体外培养的人甲状腺细胞对TSH反应的实验研究

目的 研究促甲状腺激素（TSH）对甲状腺细胞分泌细胞的影响，探讨TSH的细胞内信号传导通路。方法 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液体外培养人甲状腺细胞，对照组48h后加入TSH，实验组24h内加入TSH（2U/L)，观察细胞培养1，3，5，7d的T3，T4分泌量及培养细胞内的cAMP含量和TPO活性。结果 对照组甲状腺细胞呈上皮样贴壁生长，实验组细胞则呈假滤泡样立体生长。实验组细胞T3、T4分泌量及细胞内cAMP含量均较同期对照组明显增加，但实验组TPO活性仅于3d之内较对照组增加，3d之后显著下降，至培养第5d2组细胞TPO活性均消失。结论 TSH作为一种生长刺激因子至少有一部分是以cAMP为第二信使起作用的；TSH对细胞增殖及分化的作用与细胞周期相关，可通过同一信号分子调节细胞生长，是细胞增值与分化的关键因素。     

金雀异黄素对高糖培养肾小球系膜细胞SMemb表达及细胞外基质的影响

目的探讨金雀异黄素（Gen）对高糖培养下大鼠系膜细胞（MC）表型和细胞外基质（ECM）的影响。方法对照组：低糖DMEM培养液；实验组：高糖DMEM培养液（含0、5、10、50、100、200μmol／LGen），培养12、24、48h，分别检测SMemb mRNA、MMP-2 mRNA、TIMP-1 mRNA水平及上清液Fn的含量。结果Gen可抑制高糖刺激下SMemb的表达，减少Fn的分泌（P〈0．01或0．05）；并可增加MMP-2／TIMP-1 mRNA半定量比值，呈浓度、时间依赖性。结论在体外高糖条件下，Gen干预可降低MCSMemb表达，减轻ECM积聚。     

氟致大鼠生精细胞凋亡的研究

目的观察氟对成年大鼠生精细胞凋亡的影响。方法通过腹腔注射氟化钠建立氟中毒动物模型,采用消化-离子选择电极法测定睾丸氟,采用光学显微镜和TUNEL原位细胞杂交方法检测大鼠生精细胞凋亡情况。结果①染毒28 d时,低剂量祖(NaF 10 mg/kg)和高剂量组(NaF 20 mg/kg)大鼠睾丸氟分别为(8.14±0.44)、(9.78±0.75)μg/g,较对照组增高(P< 0.05);染毒38 d时,睾丸氟分别为(9.10±0.71)、(10.23±0.68)μg/g,也较对照组增高(P< 0.05)。②与对照组相比,各染氟组生精细胞凋亡指数均升高(P< 0.01)。③生精细胞凋亡指数与睾丸含氟量呈正相关(r= 0.905 1～0.961 6,P< 0.01)。结论氟在一定剂量和作用时间内可致生精细胞凋亡。     

性激素水平对染氟大鼠生精细胞凋亡的调节作用

目的探讨性激素水平对染氟大鼠生精细胞凋亡的调节作用。方法通过腹腔注射氟化钠(NaF)溶液的方法建立大鼠氟中毒模型,采用放射免疫的方法检测血清睾酮和雌二醇水平,采用末端标记法(TUNEL)检测凋亡的生精细胞。结果①NaF10、20mg·kg-1·(2d)-1染毒28d时,睾酮水平为(10.39±0.54)、(8.34±1.29)nmol/L,较对照组降低(P<0.05或0.01);染毒38d时,睾酮水平为(9.82±0.66)、(6.33±0.68)nmol/L,较对照组降低(P<0.01)。②NaF10、20mg·kg-1·(2d)-1染毒28d时,雌二醇水平为(44.24±11.32)、(36.27±3.00)pmol/L,较对照组降低(P<0.01);染毒38d时,雌二醇水平为(42.90±9.81)、(26.02±16.14)pmol/L,较对照组降低(P<0.01)。③与对照组相比,各染氟组生精细胞凋亡率均升高(P<0.01)。④生精细胞凋亡率与血清睾酮水平呈负相关(r值为-0.901～-0.886),与血清雌二醇水平呈负相关(r值为-0.989～-0.936)。结论氟在一定剂量和作用时间内可致大鼠血清性激素水平紊乱,是导致生精细胞凋亡的重要原因之一。     

