构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的:探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法:实验于2005-05/11在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm,缝接入20mm硅胶管中,形成神经再生室。7d后重新打开伤口,刨开硅胶管,截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只,无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果:①两组培养的细胞光镜观察结果:实验组的许旺细胞密度高于对照组,特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个/mm,而对照组密度不足200个/mm。②两22组许旺细胞免疫组织化学染色:实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为(98.0±1.2%,对照组许旺细胞的纯度为(93.0±2.1)%(P<0.05)③)而。两组细胞的生长曲线:培养7d,实验组细胞数量较对照组明显增加,达到(49.6±3.5)×10L-1,远高于对照组的(31.7±3.9)×10L。77-1结论:从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞,为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

许旺细胞体外培养纯化的观察

目的：许旺细胞能分泌生长因子，在周围神经再生中起重要作用，获得高纯度许旺细胞是对其研究的重要前提，为此探讨获得高纯度的SD乳鼠的许旺细胞的有效方法。方法：组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法。结果：经组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用，所得许旺细胞的纯度很高，可达98％以上，而且细胞所受到的外界因素影响也较少。结论：通过体外培养方法得到高纯度且受到的外界因素影响小的许旺细胞，可采用组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用的方法。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

许旺细胞及其与三维支架的联合培养

目的:许旺细胞能够促进损伤的周围神经的再生过程。应用许旺细胞与组织工程材料联合培养,构建人工神经修复周围神经损伤,具有广阔的应用前景。因此,探讨许旺细胞的培养方法以及许旺细胞与三维支架的联合培养对组织工程化人工神经的构建具有重要意义。资料来源:应用计算机检索Medline1984-01/2004-01中有关许旺细胞培养以及组织工程材料的文章,检索词为“Schwanncellsculture,tissuengineeringmaterials,associationculture”,并限定文章语言种类为“English”;同时应用计算机检索中文期刊全文数据库和万方数据库199601/2004-12中有关许旺细胞培养以及组织工程材料的文章,检索词为“许旺细胞培养,组织工程材料,联合培养”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,重点选择介绍许旺细胞培养方法以及许旺细胞与三维支架联合培养的文献,对非随机试验予以排除。资料提炼:在所有检索到的文献中,排除非随机试验的文献以后,最终选择24篇最为相关的作为参考文献。其中有1篇重点介绍许旺细胞的作用,5篇重点介绍许旺细胞的培养方法,其余的主要研究许旺细胞与三维支架的联合培养。资料综合:许旺细胞的培养方法包括组织块法和酶消化培养法。可与许旺细胞进行联合培养的支架材料包括聚酯纤维、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物、ZQ膜、壳聚糖等等。这些支架材料为人工神经的构建提供了丰富的原料,为应用组织工程化人工神经修复受损的周围神经奠定了基础。结论:应用组织块法和酶消化培养许旺细胞的技术已经基本成熟。对于那些可与许旺细胞进行联合培养的支架材料的研究,应当尽快由现今单纯的体外培养逐渐向动物实验过渡,为早日研制出合格的人工神经做进一步的努力。     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37℃超过30min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。方法：采用4℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×106,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景:常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37℃超过30min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。目的:探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。方法:采用4℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。结果与结论:结果得到的细胞数量超过1×106,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

新生和成年大鼠雪旺细胞培养、纯化的实验研究

目的：比较新生和成年大鼠雪旺细胞（Schwann cells，SCs）的体外培养和纯化方法。方法：分别取新生和成年SD大鼠的坐骨神经，用混合酶消化法、差速贴壁法和低浓度胰酶快速消化法进行培养和纯化，通过形态学观察和S-100免疫细胞化学鉴定，并行MTF法检测细胞增殖能力。结果：两组细胞生长状态良好，均呈S-100免疫细胞化学反应阳性，纯度均达95％以上；由生长曲线显示新生鼠SCs生长更快，第2代SCs倍增时间：新生鼠3d、成年鼠4d。结论：从新生和成年大鼠坐骨神经能成功分离培养出大量高纯度的SCs，新生鼠SCs增殖能力更强。     

