当归对大鼠椎间盘髓核细胞自噬及氧化应激损伤的作用及机制研究

目的 :探讨当归降低椎间盘髓核细胞自噬及氧化应激损伤的作用及其机制。方法 :从大鼠椎间盘中分离并培养SD大鼠原代髓核细胞,用不同浓度(0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml)的当归注射液干预第3代细胞,噻唑蓝(methyl thiazolete trazolium,MTT)法检测适当的当归浓度。将原代髓核细胞随机分成3组:A组(对照组)、B组(H2O2组)和C组(当归+H2O2)组。A组用生理盐水处理24h,不进行H2O2刺激,B组用400μmol/L H2O2分别刺激0.5h、1.5h和3h,C组用适当浓度当归注射液预处理24h后,400μmol/L H2O2分别刺激0.5h、1.5h和3h。流式细胞术检测各组细胞不同时间的凋亡率,western blot检测凋亡相关蛋白细胞色素C、Bcl-2和Bax及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、p-AKT、p-m TOR和p-p70S6K的表达。结果:与其他浓度当归处理组比较,1mg/ml当归注射液可显著增加细胞存活(P0.05)。与A组相比,B组细胞凋亡率随着时间的延长逐渐增加,细胞色素C的表达增加(P0.05),Bcl-2/Bax的比例减小(P0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例增加(P0.05),p62、p-AKT、p-m TOR和p-p70S6K的表达降低(P0.05);与B组相比,C组中细胞凋亡率和细胞色素C、p62、p-AKT、p-m TOR和pp70S6K的表达均降低(P0.05),Bcl-2/Bax和LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例升高(P0.05)。结论 :1mg/ml当归注射液能够抑制大鼠髓核细胞凋亡,这可能与线粒体凋亡通路被阻断相关;1mg/ml当归能促进其髓核细胞自噬,这可能与AKT/m TOR信号通路被抑制相关。     

A20介导TNF-α炎症微环境下髓核细胞衰老的机制研究

目的 :探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)炎症微环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)衰老发生机制。方法:体外分离培养SD大鼠髓核细胞。实验分为三组:正常对照组(只加入正常培养基)、TNF-α干预组(加入不同浓度的TNF-α,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)和自然衰老组(在体外通过细胞不断增长传代至P20代)。应用CCK-8细胞增殖实验﹑β半乳糖苷酶染色﹑Western blot(WB)、QT-PCR、immunofluorescence(IF)从基因、蛋白及细胞功能水平评估髓核细胞衰老变化。应用WB、QT-PCR和IF检测锌指蛋白A20﹑NF-κB(p65)﹑NF-k B(p-p65/phospho S536)表达情况。结果 :与正常对照组相比,TNF-α干预48h、72h后髓核细胞的增殖能力明显降低;TNF-α干预组和衰老组β半乳糖染色阳性率较对照组明显增高;QT-PCR结果提示,与对照组比,TNF-α干预组p53表达增加(P0.05),而A20表达随着TNF-α浓度增高而降低;衰老组A20表达较对照组减少,而p53扩增升高。WB检测显示:TNF-α可以诱导p53﹑A20、p-p65表达上调,而A20表达随着TNF-α浓度增加而降低;同时衰老组A20表达较对照组减少,而p-p65和p53表达增加(P0.05);IF显示:与对照组对比,TNF-α处理下A20﹑p-p65表达增加,但是A20的表达随着TNF-α增加而降低,衰老组A20较对照组也明显降低,p-p65表达增加。结论:髓核细胞衰老程度与TNF-α干预存在剂量关系,TNF-α可以刺激髓核细胞A20表达升高,并激活NF-κB信号通路。而A20表达情况受细胞衰老程度影响,随着髓核细胞衰老A20所参与的作用效能逐渐减低。     