雄性小鼠生精细胞在不同浓度甘草液培养下生物学特征观察

目的观察小鼠生精细胞在不同浓度的甘草液培养下的生物学特征,为探讨具有雌激素样作用的药材——甘草是否对男性生殖细胞有毒性,从而为研究男性不育不孕症的发生机制及甘草等含雌激素样作用的中药材的临床应用提供实验数据。方法采用体外培养技术分离培养生精细胞,通过倒置显微镜动态观察、瑞-姬染色,MTT方法检测、分析细胞毒性。结果①动态观察、姬姆萨染色可以看出,同一时间段实验组细胞比正常组细胞的生长状态变差。细胞的密度变稀,细胞生长分裂受到一定的抑制或有些细胞凋亡;细胞染色变浅,胞浆浆中颗粒、核染色质着色变弱。②MTT方法检测得出,培养液加入1μg/ml甘草浸膏的细胞组,细胞存活率为87.0%,加入10μg/ml甘草浸膏的细胞组,细胞存活率为68.6%,加入100μg/ml甘草浸膏的细胞组,细胞存活率为46.5%。结论具有雌激素样作用的药材——甘草对男性生殖细胞有一定的毒性作用。     

叶酸缺乏对大隐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 测定叶酸缺乏对人大隐静脉内皮细胞（HSVECs）增殖的影响。方法将HSVECs在叶酸缺乏的培养液（实验组）和正常培养液（对照组）中培养30d,用细胞培养和流式细胞仪（FCM）测定叶酸缺乏对HS—VECs细胞增殖数量、细胞周期分布和凋亡的影响。结果HSVECs在2种培养液中生长30d后,观察结果显示叶酸缺乏可引起HSVECs细胞数量减少、增殖周期细胞比例减少、凋亡增高（P〈0．01）。结论叶酸缺乏可抑制HSVECs细胞的增殖生长。     

胚胎大鼠神经干细胞培养方法的改进

分别以DMEM/F12、2?7、20 ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml的表皮生长因子无血清培养液和5%胎牛血清培养液预先培养大鼠神经干细胞(NSCs)2~3 d后,换为无血清培养液;应用倒置显微镜和免疫细胞化学法对其进行观察和比较。结果用含胎牛血清培养液培养的NSCs聚球速度较无血清培养液明显加快,可提前3~4 d观察到NSCs球。细胞染色证实细胞系巢蛋白阳性,经血清培养液诱导分化后部分呈抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性,部分呈抗胶质纤维酸性蛋白阳性,表明可分化为神经元和胶质细胞。认为含血清培养液预先培养可以加快细胞培养速度,是获得NSCs的经济有效方法。     

华蟾毒精抑制人肝癌细胞株增殖、促凋亡作用及机制探讨

目的:观察华蟾毒精对人肝癌细胞株增殖抑制及促凋亡作用,并探讨其机制。方法:选取人肝癌细胞HepG2进行培养,取对数生长期HepG2细胞分为实验组1(浓度为25μmol/L华蟾毒精处理)、实验组2(浓度为50μmol/L华蟾毒精处理)、实验组3(浓度为100μmol/L华蟾毒精处理)和对照组(加等体积的生理盐水),培养24h、48h后采用MTT法和流式细胞术检测对照组和实验组肝癌细胞HepG2增殖抑制率和凋亡率。培养48h后荧光定量PCR检测AKT、mTOR、Caspase3、Bax和Bcl-2 m RNA表达量,免疫印迹法检测Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达量。结果:培养24h、48h,实验组1、实验组2和实验组3细胞增殖抑制率均显著高于对照组(P0.05),且实验组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05);培养24h、48h实验组1、实验组2和实验组3细胞凋亡率均显著高于对照组(P0.05),实验组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05);培养48h,实验组1、实验组2和实验组3细胞AKT、mTOR、Bcl-2 m RNA表达量与对照组相比均显著降低(P0.05),Bax和Caspase-3 m RNA表达量均显著增加(P0.05),且实验组Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达与m RNA表达结果趋势一致。结论:华蟾毒精能够抑制肝癌细胞HepG2增殖,并促进其凋亡,作用机制可能与通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax、Caspase-3蛋白的表达,调控AKT/mTOR信号通路有关。     

