erk表达显著下调,过表达CXCL5后p-Erk表达显著上调,差异均有统计学意义(P0.05);p-Akt表达无显著变化。结论:CXCL5促进卵巢癌细胞增殖,其可能机制是通过激活Erk通路引起周期蛋白Cyclin D1表达上调。     

siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞EPAS1表达及细胞增殖的体外研究

目的:探讨RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞中缺氧诱导因子2(EPAS1)表达及细胞增殖的抑制作用。方法:合成靶向EPAS1的小干扰RNA(siRNA)并进行转染。实验分为实验组、阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和western blotting检测各组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达水平,通过MTT法检测各组细胞增殖情况。结果:应用EPAS1-siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞后,实验组的EPAS1mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与其他三组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组基因沉默效率为63.9%,蛋白抑制率为48.1%,细胞增殖抑制率为56.9%。结论:靶向EPAS1基因的siRNA可以抑制卵巢癌SKOV3细胞中EPAS1的表达,从而抑制SKOV3细胞在体外的增殖。     

HPV58型E2蛋白表达纯化与多克隆抗体制备

目的:表达纯化重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E2蛋白,制备多克隆抗体。方法:构建重组质粒p ET-28b-E2,转化至BL21(DE3)p Lys S中诱导表达,包涵体洗涤后经镍柱亲和层析分离得到纯化目的蛋白。用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗HPV58型E2蛋白多克隆抗体,ELISA分析多克隆抗体的效价,免疫印迹检测抗体的特异性。结果:表达纯化了重组HPV58型E2蛋白,制备了高滴度和高特异性的多克隆抗体。结论:制备的多克隆抗体可用于对HPV58型E2蛋白进行精细B细胞线性表位鉴定。     

单链抗体导向卵巢上皮癌进行靶向基因转移的实验研究

目的 :探讨靶向性基因转移载体—含抗MUC 1单链抗体的慢病毒对MUC 1+卵巢上皮癌细胞系SKOV 3细胞进行基因转移的特异性 ,为卵巢上皮癌的靶向性基因治疗提供实验基础。方法 :将针对SKOV 3细胞上抗原MUC 1的单链抗体基因构建到慢病毒包膜结构质粒 (pM .TC .G) ,以报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因作为目的基因。用磷酸钙沉淀法进行Anti MUC 1(ScFv)慢病毒包装 ,感染共培养的卵巢癌细胞SKOV 3(MUC 1+)和正常人成纤维细胞GF(MUC 1- ) ,荧光显微镜下观察感染效果。竞争抑制实验即病毒感染前加入Anti MUC 1单抗是否抑制病毒感染。结果 :荧光显微镜下观察到Anti MUC 1(ScFv)介导的慢病毒对共培养的SKOV 3(MUC 1+)和GF(MUC 1- )细胞的感染有明显差别 ,非Anti MUC 1(ScFv)介导的慢病毒对共培养的SKOV 3(MUC 1+)和GF(MUC 1- )的感染未见显著性差别 ,证明Anti MUC 1(ScFv)介导的慢病毒可对MUC 1+的卵巢细胞靶向性转染。病毒感染前加入Anti MUC 1单抗则可抑制病毒靶向性感染。此竟争抑制实验表明 ,病毒感染是由其抗体组成部分介导 ,故有抗体靶向性。结论 :Ani MUC 1(ScFv)介导的慢病毒可对MUC - 1+卵巢上皮癌细胞靶向性基因转移。     

定量分析卵巢癌细胞中p~（53）基因蛋白表达的意义

目的研究卵巢癌ｐ（５３）基因蛋白表达的量与ＤＮＡ倍体水平、细胞增殖活性及组织学分级的关系。方法采用流式免疫荧光技术对卵巢癌４２例的常规石蜡标本单细胞悬液行ＤＮＡ含量和ｐ（５３）蛋白单克隆抗体免疫荧光标记定量测定。结果４２倒卵巢癌的异倍体率为７６．２％（３２／４２）。细胞增殖指数（ＰＩ）为３１．２４±５．３６。ｐ（５３）蛋白表达的阳性率为５９．５％（２５／４２），其表达的量与ＤＮＡ倍体水平、组织学分级及ＰＩ均相关（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ＤＮＡ异倍体率与组织学分级亦有关（Ｐ＜０．０５）。卵巢癌ｐ（５３）蛋白表达阳性的ＤＮＡ含量、ＰＩ值均显著高于阴性者；组织学分化越差，ｐ（５３）蛋白表达阳性率越高。结论ｐ（５３）蛋白表达阳性可作为反映卵巢癌恶性程度的重要指标。     