兔坐骨神经电损伤后许旺细胞的增殖变化

目的:观察成年兔坐骨神经受到75V电压损伤后受损区域许旺细胞的变化。方法:实验于2004-10/2005-01在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成。选择中国本兔12只,随机分2组:损伤组9只,正常对照组3只,损伤组观察点为损伤后第3天,第7天,第10天,每个时间点3只。建立兔坐骨神经电损伤实验模型,应用双酶消化法分离受损区域神经许旺细胞,应用细胞计数和同位素3H掺入胸腺嘧啶核苷观察许旺细胞的增殖变化情况。结果:12只中国本兔均进入结果分析。与正常对照组的细胞数(1.0±0.15)×104个/mL比较,成年兔在受到损伤后第3天细胞逐渐增多,为(3.2±0.85)×104个/mL,第7天明显增殖,达到(12±2.40)×104个/mL,第10天增殖情况较前下降,为(5.4±0.70)×104个/mL。相应的3H掺入实验结果表现出同样的变化特征。结论:许旺细胞在神经的溃变和再生过程中,大量增殖,在第7天左右达到其生长和增殖的高峰,而后呈下降趋势。证明许旺细胞在受到一定程度的电压损伤后,依然具有分裂增殖的能力,而它的增殖是受损神经结构和功能恢复的基础。     

微囊化成年兔许旺细胞的体外培养

背景:研究发现将体外培养扩增的大量许旺细胞种植到神经导管上来引导周围神经再生效果明显,而目前备受关注的微囊化免疫隔离技术,在克服免疫排斥问题上具有明显的优势与实用性.目的:微囊包裹兔许旺细胞并进行体外培养,观察许旺细胞形态及增殖变化.设计、时间及地点:体外细胞水平观察实验,于2005-09/2006-05在南昌大学第二附属医院分子实验室完成.材料:健康成年家兔由南昌大学医学院动物中心提供,微囊发生器由南昌大学医学院神经生物学研究室研制.方法:使双侧坐骨神经发生Wallerian变性,经改良后反复差速贴附法进行培养,快速分离纯化许旺细胞.海藻酸钠-氯化钡一步成囊法包裹生长良好的第3代许旺细胞.主要观察指标:倒置显微镜下观察培养过程中微囊化许旺细胞形态变化,MTT检测不同时期微囊化许旺细胞及游离许旺细胞的增殖改变.结果:在培养过程中可见微囊及其囊内许旺细胞形态均保持完整,微囊未见破损.微囊化后的许旺细胞总体呈现悬浮生长的趋势.培养0,1,3,5,7 d时MTT检测微囊许旺细胞组与游离许旺细胞组吸光度值差异有显著性意义(P＜0.05).结论:微囊包裹的许旺细胞体外可存活较长时间,微囊化许旺细胞相比游离许旺细胞增殖速度有所减慢.     

不同培养基和不同体积分数小牛血清对许旺细胞生长状态的影响

背景：许旺细胞目前正越来越多地被运用于神经修复、构建载体细胞等,但如何高效快速地培养扶取大量许旺细胞尤为关键。传统方法存在细胞培养周期长、污染率高、生长状况不稳定等不足。 目的：观察比较不同培养基和培养基中不同体积分数血清对许旺细胞的生长、增殖能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008—01／07在昆明医学院神经科学研究所完成。材料：SPF级新生一两天龄ICR小鼠30只,由昆明医学院动物科提供。DMEM／F12培养液、RPMJ1640培养液、L-DMEM培养液为Gibco公司产品,小牛血清为Hyclone公司产品。 方法：取ICR新生小鼠,无菌条件下取出坐骨神经,组织块消化法体外分离培养许旺细胞,设立4组：DMEM／F12培养液组、RPMI1640培养液组、L-DMEM培养液组、生理盐水组。每组又分为4个亚组：不含血清、含体积分数为10％,15％,20％小牛血清。各组细胞接种后进行传代培养。使用差速贴壁和阿糖胞苷处理的综合法对许旺细胞进行纯化。 主要观察指标：传代培养后1,3,5,7,9,11,13d,相差显微镜下观察细胞形态及生长情况,免疫细胞化学染包检测细胞纯度。MTT法绘制细胞生长曲线。结果：①不含血清时,各组许旺细胞生长状态均较差：添加血清后各组许旺细胞消化传代后6h即大量贴壁,48h后出现聚合增殖现象。②含血清的DMEM／F12培养液组、RPMI1640培养液组、L—DMEM培养液组许旺细胞能较好地生长,纯度均达到90％以上,且DMEM／F12培养液组在细胞纯度、细胞总数方面均略优于RPMI1640培养液组及L—DMEM培养液组;生理盐水组许旺细胞生长欠佳,纯度也不甚理想。③与生理盐水组比较,DMEM／F12、RPM／1640及L—DMEM培养液组MTT吸光度值均显著升高（F=92．814,P〈0．05）,但此3种基础培养基之间比较无明显差异（F=0．909,P〉0．05）。培养1,3,5,7,9,11,13d,DMEM／F12、RPM11640及L．DMEM培养液组在含不同体积分数小牛血清的条件下MTT吸光度值均存在明显差异（F=50．850,P〈0．05）,体积分数为15％时许旺细胞数量最多,且纯度也相列最高。 结论：血清体积分数的变化是许旺细胞培养过程中是主要因素,含体积分数为15％小牛血清血清的DMEM／F12培养液培养许旺细胞效率最高。     