内质网应激在酸诱导的人椎间盘髓核细胞损伤中的作用机制研究

目的 :模拟人椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)酸性环境,研究酸诱导的内质网应激活化以及内质网应激在酸诱导的髓核细胞损伤中的作用机制。方法:体外单层培养人正常髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)系,以p H值7.4为对照,p H值7.0和6.5分别模拟正常和退变椎间盘酸性环境,培养12~72h,建立酸诱导的髓核细胞损伤模型。采用CCK8法检测髓核细胞增殖情况,透射电镜检测髓核细胞中内质网应激活化情况,免疫荧光检测内质网应激特异性标志物糖调节蛋白78(78 k Da glucose-regulated protein,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达。应用4-PBA(内质网应激阻断剂)阻断内质网应激后,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;β半乳糖苷酶染色检测细胞老化。Western blot检测LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白变化情况。结果 :与对照组相比,酸刺激下(p H6.5组)髓核细胞整体增殖力较对照组明显下降;透射电镜下可见内质网扩张明显,膜表面积增加,内质网线粒体膜结构形成,伴线粒体肿胀;细胞免疫荧光检测提示GRP78和CHOP表达明显增加(P0.05)。应用4-PBA后,细胞凋亡率增加,且能够显著增加酸诱导的G1期停滞及β半乳糖苷酶阳性染色率(P0.05)。Western blot检测发现,酸刺激下,髓核细胞LC3、GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3表达增高(P0.05),Bcl-2表达降低(P0.05);应用4-PBA后可降低LC3比值和Bcl-2表达水平,并显著升高GATA4、p53、p21、p16、Bax和Caspase3(P0.05)。结论:酸性微环境能够活化内质网应激,在酸诱导的人髓核细胞急性损伤中起保护作用。     

腺相关病毒介导hBMP-2体内转染对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的:了解腺相关病毒介导骨形态发生蛋白-2(adeo-associated virus mediated human bone morpho-genetic protein-2,AAV-hBMP-2)基因体内转染兔退变椎间盘后对髓核细胞Fas与Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法:36只普通级新西兰大白兔,采用针刺兔椎间盘的方法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型。造模4周后,在MRI影像学中,髄核的信号比正常减弱,证明造模成功,再随机分为注射20μlAAV-hBMP-2组(6×106pfu,A组)、AAV组(6×106pfu,B组)和生理盐水组(C组),分别于注射2周、4周及8周后对椎间盘进行MRI检查,然后取材,石蜡包埋,组织切片应用SP免疫组织化学法和TUNEL法分别观察Fas与Caspase-3蛋白表达及髓核细胞凋亡情况,IPP6.0图像分析系统测定各指标的平均光密度。结果:注射后2周、4周及8周时A组MRI髓核信号结果与B组、C组比较有统计学意义(P0.05)。各组Fas,Caspase-3及TUNEL染色结果随着时间推移逐渐增强,A组Fas、Caspase-3及TUNEL的平均光密度明显低于B组和C组(P0.01),B组与C组间比较无显著性差异(P0.05)。结论:体内转染AAV-hBMP-2能抑制兔腰椎间盘髓核细胞凋亡。     