mdr1启动子调控双自杀基因对卵巢癌SKOV3耐药细胞的靶向杀伤作用

目的观察多药耐药基因1(mdr1)启动子调控腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CD∷UPP)融合基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞的靶向杀伤作用。方法2004年10月至2005年5月于华中科技大学附属协和医院,将重组腺病毒(Admdr1-CD∷UPP)转染卵巢癌紫杉醇耐药细胞(SKOV3/Taxol)及非耐药细胞(SKOV3),荧光显微镜下观察转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因CD∷UPP的表达,并给予不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测二组的细胞存活率及旁观者效应。结果重组腺病毒对SKOV3/Taxol的转染率随腺病毒滴度的递增而增加,感染复数(MOI)为50时,感染率约100%;CD∷UPP基因仅在SKOV3/Taxol中稳定表达;5-FC对耐药细胞转基因组的杀伤作用显著高于非耐药细胞转基因组,前者表现出明显的旁观者效应。结论mdr1启动子调控的CD∷UPP融合自杀基因系统对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞有靶向杀伤作用。     

CD_(80)基因导入人卵巢癌细胞系及其体外诱导细胞毒T淋巴细胞的研究

目的　用逆转录病毒载体将CD80 基因导入人卵巢癌细胞系TYK ,观察表达CD80 基因的TYK(TYK hCD80 )细胞体外诱导细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的增殖及其杀瘤活性。方法　用逆转录病毒载体将CD80 基因导入TYK细胞 ,流式细胞仪测定其CD80 基因的表达。用TYK hCD80 细胞在抗CD3 单克隆抗体 (单抗 )存在下刺激外周血单个核细胞 (PBMC) ,诱导CTL ,3 H 胸腺嘧啶核苷掺入法测定其增殖活性 ,四甲基偶氮唑蓝法测定CTL的杀瘤活性。结果　转染后经G418(geneticin ,是一种氨基糖甙类抗生素 )筛选 ,流式细胞仪检测 ,CD80 基因表达率最高为 84 9%。TYK hCD80 、TYK在抗CD3 单抗存在下刺激PBMC增殖时 ,3 H 胸腺嘧啶核苷掺入量分别为 (4 0 6 0 4± 842 )、(80 0 0± 5 94)cpm ,两者比较 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。TYK hCD80 体外诱导的CTL较TYK诱导者对TYK细胞的杀伤率显著增高(P <0 0 5 )。结论　表达CD80 基因的卵巢癌细胞在抗CD3 单抗存在下能诱导产生CTL ,增殖快且有较高的杀伤活性 ,可能为卵巢癌的免疫基因治疗提供实验依据     

微小RNA-3619-5p通过靶向作用于p21基因对卵巢癌细胞生长的影响

目的:探讨微小RNA-3619-5p(miR-3619-5p)过表达对卵巢癌细胞系A2780和SKOV3中p21基因的上调作用及对卵巢癌细胞生长的影响。方法:使用Lipofectamine 3000分别向卵巢癌细胞系A2780和SKOV3瞬时转染miR-3619-5p(实验组)或者dsControl(对照组)。通过实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测p21、细胞周期依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA的表达情况。蛋白质印迹(Western blotting)检测p21、CDK4和Cyclin D1蛋白的表达情况。流式细胞术检测对照组和实验组细胞周期分布差异和细胞凋亡情况。EdU增殖实验和集落形成实验检测细胞增殖能力。结果:与对照组相比,转染miR-3619-5p后2种细胞系中p21 mRNA均显著升高(P0.01),而CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达均明显降低(P0.01)。Western blotting实验结果与qRT-PCR结果一致。与对照组相比,转染miR-3619-5p后,位于S期和G_2/M期的细胞比例明显下降,位于G_0/G_1期的细胞比例明显增大,细胞凋亡率明显升高。EdU增殖实验和集落形成实验均显示,与对照组相比,转染miR-3619-5p的卵巢癌细胞的增殖能力明显下降(P0.05)。结论:miR-3619-5p可通过激活卵巢癌细胞中p21蛋白的表达抑制卵巢癌细胞的生长。     