不同浓度PM2.5对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12的损伤作用及SP-B表达影响

目的 探讨不同浓度细颗粒物(PM_2.5)对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12的损伤作用及肺表面活性蛋白-B(SP-B)表达的影响。方法 将肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12分为实验组和对照组。实验组采用加入12.5、25、50、100、200μg/mL PM_2.5混悬液的DMEM完全培养基培养,对照组采用DMEM完全培养基培养。培养24 h或48 h后,采用光学显微镜观察细胞形态,透射电镜观察细胞超微结构,RTCA仪观察细胞增殖能力;Western blotting法检测细胞中SP-B蛋白;qRT-PCR法检测细胞中SP-B mRNA。结果 随着PM_2.5浓度的升高,实验组细胞形态和超微结构受损程度逐渐加重,可见板层小体受损等细胞器损伤现象,对照组细胞形态和超微结构正常;与对照组相比,PM_2.5呈浓度依赖性抑制实验组细胞的增殖。与对照组相比,实验组细胞SP-B蛋白和mRNA表达呈浓度依赖性下调(P均<0.05)。结论 PM_2.5可呈剂量依赖性损伤小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12,...     

维甲酸抑制甲状腺鳞癌细胞株生长增殖作用机制的探讨

目的观察9-顺维甲酸（9-cis-RA）对甲状腺鳞癌SW579细胞株生长增殖及维甲酸受体B（RARβ）和p21表达的影响，进而探讨维甲酸的抗癌作用机制。方法将甲状腺鳞癌细胞株SW579分为对照组和实验组。实验组加入不同浓度的9-cis-RA，使其终浓度分别为1×10^-7mol／L、5×10^-7mol／L、1×10^-6mol／L、5×10^-6mol／L、1×10^-5mol／L，各组细胞均在培养24h后加药，继续培养48h。在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化；采用MTT比色法测定细胞增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期；用RT-PCR方法检测SW579细胞RARβ及p21mRNA的表达。结果低浓度9-cis-RA组（1×10^-7mol／L、5×10^-7mol／L、1×10^-6mol／L）肿瘤细胞有向良性细胞形态转化的趋势；高浓度组（5×10^-6mol／L、1×10^-5mol／L）细胞生长密度较对照组明显降低，与低浓度组相比，向成熟分化的趋势不明显。MTT结果显示，实验组细胞均出现显著的生长抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞仪分析，实验组随着9-cis-RA的升高，S期细胞在细胞周期中所占比例逐渐减少，G1期细胞则明显增加（P〈0．01），细胞滞留在G1期。RT-PCR检测结果表明，经不同浓度维甲酸处理的各组细胞RARβ和p21mRNA表达水平均显著上调。结论9-顺维甲酸在一定浓度范围内对甲状腺鳞癌细胞株SW579有剂量依赖性的增殖抑制作用，其机制可能与提高SW579细胞RARβ基因的表达，进而再上调p21的表达有关。     