血红素氧合酶1对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用研究

目的探讨血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法取腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的椎间盘组织,体外培养人退变髓核细胞并传代,取第3代细胞进行实验。采用细胞计数试剂盒8测定不同浓度(10、20、50、100和200 ng/mL)TNF-α对髓核细胞活性的影响,筛选最佳刺激浓度进行下一步实验。将髓核细胞分成4组,分别采用单纯基础培养液(对照组)、TNF-α刺激(TNF-α组)、TNF-α和CoPP 10μmol/L刺激(CoPP组)、TNF-α和ZnPP 15μmol/L刺激(ZnPP组)培养,24 h后采用Hoechst染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1,EMP-1)以及HO-1、p-P65的表达。为进一步探讨HO-1对髓核细胞凋亡的潜在分子机制,取髓核细胞分别采用TNF-α刺激(TNF-α刺激组)以及TNF-α和吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)5μmol/L刺激(TNF-α+PDTC刺激组)培养24 h,采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。结果经检测确定TNF-α最佳抑制浓度为100 ng/mL。Hoechst染色示,对照组和CoPP组凋亡细胞较少;TNF-α组和ZnPP组可见凋亡样改变细胞核,其中ZnPP组最显著。流式细胞仪检测示,与对照组相比,TNF-α组、CoPP组及ZnPP组细胞凋亡率均显著提高(P0.05);与TNF-α组相比,CoPP组细胞凋亡率显著降低(P0.05),而ZnPP组显著提高(P0.05)。Western blot检测示,与对照组相比,TNF-α组HO-1蛋白表达降低,cleaved Caspase-3、EMP-1及p-P65蛋白表达升高(P0.05)。与TNF-α组相比,CoPP组HO-1蛋白表达明显升高,cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65蛋白表达明显降低(P0.05);而ZnPP组HO-1蛋白表达明显降低(P0.05),cleaved Caspase-3、EMP-1蛋白表达增高(P0.05),p-P65蛋白表达无明显变化(P0.05)。与TNF-α刺激组相比,TNF-α+PDTC刺激组细胞凋亡率明显降低(t=3.076,P=0.031)。结论 HO-1能够抑制TNF-α诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡,其机制可能是通过调控NF-кB通路得以实现。     

红景天苷通过JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

目的观察红景天苷对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的影响,并探究其与JAK2/STAT3信号通路的关系。方法通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型,退变细胞分别予浓度为10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的红景天苷培养液。后续实验选择30μg/mL浓度进行,分为Control组、OGD组、红景天苷组、AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)组和红景天苷联合AG490干预组。RT-PCR法检测髓核细胞蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)表达水平;Western blot检测红景天苷对髓核细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影响;ELISA检测上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,流式细胞术检测髓核细胞的凋亡。结果与Control组相比,OGD组Aggrecan和Col2a1 mRNA表达明显降低,炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调。与OGD组相比,红景天苷组显著抑制细胞凋亡以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放,同时,我们发现,AG490组和红景天苷联合AG490干预组上述指标均明显降低,其中红景天苷联合AG490干预组各检测指标较AG490组略低。红景天苷联合AG490干预明显改善髓核细胞的凋亡和炎症反应,并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平。结论红景天苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化而减轻退变髓核细胞炎症因子的产生和细胞凋亡。     

沉默p53和p21基因延缓髓核细胞衰老退变实验研究

目的髓核细胞衰老凋亡是椎间盘退行性变的病理基础,探讨髓核细胞表型分子及延缓髓核细胞衰老退变的机制。方法原代培养8～10周龄雄性SD大鼠髓核细胞,免疫细胞化学染色鉴定髓核细胞表型分子低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-1β、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)及Ⅱ型胶原表达。小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)瞬时转染髓核细胞沉默p53、p21后行RT-PCR及Western blot检测沉默效率,siRNA转染前后细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法生长曲线分析髓核细胞增殖变化。结果免疫细胞化学染色显示髓核细胞表达HIF-1α、HIF-1β、MMP-2及Ⅱ型胶原。第35代髓核细胞转染p53、p21 siRNA后RT-PCR及Western blot检测示p53、p21表达明显受到抑制。第35代髓核细胞SA-β-gal染色阳性率明显高于第1代髓核细胞(P<0.001);正常第35代髓核细胞经p53 siRNA(p53转染组)和p21 siRNA(p21转染组)转染后,SA-β-gal阳性率明显低于正常第35代髓核细胞(正常组)和加入脂质体LipofectaminTM2000而无siRNA的第35代髓核细胞(阴性对照组),差异有统计学意义(P<0.001)。细胞周期分析显示,p53转染组及p21转染组G1期百分比均明显低于正常组和阴性对照组(P<0.05),S期百分比明显高于正常组和阴性对照组(P<0.05)。MTT生长曲线显示转染p53、p21 siRNA后可促进髓核细胞增殖。结论沉默p53、p21基因可通过调节细胞周期而抑制髓核细胞衰老退变,改善椎间盘退变过程;沉默p53、p21基因可能是潜在的治疗椎间盘退行性变的方法。     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