卵泡刺激素介导卵巢上皮性癌细胞增殖的初步研究

目的 探讨卵泡刺激素(FSH)促进卵巢上皮性癌细胞增殖的作用途径,从分子水平上了解卵巢癌的发病机理。方法 卵巢上皮癌细胞系OVCAR3转染FSH受体表达质粒,获得FSH刺激敏感的细胞系OVCAR3-FSHR。以FSH刺激细胞,或与蛋白激酶c(PKC)的激活剂十四烷酰佛波醇乙酯(TPA)和抑制剂他莫西芬(TAM)共同刺激细胞,以四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的增殖情况,逆转录-聚合酶链反应技术检测细胞PKC各亚型的mRNA表达;以蛋白印迹法观察PKCα及磷酸化PKCα的表达水平。结果 FSH可刺激OVCAR3-FSHR细胞增殖1．9倍。FSH刺激后,PKCα的表达水平和活性分别增高1．5倍和1．9倍。TPA、TAM均能抑制FSH刺激OVCAR3-FSHR细胞增殖的60％及47％,TPA或TAM与FSH共同刺激PKCα表达较FSH单纯刺激者明显降低。结论 FSH通过PKC的途径,可刺激卵巢上皮癌细胞增殖,在卵巢上皮癌的发展中起一定的作用。     

The anti-tumor immune responses induced by a fusion protein of ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody 6B11ScFv and murine GM-CSF in BALB/c mice

Ovarian carcinoma anti-idiotypic antibody 6B11 was murine derived; we previously have cloned 6B11 single-chain Fv antibody (6B11ScFv) and constructed the 6B11ScFv/human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) fusion protein (designated as 6B11GM) to enhance the immunogenecity of the single-chain Ab(2). Because of the difference in species specificity between human GM-CSF and murine GM-CSF, there is no immune competent animal model on which the effect and metabolism of 6B11GM as a vaccine could be observed. In this study, 6B11mGM fusion gene was constructed by the fusing murine GM-CSF cDNA gene with 6B11ScFv. The fusion gene was cloned and expressed. The product of this gene is a fusion protein. It could specifically interact with the primary anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody (COC166-9) and rat anti-mouse GM-CSF monoclonal antibody, respectively, and stimulate the growth of NFS-60 cells (a murine GM-CSF-dependent cell line). The specific anti-tumor immune response could be induced in BALB/c mice after immunized with anti-idiotypic fusion protein instead of ovarian carcinoma antigen without carrier proteins and adjuvant. Ab(3) could be detected in the sera of immunized mice with 6B11mGM by enzyme-linked immunoadsorbent assay test. Moreover, the fusion protein stimulated proliferation of CD4+ T cell from the spleen of BALB/c mice and proliferation of CD8+ T cell to a lesser degree. Therefore, 6B11mGM probably induces both humoral and cellular immunity against ovarian carcinoma in vivo.     

Gene fusion of molecular adjuvant C3d to hCGbeta enhances the anti-hCGbeta antibody response in DNA immunization

Objective: To express the hCGβ-C3d3 fusion protein in a CHO cell continual expression system to investigate further the adjuvant effects of C3d on contraceptive vaccination. Method: We constructed a plasmid pcDNA3-hCGβ-C3d3 which contains three copies of murine C3d cDNA and the hCGβ gene by cloning the chimerical hCGβ-C3d3 cDNA into the eukaryotic vector pcDNA3 downstream of the CMV promoter. The plasmid was transfected into a COS-7 cell transient expression system and a CHO cell continual expression system. RIA was used to detect hCGβ in the culture supernatant. Western blot and Raji cell immunohistochemical assays were performed to evaluate the expressed protein. Then, 6–8-week-old female BALB/c mice were inoculated intramuscularly with pcDNA3-hCGβ and pcDNA3-hCGβ-C3d3, and ELISA was used to assess anti-hCGβ IgG antibody in serum. Results: In 72 h after COS-7 cells were transfected with the plasmid pcDNA3-hCGβ-C3d3, 1.0×10⁵ cells could secrete 152 ng of the recombinant protein (calculated by hCGβ contained). The transfected CHO cells, which were then screened by G418, could continuously secrete the fusion protein at 660 ng/10⁶ cells/48 h. The hCGβ-C3d3 protein was purified by anti-hCGβ immunoaffinity chromatography. Raji cell immunohistochemical assay demonstrated that both the hCGβ and C3d3 were successfully fused. After DNA immunization intramuscularly, the anti-hCGβ IgG antibody titer in the pcDNA3-hCGβ-C3d3 immunized group was 243-fold higher than that of the pcDNA3-hCGβ immunized group. Conclusion: We have expressed the hCGβ-C3d3 protein successfully, both in a transient expression system (COS-7 cells) and in a stable expression system (CHO cells). The C3d3 molecular adjuvant can enhance significantly the immunogenecity of hCGβ antigen in DNA immunization.     