新生大鼠许旺细胞体外培养纯化的最佳培养条件

背景:许旺细胞对促进外周神经的生长,发育和修复有重要作用,目前对于许旺细胞体外培养方法的优劣情况报道不一.目的:筛选许旺细胞最佳体外培养条件.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/10在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:三四天龄SD大鼠24只,由武汉大学医学部实验动物中心提供.方法:无菌剥离大鼠双侧坐骨神经,应用低浓度酶快速消化法、差速贴壁法分离培养纯化许旺细胞.取处于指数生长期的细胞,调整密度为1×107 L-1接种到6孔培养板,然后分组实验.设定4个条件:培养基pH(6.8～8.8)、胎牛血清体积分数(2%～20%)、培养箱温度(34～39℃)、培养箱CO2浓度(3%～8%).首先固定胎牛血清体积分数、培养箱温度和培养箱CO2浓度,改变培养基pH对细胞进行培养,从而确定最适培养基pH.然后依次改变胎牛血清体积分数、培养箱温度以及培养箱CO2浓度,进而得到其他3个指标的最佳值.镜下观察见明显克隆形成时终止培养,以含5个以上细胞的细胞团作为1个克隆,在倒置显微镜下进行克隆计数.主要观察指标:通过许旺细胞长势及克隆形成情况,筛选许旺细胞体外培养扩增的最适pH、胎牛血清体积分数、培养温度和培养箱CO2浓度.结果:在以DMEM/F12(1:1)为基础培养基的情况下,培养基pH为7.0～7.2时克隆形成最多,＜7.0或＞7.2时克隆形成明显下降:胎牛血清体积分数为10%许旺细胞长势较好且克隆数明显增加,当血清浓度过高或过低时克隆形成相对较差;34～36℃细胞生长受到明显抑制,克隆形成较少,37℃时克隆形成最多,＞37℃细胞长势开始变差,克隆形成下降,至39℃时细胞已无法贴壁民;培养箱CO2浓度为3%～8%时许旺细胞克隆形成无明显变化.结论:许旺细胞体外培养的最佳条件为pH7.2的DMEM/F12(1:1)细胞培养基、胎牛血清体积分数10%、培养箱温度37℃、培养箱CO2浓度5%.     

许旺细胞的体外培养提纯

许旺细胞是组织工程修复神经损伤的种子细胞,能否获得大量且高纯度的许旺细胞对于组织工程学至关重要.许旺细胞的培养纯化技术日趋完善,其经典的培养方法有植块法和酶消化法,在此基础上改进的去除成纤维细胞的方法有差速贴壁法、免疫选择法、阿糖胞苷补充法、刺激因子增殖法等.最近比较新的提纯方法有磁性活细胞分离法、层粘连蛋白纯化法、三维支架联合培养法.另外还有一些因子,如胎牛血清浓度等影响许旺细胞的扩增.这些技术的主要目的就是在体外获得大量的高纯度许旺细胞,以满足组织工程修复神经的需要.许旺细胞的体外培养和提纯方法众多,且已取得初步进展,但在此技术完全成熟之前尚还有许多问题有待解决,如周期长、细胞活性低、在传代培养中细胞生物学特性不稳定等.     

体外纯化乳鼠许旺细胞的4种方法比较(英文)

背景:许旺细胞是外周神经系统中修复神经损伤及神经疾病的主要种子细胞之一.但是,许旺细胞的来源有限,且由于成纤维细胞的污染,使许旺细胞的纯度受到影响.有学者提出了其他的纯化方法,但每种方法都存在其不足之处而不能很好的满足临床应用的需要.目的:比较差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法4种体外纯化乳鼠许旺细胞方法的差异.方法:取SD大鼠坐骨神经得到所需神经组织.分别用差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法纯化许旺细胞.比较4种方法获得细胞的活力,免疫组织化学法鉴定许旺细胞并计算纯度.结果与结论:差速贴壁消化法所得到的细胞纯度稍低,活力尚可;冷喷注法获得的细胞纯度和活力均较高;磁珠分选法获得的细胞纯度和冷喷注法相当,但是活力稍差:G418筛选法活力差,纯度高.     