柚苷对髓核间充质干细胞生物学性能的影响及其相关机制

目的:探讨柚苷对人退变腰椎间盘来源髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,h NPMSC)生物学性能的影响及其可能机制。方法:收集腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织,分离培养h NPMSC并进行体外扩增。通过细胞形态学观察、细胞免疫表型检测及三系分化进行间充质干细胞的鉴定。取P3代hNPMSC分为对照组(正常培养基培养)、柚苷组(以含20μg/mL柚苷的培养基培养)和LY294002组(用含20μg/mL柚苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的培养基培养),培养6d后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,TUNEL荧光检测TUNEL染色阳性细胞率,Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax及PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、Akt和p53的表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达。结果:来自人退变腰椎间盘髓核的原代细胞贴壁生长,呈不规则多边形,传代后以梭形为主;高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达CD45及CD34;茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色证实经诱导后可向骨、脂肪及软骨细胞分化,符合间充质干细胞的表型。与对照组比较,柚苷组细胞凋亡率、TUNEL染色阳性细胞率、p53、Caspase-3和Bax蛋白表达显著性下降,p-Akt及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著性增加(P0.05);LY294002干预后可以逆转这种改变(P0.05)。与对照组比较,柚苷组hNPMSC中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达显著性增加;LY294002组中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达较柚苷组显著性减少(P0.05)。结论:柚苷可通过激活PI3K/Akt信号通路减少细胞凋亡,促进hNPMSC向髓核细胞分化。     

肺组织NF-κB和PUMA与SAP-ALI的关系及PDTC的干扰作用

目的探讨NF-κB(核因子-κB)和PUMA(p53正向凋亡调节因子)在大鼠重症急性胰腺炎致急性肺损伤(SAP-ALI)发病中的作用及脯氨酸二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对此过程的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组(A组),SAP-ALI组(B组),SAP+PDTC干预组(C组),每组24只。各组再按6,12,24 h时点分为3个亚组,每亚组8只。A组开腹后翻动胰腺数次;B组采用胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠(1 mL/kg)诱导SAP-ALI模型;C组在B组的基础上于术前1 h给予PDTC(15 mg/kg),各组按各时点处死大鼠。观察胰腺和肺脏病理变化。检测不同组肺脏组织中NF-κBp65,PUMA和Caspase-3的表达及Caspase-3活性;检测组织TNF-α,MIP-2和ICAM-1 mRNA的表达、髓过氧化物酶(MPO)的活性和肺泡上皮细胞凋亡指数。结果成功建立大鼠SAP-ALI模型。Western-blotting和RT-PCR结果显示,B组肺上皮细胞NF-κB p65,PUMA和Caspase-3蛋白表达在12 h后显著增加(P0.05),NF-κB p65与PUMA呈高度正相关(r=0.987,P0.01)。TNF-α,MIP-2,ICAM-1mRNA表达及MPO和Caspase-3活性明显增加(P0.01)。C组肺损伤病理组织学评分在术后各时点较B组显著下降(P0.05),C组12 h后的肺组织NF-κB p65,PUMA和Caspase-3蛋白表达及MPO和Caspase-3活性明显降低(P0.05);TNF-α,MIP-2,ICAM-1 mRNA表达明显下降(P0.05),C组细胞凋亡指数较B组明显降低(P0.01)。结论大鼠SAP-ALI既与NF-κB活化引起的炎症因子释放有关又与NF-κB活化引起的PUMA上调促进细胞凋亡有关。PDTC通过抑制NF-κB活化,下调炎症因子释放及NF-κB活化引起的PUMA表达可抑制肺组织的细胞凋亡,从而减轻SAP-ALI的程度。     