人工合成FGL多肽对大鼠PC-12细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨人工合成FGL多肽对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并人工合成FGL多肽。培养PC-12细胞,取生长状态良好者,分为对照组和实验组,实验组中加入FGL多肽溶液。对照组预先用多聚赖氨酸包被培养板。分别于培养1、3、5、7、9 d采用细胞活性检测试剂盒（CCK-8）检测两组细胞增殖情况。取PC-12,待细胞贴壁融合80%后,换无血清的培养基继续培养16 h。对照组加入H2O2刺激16 h。实验组先加入FGL多肽预孵育30 min,再加H2O2刺激16 h。流式细胞仪检测两组细胞凋亡情况;荧光定量PCR法检测PC-12中的核因子（NF）-κB mRNA。结果实验组培养1、3、5、7、9 d PC-12增殖数量均高于对照组;H2O2处理后,实验组PC-12凋亡数量及其中NF-κB mRNA的表达量均低于对照组（P均〈0.05）。结论人工合成FGL多肽可促进PC-12细胞增殖,并抑制其凋亡。     

生长因子分步诱导法在大鼠脂肪干细胞向神经细胞分化中的应用观察

目的：观察生长因子分步诱导法在大鼠脂肪干细胞（ADSCs）向神经细胞分化中的应用效果。方法取SD大鼠腹股沟及腹膜后脂肪,体外分离培养ADSCs,取消化、离心的第3代ADSCs,首先以DMEM／F12＋2％B27＋20 ng／mL EGF＋20 ng／mL bFGF的神经干细胞培养基诱导7 d,后以DMEM／F12＋1μmol／L RA神经诱导培养基诱导7 d。免疫荧光法鉴定分化后神经细胞特异标志物中神经细胞特异标志物巢蛋白（ Nestin ）、微管相关蛋白2（MAP2）、神经元核抗原抗体（NeuN）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。结果从大鼠脂肪组织中成功提取AD-SCs,其能够连续传代且稳定增殖;流式细胞检测显示CD34表达率为0．36％,CD73为99．17％,CD90为98．61％,CD105为96．20％。经生长因子诱导7 d后细胞聚集成球,Nestin高表达;14 d后MAP2、NeuN高表达,而GFAP低表达。结论 ADSCs能够稳定增殖传代,生长因子分步诱导可高效诱导ADSCs定向分化为神经细胞。     

三氯化镧对CBRH-7919细胞CDK4和P21蛋白表达的影响

目的 研究三氯化镧(LaCl3)对大鼠肝癌细胞CBRH-7919 CDK4和P21蛋白表达的影响.方法 实验分为3组,2个实验组:CBRH-7919细胞分别培养在含0.10和1.00 mmol/L LaCl3的DMEM培养液中,对照组:CBRH-7919培养在不含LaCl3的DMEM培养液中.培养时间分别为1、3、5d.采用MTT法观察细胞生长变化,同时观察集落形成情况,运用流式细胞术检测细胞周期变化,采用免疫细胞化学方法检测CDK4和P21的变化情况.结果 与对照组比较,0.10和1.00 mmol/L LaCl3组培养后3、5 d CBRH-7919细胞的OD值均明显下降(P＜0.01);集落形成数量明显减少(P＜0.01);G0/G1期细胞百分数显著增加,S期细胞百分数显著减少(P ＜0.01);CDK4阳性率明显下降,P21阳性率明显增加(P＜0.01).结论 LaCl3可通过下调CDK4及上调P21,使肿瘤细胞从G1期进入S期受阻,从而抑制CBRH-7919细胞生长.     

人肛瘘管壁成纤维细胞的体外分离培养和鉴定

通过组织块法分离并原代培养人肛瘘管壁组织，用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化成纤维细胞、上皮细胞，获得更加纯化的成纤维细胞；以DMEM培养液为基础培养蒸，添加胎牛血清（体积分数10％）、青霉素（100U／L）和硫酸链霉素（100U／L），置37℃、5％CO2培养箱中培养。倒置相差显微镜和细胞爬片HE染色。观察成纤维细胞形态结构，并对培养成纤维细胞行角蛋白、波形蛋白免疫细胞化学鉴定．结果分离后的成纤维细胞在第4～12h于体外快速贴壁，第2～4天进入对数期生长、增殖期。细胞起源鉴定波形蛋白免疫细胞化学染色为阳性，角蛋白免疫细胞化学染色为阴性。提示该方法所获得的肛瘘管壁成纤维细胞可在体外稳定培养，不含有杂质细胞。可为在细胞分子水平上研究肛瘘瘘管愈合的机制提供可靠的细胞模型。     