卵巢癌抗独特型抗体6B11scFv和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因 …

目的 构建和表达模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体６ＢｌｌｓｃＦｖ和人粒细胞－巨噬细胞集刺激因子的融合蛋白,以提高抗独特型抗体的免疫原性,为进一步用于卵巢癌的免疫治疗提供基础。方法 采用基因工程技术,用编码连接肽的ＤＮＡ连接６ＢｌｌｓｃＦｖ和ｈＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ,并对大肠杆菌用温度进行诱导表达;     

A monoclonal antibody which detects a cell surface antigen on murine embryonal carcinoma and early mouse embryo stages may recognize a carbohydrate determinant involving alpha-linked galactose

A rat monoclonal antibody (5D4) apparently specific for murine embryonal carcinoma cells and cells of the pre-implantation embryo is described. It does not react with differentiated cells from a variety of different tumours and tissues of the mouse. Biochemical studies show that the molecules that carry 5D4 antigen are resistant to protease digestion on the cell surface but susceptible to procedures which affect carbohydrate structure. It is likely that this antibody detects a carbohydrate bearing determinant which may include an alpha-linked galactose residue.     

对猪卵透明带抗原杂交瘤制备的初步研究

抗透明带抗体对透明带溶解、精子穿透以及透明带脱落的抑制效应已被证实,本实验应用细胞融合技术制备猪卵透明带(PZ)单克隆抗体,探讨应用抗PZ 单克隆抗体对PZ 抗原结构及特性进行研究的途径。先后进行了六次细胞融合,五次融合获得成功。共接种1728孔,有克隆生长255孔,平均融合率15%。ELISA 检测246孔,初筛抗体阳性9孔,连续多次检测抗体持续阳性2孔。随后采用有限稀释,进行克隆化培养。卵细胞表面沉淀试验表明,阳性杂交瘤培养上清液与无卵丘卵子表面形成明显的沉淀层。分别采用分子量为1000和4000的PEG 作细胞融合,克隆生长孔各为34与29,阳性克隆孔数分别为2和3。对融合后无饲养细胞培养的观察说明,无饲养细胞生长克隆孔数是13,含饲养层生长克隆孔数为34,融合率各为4.5%与11.8%。     

37LRP基因表达载体构建及蛋白表达的研究

目的 研究克隆宫颈癌HeLa细胞层粘连蛋白受体前体(37-kDa laminin receptor precursor, 37LRP)并构建表达载体及成功表达该受体蛋白。 方法 采用RT-PCR从宫颈癌HeLa细胞总RNA中扩增人37LRP受体的cDNA序列,克隆到pGEM-T Easy载体上。经过序列测定后插入到表达载体pET22b(+),在大肠杆菌BL21(DE₃)中诱导表达。 结果 构建的表达载体经限制性内切酶分析和DNA测序并与GenBank比对,证明所构建的重组质粒含有37 LRP插入片段,经诱导后表达37 LRP蛋白。 结论 成功构建了重组人37 LRP表达载体,并获取重组人37 LRP蛋白,为临床肿瘤的研究奠定了基础。     

nm23-M2cDNA的克隆、表达及抗体制备

目的:通过基因工程技术表达和纯化重组nm23-M2蛋白,进而制备高效价、高特异性的抗血清。方法:构建在大肠杆菌中高效表达pQE30/nm23-M2表达质粒,Ni+-NTA亲和层析纯化;用纯化蛋白免疫兔,制备抗血清并纯化,琼脂双向扩散法测效价,免疫组织化学法比较它与抗NM23-H2抗体的特异性。结果:nm23-M2cDNA序列完全正确,表达的17kD可溶性融合蛋白占菌体总蛋白45%,纯化后纯度97%以上,抗血清效价为1∶64-128,提纯后纯度在90%以上,特异性高于抗NM23-H2抗体。结论:成功构建了pQE30/nm23-M2质粒,获得高纯度重组nm23-M2蛋白(rNM23-M2),并制备了高效价、高度特异性的抗血清,为进一步研究nm23-M2基因功能和蛋白作用奠定了基础。     

hCGβ-C3d3融合蛋白免疫BALB/c小鼠及其抗血清对hCG诱导鼠子宫增重的抑制效应

目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGb避孕疫苗的免疫原性。方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGb-C3d3和phCMV1-6His-hCGb,在CHO细胞中获得稳定、高效表达的重组蛋白,并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGb-C3d3融合蛋白和单用hCGb间隔4周两次免疫生育期雌性BALB/c小鼠,ELISA测定血清中抗hCGb抗体滴度,并对各组小鼠产生的抗血清拮抗hCG诱导的小鼠子宫增重效应进行比较。结果:C3d3使hCGb蛋白疫苗的免疫原性增强1 995倍,hCGb-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清具有很强的抑制小鼠子宫增重作用。结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅提高机体对hCGb的体液免疫应答能力,hCGb-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清对hCG的生物学作用具有更强的抑制效应。