过载静压下益肾活血通络含药血清对人椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的：探讨在过载静压应力下益肾活血通络方含药血清对人椎间盘髓核细胞凋亡的影响及其相关机制。方法：将人椎间盘髓核细胞分为3组,空白组无任何干预,模型组和中药血清干预组在体外3 MPa压应力干预下作用2、4、6 h后,观察椎间盘髓核细胞的形态、生长状况、超微结构的变化及差异;检测椎间盘髓核细胞的凋亡率及髓核细胞内核因子κB p65（nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65）,Y染色体中性别决定区相关的高迁移率组框9（SRY-related high mobility group-box 9,SOX9）,C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）,基质金属蛋白酶-13（matrix metalloprotein-13,MMP-13）蛋白和相对应基因表达情况。结果：同一作用时间下模型组髓核细胞与空白组比较：体积缩小、胞浆减少、生长状况更差;中药血清干预组髓核细胞较模型组体积稍大,形态保存更完整,胞浆更丰富,生长状况更好。同一作用时间下空白组髓核细胞超微结构完整,主级突起、次级突起结构未见断裂,模型组与中药血清干预组超微结构破坏,主级突起、次级突起可见不同程度断裂,两组超微结构未见明显差异。相同作用时间下模型组髓核细胞凋亡率高于空白组,而中药血清干预组髓核细胞凋亡率低于模型组（P<0.05）;随作用时间增加,空白组、中药血清干预组椎间盘髓核细胞凋亡率未见明显差异,模型组椎间盘髓核细胞凋亡率增加。相同作用时间下,中药血清干预组较模型组NF-κB p65、CHOP、MMP-13表达减少,SOX9表达增多（P<0.05）;随作用时间的增加,空白组、模型组髓核细胞的NF-κB p65、CHOP、MMP-13表达增多,SOX9表达减少,且模型组表达程度较空白组大（P<0.05）;通过基因表达总体来看,在相同作用时间下,中药血清干预组髓核细胞基因NF-κB p65、CHOP、MMP-13相对定量较模型组均减少,而SOX9相对定量增多（P<0.05）;空白组髓核细胞基因NF-κB p65、CHOP、MMP-13相对定量比模型组减少,而SOX9相对定量增多（P<0.05）;随作用时间的增加,空白组、模型组髓核细胞的NF-κB p65、CHOP、MMP-13相对定量增多,SOX9相对定量减少（P<0.05）。结论：益肾活血通络方能减少过载静压下髓核细胞的凋亡,具有延缓髓核细胞退变的作用,其机制可能通过抑制髓核细胞NF-κB p65信号通路,使CHOP、MMP-13表达减少,SOX9表达增加有关。     

siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响

[目的]探讨siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响。[方法]采用弯曲鼠尾法建立椎间盘退变模型。处死动物。取退变椎间盘组织分离培养髓核细胞。P1髓核细胞分为4组,分别为空白对照组、TRAIL-siRNA转染组(siTRAIL组)、TNF-α处理组(TNF-α组)和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组(TNF-α+siTRAIL组)。采用MTT法检测P1髓核细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]相较于空白对照细胞,TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05);TNF-α处理引发髓核细胞增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表达的影响(P0.05)。[结论] TRAIL siRNA转染可沉默TRAIL表达,从而逆转TNF-α诱导大鼠髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡和Caspase-3表达。     