男性不育精浆弓形虫感染与生精细胞凋亡关系的研究

目的探讨男性不育精浆弓形虫感染与生精细胞凋亡及精子凋亡与男性不育关系。方法应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧核苷酸原位末端标记法(TUNEL)检测正常生育、不育男性精液中的生精细胞凋亡。结果男性不育精浆弓形虫感染组生精细胞凋亡率为(14．17± 7．16)％,显著高于男性不育弓形虫感染阴性组生精细胞凋亡率(12．22±6．18)％(P<0．05)。男性不育组精子凋亡发生率为(13．76±9．19)％,显著高于正常生育组男性精子凋亡发生率(4．28± 1．67)％(P<0．01)。结论精子凋亡与男性不育有着密切关系,弓形虫感染可引起生精细胞凋亡。     

一种简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法

背景：原代培养的人正常胃黏膜上皮细胞与体内姊妹细胞相似，是进行胃生理和病理研究的理想工具，但我国尚未见简便、可靠的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法的报道。目的：探讨简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法。方法：以胶原酶Ⅱ和分散酶磁性搅拌分离人正常胃黏膜上皮细胞。以甲基噻唑基四唑（M1Tr）比色法检测细胞活力，以观察细胞大体生长过程；以溴脱氧尿苷（BrdU）标记法检测S期细胞数量，以观察细胞微观增殖能力。以PAS染色鉴定胃黏膜上皮细胞黏原颗粒；以细胞角蛋白（CK）-18免疫荧光染色鉴定上皮细胞。以光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态结构。初步观察传代细胞的贴壁生长情况。结果：培养第2～3d．胃黏膜上皮细胞活力增幅最大．第4d达最高点，之后逐渐下降；BrdU孵育18h后，33．3％的细胞处于和曾经处于S期。接种密度高时，细胞PAS染色均呈紫红色，可见细胞核旁黏原颗粒；接种密度低时，仅成团细胞PAS染色呈阳性；培养第3d，绝大部分细胞CK-18阳性。接种第2d，胃黏膜上皮细胞成团簇状生长，增殖迅速，第4d后逐渐停止生长．第5d开始出现漂浮死亡细胞，最终完全被成纤维细胞取代；透射电子显微镜可见微绒毛、分泌颗粒、连接复合体等上皮细胞特征。传代胃黏膜上皮细胞增殖、铺展能力较原代细胞降低。结论：磁性搅拌酶分离培养可得到数量多、纯度高的人正常胃黏膜上皮细胞。     

瘦素促进人肝癌细胞Huh 7增殖活性的实验研究

目的观察瘦素对人肝癌细胞Huh7增殖活性的影响并初步探讨其可能的机制。方法在培养液中加入不同浓度的瘦素后，细胞计数并绘制生长曲线，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，Western blot法观察Cyclin D1蛋白的表达。结果细胞计数发现处理组的细胞数明显高于对照组；MTT法检测细胞增殖显示瘦素可以促进Huh7细胞的增殖。有一定的时间和剂量依耐性；流式细胞仪检测结果显示瘦素能明显降低G0／G1期细胞比例并提高s期细胞比例，细胞凋亡率也有明显降低；Western blot法显示瘦素（100ng／ml）处理24h后，Cyclin D1蛋白的表达明显增高。结论瘦素可以明显的促进人肝癌细胞Huh7的增殖，可能是通过提高Cyclin D1蛋白的表达来实现其作用。     