成年大鼠与新生鼠嗅鞘细胞形态学和生长特性的差异研究

目的:对成年大鼠和新生鼠嗅鞘细胞的形态学和生长特征的差异进行观察.方法:使用相同培养纯化方法分别培养成年大鼠和新生鼠嗅球表层中的嗅鞘细胞,NGFRp75免疫组化染色鉴定细胞并观察不同时期两者嗅鞘细胞的形态差异和生长速度.结果:均可获得较高纯度的嗅鞘细胞,但两类细胞在生长特征和形态学上略有差异结论:成年大鼠和新生鼠嗅鞘细胞形态学和生长特征有差异.     

新生兔雪旺细胞体外培养及纯化的实验研究

目的优化雪旺细胞(SCs)的体外培养条件,在去除成纤维细胞(FCs)沾染后,应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进SCs的增殖以获取大量、纯净SCs应用于神经组织工程。方法采用高浓度胶原酶分次消化分离SCs,使用阿糖胞苷、Geneticin去除FCs,待基本为纯净的SCs后,再用bFGF促进其分裂增殖。结果经S-100染色鉴定,SCs纯度可达到98%以上。结论文章所用的方法是培养和促进SCs增殖较为理想的方法。     

双重消减纯化体外培养许旺细胞

背景: 许旺细胞培养技术和纯化方法虽不断改良, 得到的培养物纯度仍然有限, 双重消减法是否可以培养高纯度许旺细胞。目的: 采用双重消减法对许旺细胞进行培养, 观察其生长情况并测定培养纯度。设计:对照动物实验。单位:首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科,北京市耳鼻咽喉科研究所。材料:实验于2006-03/07在北京市耳鼻咽喉科研究所免疫室和病理室完成。选用20只3天龄Wistar大鼠,雌雄不限,由中国医学科学院实验动物中心提供。方法:分离大鼠坐骨神经,以0.2%胶原酶消化后培养。①分组干预:细胞分为实验组及对照1,2,3组,每组5只。实验组应用双30min差速贴壁法和Ara-c纯化,对照组1,2分别用双30min差速贴壁法和Ara-c纯化处理,对照组3不进行纯化。②实验评估:倒置显微镜下观察许旺细胞生长情况;采用MTT法测量实验组和对照组3生长曲线,观察细胞增殖能力;采用免疫细胞化学染色对许旺细胞进行鉴定;计算许旺细胞培养纯度(每个视野S100阳性细胞占所有细胞的比例)。主要观察指标:①各组许旺细胞生长情况。②免疫细胞化学染色结果。③细胞生长曲线。④许旺细胞培养纯度。结果:①许旺细胞生长情况:培养5d时实验组许旺细胞形态及增殖能力良好,偶见成纤维细胞。对照组1、2在培养第5天时可见较多成纤维细胞,许旺细胞形态好,但较少呈漩涡状排列的生长区域。对照组3从培养第2天开始成纤维细胞迅速增殖,所占比例逐渐增大,许旺细胞生长受到影响,突起较短,少见漩涡状生长区域。②许旺细胞生长曲线:实验组许旺细胞于第3天进入对数增殖期,至第6天达平台期。对照组3较实验组提前1d进入对数增殖期。③免疫细胞化学鉴定结果:实验组经抗S100抗体染色,阳性的许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,梭形或三角形,双极突起,漩涡状排列。成纤维细胞形态不规则,胞浆宽大,着蓝色。④许旺细胞计数:实验组S100阳性细胞所占比例高于对照组3(P<0.01)。结论:利用双重消减法得到较高纯度的许旺细胞培养物。     

核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在成年大鼠坐骨神经许旺细胞的分布

目的观察核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在成年大鼠坐骨神经许旺细胞的表达,并分析二者之间的关系及意义.方法实验于2005-01/06在重庆工学院生物工程学院及第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成.随机取成年雄性SD大鼠6只,体质量200～250 g.1%戊巴比妥钠(20～40 mg/kg)腹腔麻醉后打开胸腔,用4%多聚甲醛溶液经左心室灌注后,取左侧坐骨神经,采用p65和p50(由p65和p50两个亚基组成的异源二聚体在核因子κB组成中发挥主要功能)及抑制蛋白ⅠκBα的多克隆抗体进行免疫组织化学染色,检测核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在正常成年大鼠坐骨神经许旺细胞的表达及分布.结果①p65和p50在坐骨神经许旺细胞胞浆中表达均很弱,胞核中则不表达.②ⅠκBα则在胞浆中有较强的表达,胞核中不表达.结论核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在正常成年大鼠坐骨神许旺细胞经均有一定程度的表达,在胞浆中前者表达较弱,后者较强,二者在胞核中均不表达.