葡萄糖及O-GlcNAc糖基化对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡、衰老的影响

目的:探讨微环境中不同浓度葡萄糖是否可通过蛋白质O位氮乙酰葡糖胺(O-Glc NAc)糖基化修饰影响人骨髓间充质干细胞增殖、周期、凋亡及衰老。方法:构建常规浓度葡萄糖(A组)(5.5mmol/L)、高浓度葡萄糖(B组)(25mmol/L)微环境模型及常糖糖基化(C组)(常糖+Thiamet-G 1.0mmol/L)、高糖糖基化(D组)(高糖+Thiamet-G 1.0mmol/L)细胞模型。人骨髓间充质干细胞在各组中培养,于第3、5、7天用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒测定各组细胞增殖情况;于第5天用流式细胞仪检测各组细胞周期和细胞凋亡情况;于第7天用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组细胞衰老情况;于第5天用Real-time PCR、Westen-bolt检测不同处理组Cyclin D1和caspase-3的表达水平。结果:第3、5、7天时细胞增殖结果显示,与A组相比,B组、C组和D组细胞增殖明显下降(P0.05)。细胞周期结果显示,B组、C组和D组相较于A组细胞周期G1期阻滞(P0.05)。细胞凋亡结果显示,与A组相比,B组、C组和D组凋亡明显增多(P0.05)。细胞衰老染色显示,与A组相比,B组、C组和D组细胞衰老明显增多(P0.05)。Real-time PCR结果显示,Cyclin D1的m RNA相对值A组、B组、C组和D组分别为1.01±0.31、0.31±0.07、0.42±0.1、0.18±0.04,其他三组显著低于A组(P0.05);caspase-3的m RNA相对值A组、B组、C组和D组分别为1.09±0.82、5.73±1.54、3.43±0.59、6.82±2.13,其他三组显著高于A组(P0.05)。Westen-bolt结果显示,A组h BMSCs内蛋白质O-Glc NAc糖基化水平高于B组;Cyclin D1的蛋白水平表达B组、C组和D组低于A组(P0.05),caspase-3的蛋白质水平表达B组、C组和D组高于A组(P0.05)。结论:微环境中高浓度葡萄糖和细胞蛋白质高水平O-Glc NAc糖基化修饰抑制人骨髓间充质干细胞增殖,阻滞细胞周期促进细胞凋亡及衰老。微环境中高浓度葡萄糖可诱导胞内蛋白质O-Glc NAc糖基化水平升高。微环境中高浓度葡萄糖诱导的蛋白质O-Glc NAc糖基化水平升高可能是其抑制增值促进凋亡和衰老的机制之一。     

过氧化物酶体增殖物激活受体β反义寡脱氧核苷酸促进肿瘤坏死因子α介导的HaCaT细胞凋亡的实验研究

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)β反义寡脱氧核苷酸(asODN)在肿瘤坏死因子(TNF)α介导的HaCa了细胞凋亡中的作用。方法常规复苏HaCaT细胞,随机分为正常对照组(不行转染)、对照组(单纯用脂质体处理)、错义寡脱氧核苷酸(scrODN)组(转染PPARβscrODN)、asODN组(转染PPARβasODN)、TNF-α组(受TNF-α刺激)、scrODN TNF-αC组(同scrODN组处理后受TNF-α(刺激)、asODN TNF-α组(同asODN组处理后受TNF-αC刺激),PPARβscrODN或asODN均为4μmol／L,TNF-α为10μg／L。采用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法观察PPARβmRNA及其蛋白质的表达水平;采用hoechst33258荧光染色,观察细胞的形态学改变并计算凋亡核百分率;采用噻唑蓝法测定存活细胞数;采用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)比色测定试剂盒检测caspase-3的活化情况。结果正常对照组、对照组、scrODN组PPARβmRNA及其蛋白质的表达水平相近;asODN组则明显下降。正常对照组、scrODN组及asODN组凋亡核百分率低下,存活细胞数较多,caspase-3活性也处于低水平。TNF-α组、scrOON TNF-α组凋亡核百分率分别为(33．1±2．7)％、(32．9±3．0)％,存活细胞数较少,caspase-3活性较高;asODN TNF-α组凋亡核百分率增至(58．8±4.6)％,且存活细胞数、caspase-3活性分别明显低于和高于前2组(P<0．05)。结论PPARβasODN能促进TNF-α介导的HaCaT细胞凋亡。     