犬骨髓间叶干细胞的分离培养和生物学特性

目的 建立犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养、扩增与鉴定方法，了解其生物学特性，为心肌梗死、心力衰竭及缓慢性心律失常的干细胞移植提供细胞材料。方法 抽取犬骨髓液10ml，以DMEM1：1稀释，用1.063g／ml percoll密度分离液，以600g离心力、30min分离骨髓单个核细胞；以LG-DMEM及10% FBS添加100U／ml青霉素，100μg／ml链霉素，25μg／ml两性霉素B培养骨髓干细胞；利用细胞贴壁筛选法分离、培养、扩增骨髓间叶干细胞；应用干细胞表面标志蛋白检测，诱导剂诱导分化间叶组织细胞等方法进行犬骨髓间叶干细胞的鉴定。结果 分离出的犬骨髓单个核细胞约占细胞总数的10^-4～10^-6，在LG-DMEM与选择性血清培养基上生长良好。犬骨髓间叶干细胞孵育24h即可见细胞贴壁生长，贴壁细胞约占接种单个核细胞总数的10^-6。犬骨髓间叶干细胞增殖分裂迅速，38～48h内增殖多个细胞，约72h即可增殖形成大的细胞克隆，7～1Od即可布满瓶底。细胞融合时类似成纤维细胞，呈纺锤状，细胞小而密集，螺旋梳状排列。连续培育10代以上，未见细胞形态、增殖特性发生改变。未见骨髓间叶干细胞自发分化其它类型细胞，仍维持原代培养细胞的增殖特性。犬骨髓间叶干细胞的表面标志SH2阳性，CD45则阴性。在化学诱导液的作用下，犬骨髓间叶干细胞能定向分化为心肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞等多种间叶组织类型细胞。结论 密度梯度分离法与贴壁筛选法能较好地进行犬骨髓间叶干细胞的体外分离、培养与扩增，犬骨髓间叶干细胞具备易于分离培养，巨大增殖潜力，独特细胞表型，多系分组能力等细胞生物学特性。为心肌梗死、心力衰竭与心律失常的细胞移植修复治疗提供了理想细胞材料。     

花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞的抗衰老研究

本研究选用体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS株)作为抗衰老研究体外模型,从30代开始在培养液中加入花粉精为实验组,加入氢化可的松为阳性对照组,不加任何药物为空白对照组。结果表明,加入花粉组传至80代,空白对照组细胞传至64.5代,阳性对照组传至72代。花粉组细胞的生长形态和增殖速度均优于对照组。本研究证明,花粉对体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞有抗衰老作用。     

刚地弓形虫感染对雄性大鼠生殖激素及其受体影响的动态观察北大核心CSCD

目的观察雄性大鼠慢性感染弓形虫后血清及睾丸局部促黄体生成素（LH）、睾酮（T）水平及其受体的动态变化,探讨弓形虫感染对大鼠生精细胞损伤及生精过程的影响。方法选用9～10周龄雄性SD大鼠88只,随机分为对照组和弓形虫感染组。弓形虫感染组大鼠腹腔注射1×10^4个速殖子/只。对照组注射等量生理盐水。于感染前和感染后第3、6、9、12、……和30d两组各取4只大鼠,采用放射免疫法检测大鼠血清LH、T以及睾丸局部T水平的动态变化,采用免疫组化sABC法检测睾丸LH受体（LHR）和T受体（AR）的变化,并对睾丸组织进行病理学观察。结果整个实验期内弓形虫感染组大鼠血清LH[（29．3±3．3）mIU／m1]与对照组[（25．5±2．75）mIU／ml]差异无统计学意义（P〉0．05）;感染组大鼠T水平尤其是睾丸局部T水平在急性期[（238．3±38．9）ng／d1]较对照组[（915．4±119．3）ng／dl]显著下降（P〈0．01）,之后血清T逐渐升高,实验末期恢复至对照组水平（P〉0．05）,睾丸局部T仍维持低水平（P〈0．01）。感染组大鼠的睾丸间质细胞（leydig cell）LHR及AR表达均增强,精母细胞及支持细胞AR表达增强。病理学检查感染组大鼠卡精小管细胞层次混乱,精子细胞及精子减少甚至管腔关闭,至实验末期生精过程末见明显改善。结论雄性大鼠感染弓形虫后导致T水平尤其是睾丸局部T水平迅速降低,睾丸LHR及AR表达增强,导致生精细胞损伤和生精过程阻滞于精母细胞期。