人源化Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:构建人天然Fab段噬菌体抗体库,为人源抗体的制备建立技术平台。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,构建噬菌体抗体库,酶切鉴定有无插入片段并测序分析,用IL-2和地高辛进行富集筛选。结果:最终构建的抗体库库容约为8.4×107,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率是70%,DNA测序分析证实抗体重链属IgG亚类,轻链为λ链。用IL-2和地高辛进行三轮筛选,抗体库均得到了不同程度的富集。结论:成功构建了一个天然的人源化噬菌体抗体库,可用于下一步胰淀素人源化抗体的筛选、纯化和表达。     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

BSA-Y-DOTA免疫噬菌体Fab抗体库的构建及鉴定

目的 :构建钇 十二烷四乙酸 (Y DOTA)免疫噬菌体Fab抗体库。方法 :将牛血清白蛋白 (BSA)与DOTA交联 ,并与金属Y鳌合制备成BSA Y DOTA ,用其免疫BALB/c小鼠。检测抗血清的滴度后 ,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞 ,提取总RNA。利用RT PCR扩增全套重链Fd和轻链基因 ,依次插入经改造的噬菌体载体pComb3M的相应酶切位点 ,构建成Fab噬菌体抗体库。用酶切、序列测定及ELISA等方法 ,对重组率、多样性及Fab的展示情况进行鉴定。结果 :成功得制备了BSA Y DOTA交联物 ,并获得较好的免疫效果。免疫小鼠的全套重链Fd片段和轻链均得到正确扩增 ;Fd片断和轻链基因均插入到载体pComb3M中 ;Fab抗体库的库容量达 8× 10 7;重组率约为90 % ,且具有良好的抗体基因多样性。另外 ,Fab片段也被展示于噬菌体表面。结论 :成功地构建了半抗原Y DOTA的Fab噬菌体抗体库 ,为筛选Y DOTA特异性抗体奠定了基础     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析

目的:构建天然人源IgGFab噬菌体抗体库并分析来源于健康人外周血B淋巴细胞的抗体基因可变区的多样性及优势选择。方法:以DNA重组技术从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入噬菌体载体pFabICN相应位置,构建天然人源免疫球蛋白G基因文库;进一步从抗体库中随机挑选克隆,获得重轻链基因进行核苷酸序列测定并利用IgBLAST数据库分析抗体基因可变区的同源家族。结果:从4×108库容的天然人源IgGFab噬菌体抗体库中随机挑选克隆,对其中32个轻链及重链Fd基因插入正确的克隆进行核苷酸序列测定和氨基酸序列的推算,获得29条彼此完全不同的Fd重链基因及轻链基因。以IgBLAST数据库比对分析显示29条重链基因的V区分别属于VH3(72.4%),VH1(10.3%),VH4(6.9%),VH5(6.9%)和VH7(3.4%)基因家族。29条轻链基因分别属于Vκ1(44.8%),Vκ2(15.4%),Vκ3(11.5%),Vκ4(23.1%)基因家族和Vλ1(11.5%)基因家族。结论:以300份健康人外周血淋巴细胞的抗体基因构建的天然人源IgGFab噬菌体抗体库基因多样性良好,重链VH3基因家族存在优势表达。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定

目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。     

Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定

本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发，用基因克隆技术将B细胞全套k轻链和重链Fd片段基因克隆出来，组装到表达载体pComb3H—SS内并表达到噬菌体表面，构建出Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Daudi细胞为抗原对抗体库筛选后，获得针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系膜抗原的抗体。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立

目的:利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术,为今后抗体的研发工作奠定基础.方法:从pNAD质粒中克隆出NlpA leader(含有CDQSSS序列)基因序列,利用相应的酶切位点将该序列插入pComb3表达载体中构建成用于展示Fab的重组质粒pBFD.将从pEAI质粒克隆得到的anti-human IL-1β抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NlpA leader和pelB leader( pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游.将pBFD-Fab转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况.结果:所展示的anti-hlL-1β Fab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性.拯救出的pBFD-Fab-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体.结论:经过该细菌展示系统展示的Fab抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异性结合能力.成功改进该展示技术的基因拯救方法,避免了基因突变和链置换的发生.此外还证明了该展示技术具有很好的稳定性.本实验成功构建了筛选Fab抗体库的细菌展技术.     

人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的 构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg 抗体片段并进行初步鉴定.方法 收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA ,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库.以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定.结果 构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性.经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3 和hFabHB4.对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性.结论 成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fa b抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用 .     

前列腺癌患者抗体库构建中抗体基因的扩增

目的：探讨如何扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因，从而增加抗体库的多样性，为抗体库的构建及筛选奠定基础。方法：分离前列腺癌患者外周血淋巴细胞，提取其总RNA，逆转录为cDNA，通过改变PCR反应条件扩增出全部κ、λ轻链及大部分重链Fd段；改变PCR反应条件扩增未成功的重链片段改用半套式PCR进行扩增。结果：不仅所有引物都扩增出产物，而且其产量也较高。结论：这表明改变PCR反应条件与半套式PCR联合应用可扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因，从而增加抗体库的多样性，为抗体库的构建及筛选奠定基础。     

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制

目的 获得基因工程抗流感病毒抗体,为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基因。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,Oligo-dT逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A／Sydeny/5/97(H3N2）为固相抗原筛选抗体Fab段,并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果 分离到两株Fab克隆,IV－2和IV－6,流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性,间接免疫荧光实验呈阳性,它们都具有血浆抑制作用,病毒中和实验显示能使病毒滴度下降30倍和20倍。结论 获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体,为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。     

抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达

目的：克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达。方法：用逆转录．聚合酶链反应技术（RT-PER），以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和K链的基因，重组到Fab表达载体中，在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab；根据前导肽序列设计引物，通过PER介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列；以NIH3T3／erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果：以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和k链的基因，在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性，分别将Fd段和k链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后，恢复了Fab段的抗原结合活性。单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性。但同时恢复k链后活性却有所下降。结论：成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达，为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础；进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性，为今后以PER方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴。     

人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点Fab单克隆抗体基因的获得

目的：筛选人源抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。方法：根据HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点的氨基酸序列合成23肽，并以此为固相抗原从HIV－1噬菌体Fab抗体库筛选阳性克隆，并进行鉴定及序列测定。结果：获得了1株抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点的人源Fab抗体克隆，具有较高的亲和力、特异性和抑制率，序列测定及分析显示该抗体属IgG I亚类，κ型，重、轻链可变区分别属VhⅢ和VκⅢ基因家族。结论：成功地获得了人源抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。     

Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选

目的:构建抗体库并筛选Rh抗原的Fab抗体.方法:收集5份血清中抗Rh抗体效价在1:256～512的人淋巴细胞, 提取RNA, 用多对引物PCR扩增VH、 Vκ、 Vλ基因, 并分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、 Cκ、 Cλ, 通过重叠PCR, 构建重链Fd基因及完整的kappa、 Lamda轻链, 并进一步重叠PCR, 获得Fab抗体片段.Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS中, 构建获得抗Rh的Fab抗体库, 经4轮Rh(-)/ Rh(+)红细胞阴/阳淘筛, 获得的阳性克隆分别进行血凝试验、 Western blot分析及测序鉴定.结果:构建获得总库容为7.4×106的Fab抗体库, 并从中筛选得到1株能特异结合Rh抗原的Fab抗体.结论:应用基因工程抗体技术, 成功获得了1株能与Rh(+)红细胞特异凝集的Fab抗体, 为制备能用于临床的特异性强、效价高, 并具有自主知识产权的Rh抗体打下基础.