重组腺相关病毒2介导hTGF-β_1基因体内转染兔退变髓核细胞对蛋白多糖含量的影响

目的应用重组腺相关病毒2(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)介导hTGF-β1基因体内转染兔退变椎间盘髓核细胞,观察基因产物的表达及其对退变髓核细胞蛋白多糖合成的生物调节作用。方法于24只成年新西兰大白兔,雌雄不限,体重1.7～2.2kg,L1、2、L2、3、L3、4、L4、5椎间盘注射25μL浓度为1mmol/L的纤维结合素片段(fi bronectin fragment,Fn-f)制备椎间盘退变模型,注射Fn-f4周时的造模椎间盘模拟早期退变的椎间盘。将24只兔随机分为3组(n=8),A、B、C组分别于造模椎间盘髓核内注射25μL rAAV2-hTGF-β1(1×1012vg/mL)、rAAV2-增强绿色荧光蛋白(enhanced green?uorescent protein,EGFP,rAAV2-EGFP)、PBS。术后1周A、C组各处死2只兔,取髓核组织采用免疫组织化学染色观察hTGF-β1的表达;术后4、8、12周每组取2只兔髓核组织,35S整合分析法检测新合成蛋白多糖的含量;术后12周处死B组2只兔,荧光显微镜观察髓核组织中EGFP的表达。结果术后1周,免疫组织化学染色示A组髓核细胞及基质中广泛存在强阳性染色颗粒,C组仅存在少量阳性颗粒。35S整合法检测示,各时间点A组35S蛋白多糖合成率均高于B、C组,比较差异有统计学意义(P0.05);B、C组间比较差异无统计学意义(P0.05)。术后12周,荧光显微镜下观察B组盘髓核组织可见大量绿色荧光表达。结论新型基因转导载体rAAV2可有效介导hTGF-β1基因体内转染兔退变髓核细胞,基因产物可持续表达超过12周,hTGF-β1可有效促进退变髓核细胞蛋白多糖的合成。     

IL-10基因修饰的BMSCs对大鼠脑缺血再灌注损伤炎性因子及神经细胞凋亡的影响

目的探讨IL-10基因修饰的BMSCs对大鼠脑缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)炎性因子及神经细胞凋亡的影响。方法取SD大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离培养BMSCs,经免疫组织化学染色鉴定后,取第3代BMSCs以重组腺病毒(recombinant adenovirus,Ad)介导IL-10基因转染(Ad IL-10-BMSCs)。取40只清洁级成年SD雄性大鼠,采用线栓法制备大脑中动脉阻塞模型后随机分为4组,每组10只。模型制备后3 h于各组大鼠尾静脉注射1 m L含10%FBS的L-DMEM培养液(A组)、61.78 ng IL-10(B组)、1 m L BMSCs悬液(细胞浓度为2×10~6个/m L,C组)、1 m L Ad IL-10-BMSCs悬液(细胞浓度2×10~6个/m L,D组)。C、D组细胞移植前采用Brd U标记。7 d后大鼠经颈总动脉灌注处死取脑组织,免疫染色法检测小胶质细胞(OX42)表达,ELISA法测定TNF-α、IL-1β含量,TUNEL法检测神经细胞凋亡;取C、D组组织行Brd U免疫荧光染色观察。结果C、D组脑组织中均见呈绿色荧光的Brdu阳性细胞,主要分布于梗死区周围的纹状体、大脑皮质、皮质下等。免疫组织化学染色示,B、C、D组OX42阳性细胞数明显少于A组,D组少于B、C组,比较差异有统计学意义(P0.05)。ELISA检测示D组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β含量较其余3组明显降低(P0.05)。TUNEL法检测各组凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑组织(相当于缺血半暗带),D组与A、B、C组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论Ad IL-10-BMSCs能通过抑制小胶质细胞分泌促炎性因子TNF-α、IL-1β,抑制梗死灶周围脑组织神经细胞凋亡,对大鼠脑IRI起保护作用。     

异丙酚预先给药对BV-2细胞缺氧复氧时TLR4表达的影响

目的 评价异丙酚对BV-2细胞缺氧复氧时Toll样受体4(TLR4)表达的影响.方法 小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)于6孔培养板中培养4～6 d后随机分为4组(n=4),正常对照组(C组)不给予任何处理;缺氧复氧组(A/R组)缺氧3 h、复氧12 h;缺氧复氧+25μmol/L异丙酚组(P25组)和缺氧复氧+100μmol/L异丙酚组(P100组)于缺氧前30 min加入异丙酚,终浓度分别为25、100μmol/L.于复氧12 h时收集细胞,测定TLR4 mRNA、NF-κB mRNA和TLR4蛋白水平;收集细胞上清液,测定TNF-α水平.结果 与C组比较,A/R组、P25组和P100组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、TLR4蛋白和TNF-α水平均升高(P<0.01);与MR组比较,P25组和P100组TLR4 mRNA、NF-κB mBNA、TLB4蛋白和TNF-α水平均下降(P<0.01);与P25组比较,P100组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、TLR4蛋白和TNF-α水平均降低(P<0.01).结论 异丙酚25、100 μmol/L预先给药可抑制BV-2细胞缺氧复氧时TLR4 mRNA表达上调.     

移植骨髓间充质干细胞对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对兔退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响.方法 以各兔L2/3、L3/4、L4/5、L5/6节段分为正常组、退变组、成纤维细胞(SFs)移植对照组、MSCs移植治疗组.MSCs和SFs分别经绿色荧光蛋白(GFP)转染后,注射植入退变椎间盘的髓核.通过透射电镜观察退变椎间盘凋亡髓核细胞形态;用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测退变组织中髓核细胞凋亡相关基因bcl-2和box mRNA的表达;免疫荧光法标记髓核细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,并通过TUNEL法标记凋亡髓核细胞,激光共聚焦显微镜检测髓核细胞凋亡蛋白表达率和细胞凋亡比率.结果 透射电镜下,退变椎间盘中凋亡髓核细胞呈现出核染色质边集,空泡形成,核膜断裂,凋亡小体形成等变化.MSCs移植治疗组bcl-2 mRNA的表达量高于退变组和SFs移植对照组(P<0.05),bax mRNA的表达量与退变组差异无统计学意义(P>0.05).MSCs移植治疗组细胞凋亡率和Caspase-3表达率均高于正常组[细胞凋亡率分别为(16.75±2.14)%和(6.86±1.08)%;Caspase-3表达率分别为[(20.34±1.03)%和(6.09±0.77)%](P<0.05),低于退变组和SFs移植对照组[细胞凋亡率分别为(31.87±4.16)%和(29.02±2.16)%;Caspase-3表达率分别为(31.50±3.78)%和(30.20±4.93)%](P<0.05).结论 髓核细胞凋亡在椎间盘退变过程中起重要作用.MSCs移植能有效抑制椎间盘髓核细胞凋亡,延缓椎间盘退变过程.     

3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲对不同p53状态肝癌细胞中生长抑制及DNA损伤诱导基因45β的诱导差异及其机制

目的 探讨3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine)对不同p53状态肝癌细胞的生长抑制及DNA损伤诱导基因45β(GADD45β)诱导差异及其调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53;体外合成GADD45β近端6个启动子序列群(-618 ～-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53;以实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)比较Triapine对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;进一步比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;并通过半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达变化测定细胞凋亡的发生和发展.结果 Triapine对Hep3B中GADD45诱导并不明显,Hep3B+p53对Triapine敏感性明显增加,2.5、5.0μmol/L剂量下GADD45/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)比值分别为0.0425和0.0704,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示Triapine作用Hep3B+p53后的启动子核因子(NF)-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.3倍和0.7倍.Triapine能够更加明显地抑制Hep3B +p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,5μmol/L Triapine对Hep3B +p53DNA合成的抑制率为40.89％,对细胞克隆形成能力的抑制率达到68.16％,与Hep3B比较差异有统计学意义(P＜0.05).Triapine作用后Hep3B+p53的Caspase-3能迅速激活,活性高峰提前出现于6h.结论 p53在核糖核苷酸还原酶抑制剂化疗药物对肝癌细胞的GADD45诱导中具有重要作用,其作用机制可能是增强转录调节因子的表达水平.