水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化

目的 将北京水痘-带状疱疹病毒(VZV)84-7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中表达,并对其表达产物进行纯化。方法 采用PCR方法从VZVDNA中扩增gpI全基因序列,并将其插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9中,获得重组转移质粒pBacVZVgpI,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序。重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6DNA(Bsu36Idigested)共转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒BacPAK-gpI。通过亲和层析纯化重组蛋白,并检测其抗原性。结果 PCR扩增得到gpI基因,测序结果表明克隆的外源基因正确。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、免疫印迹(weotem-blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物在培养72h达到高峰,重组蛋白的相对分子质量约为58000和70000,与理论值相符,蛋白质加工与天然蛋白类似。动物实验结果表明,重组蛋白具有较好的免疫原性,可刺激小鼠产生中和抗体。SDS—PAGE检测纯化的重组蛋白,纯度达80％。纯化蛋白经western-blot和ELISA检测后显示,具有特异的抗体结合活性。结论 应用昆虫细胞表达水痘-带状疱疹病毒gpI基因,可为水痘-带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础。     

汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的从国内生产肾综合征出血热（HFRS）疫苗Z10株中克隆汉坦病毒核蛋白基因,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达,制成抗原片,用于检测血清中汉坦病毒抗体.方法从汉坦病毒Z10株感染细胞上清液中提取病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增S基因,与穿梭质粒连接并转化大肠杆菌,得到重组穿梭质粒.将其转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌,筛选出含S基因的重组杆状病毒DNA的大肠杆菌,提取重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞,应用ELISA法及间接免疫荧光法检测重组蛋白的抗原性.结果用RT-PCR方法扩增得到S基因,筛选出的重组杆状病毒感染细胞sf9,制成抗原片.此抗原片仅与HFRS阳性患者血清起反应,而与正常人及其它发热患者血清不起反应.检测浙江省各医院送检的97份疑似肾综合征出血热患者血清及36份正常人血清,与传统的抗原片比较,阳性符合率为100%.结论可以应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达汉坦病毒重组蛋白.以此制备的抗原片,可用于患者血清中汉坦病毒抗体检测,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,为诊断肾综合征出血热提供新的途径和手段.     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白在昆虫细胞中的表达

目的 构建HPV16型晚期蛋白重组杆状病毒,并使其在昆虫细胞中获得高效表达.方法 首先用线性化的杆状病毒DNA与重组杆状病毒转移质粒共转染sf9昆虫细胞进行同源重组,获得2株重组杆状病毒.结果 经鉴定该重组病毒中有目的DNA存在且可表达晚期蛋白;电镜观察发现重组杆状病毒感染的sf9细胞核内有乳头瘤病毒VLPs.结论 HPV16型晚期蛋白在昆虫细胞中的成功表达为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础.     

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV）Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体，探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCm—Z10M为模板设计引物，用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段，将G2片段克隆入pUCm—T质粒载体，碱法提取质粒pUCm-Z10-G2，酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa，构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2，重组体转化感受态细胞E．coli DH10Bac后，经2轮筛选，提取重组质粒转染昆虫细胞sf9，并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒，转染昆虫细胞表达出G2蛋白，与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应，昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清，与全病毒细胞抗原片的符合率为95％。结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体，并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

戊型肝炎病毒基因Ⅳ型病毒样颗粒的表达和抗原性分析

目的表达戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅳ型(G4)结构蛋白ORF2截短的基因片段,观察病毒样颗粒(VLP)的装配情况,对纯化的VLP进行抗原性分析。方法为了制备HEV病毒样颗粒,将结构蛋白ORF2的N末端111个氨基酸残基截掉,然后将112至660共549个氨基酸残基的基因与杆状病毒基因重组,在昆虫细胞Tn5表达。首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳和WesternBlotting检测基因是否正确表达,再用超速离心检测是否形成病毒样颗粒,最后用免疫电镜和ELISA分析病毒样颗粒的抗原特异性。结果含有截掉了N末端111个氨基酸残基的HEVG4的ORF2基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞Tn5,除了可以表达最初的产物(相对分子质量为58×103的蛋白分子)外,也产生了一些可能经过宿主细胞酶类处理的蛋白分子,相对分子质量分别为57×103、56×103和54×103,并分泌到培养液中。经超速离心和密度梯度离心,电镜观察发现只有54×103的蛋白分子可以自行组装成VLP,颗粒直径为23~24nm,浮密度为1·285g/cm3,与HEVG1比较,G4VLP具有相同的大小和浮密度,但表达量低。G4VLP与HEV病人血清可以发生抗原抗体反应,用G4VLP作抗原可以检测HEV的G1、G3、G4型特异性IgM和IgG抗体。结论该研究证实截短的HEVG4的ORF2结构蛋白基因可以在重组杆状病毒表达系统高效表达。形成的VLP具有HEV病毒颗粒类似的抗原活性,可用于制备抗HEV诊断试剂和开发预防用疫苗。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白免疫优势肽段在杆状病毒表达系统的表达及其反应原性

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对单纯疱疹病毒II型(HSV-2)糖蛋白G(gG-2)免疫优势片段gG321-580进行表达,纯化并评价其反应原性,以探索HSV-2免疫诊断试剂的研制。方法提取HSV-2DNA作为模板,PCR扩增gG321-580基因,克隆至pFastBac HTC载体中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gG321-580融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达产物,NTA-Ni 2+纯化后间接ELISA评价其反应原性。结果 HSV-2gG321-580在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组gG321-580蛋白对HSV-2阳性血清抗体有较好的抗原性和特异性。结论 gG321-580蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达,表达产物表现出良好的反应原性,为发展HSV-2免疫诊断试剂奠定了基础。     

狂犬病毒糖蛋白基因在原核系统中的表达及纯化

[目的]选取狂犬病毒糖蛋白富集表位基因片段进行克隆、表达和纯化,以期获得能应用于血清学诊断的纯化重组蛋白。[方法]从狂犬病毒感染的Vero细胞上清液中提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增CTN株糖蛋白表位富集区基因片段,与表达载体pPROEX HTb连接,构建重组表达载体,在BL21（DE3）中表达,重组蛋白经Western blot鉴定活性,最后用电洗脱法纯化重组蛋白。[结果]重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,Western blot结果显示,重组蛋白具有免疫活性,用电洗脱法纯化后的重组蛋白具有较高的纯度,测定蛋白含量为1.07 mg/ml。[结论]狂犬病毒糖蛋白富集表位基因片段能在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白具有免疫活性,并可通过电洗脱法纯化,为狂犬病疫苗免疫血清抗体检测试剂的研制奠定了基础。     

卵巢癌相关基因HE4在杆状病毒表达系统的表达与鉴定

目的:使卵巢癌相关基因HE4在杆状病毒表达系统中获得表达。方法:将卵巢癌相关基因HE4克隆到pMagic-his-HE4中,通过转化E.coliDH10B筛选克隆,阳性克隆通过接合转移的方式与杆状病毒框架质粒体外重组,构建Bac-phes-HE4杆状病毒表达载体,后者经Lipofectamine2000介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定表达蛋白。结果:经HE4抗体、6×His单抗鉴定,成功通过杆状病毒表达系统获得重组卵巢癌相关基因HE4。结论:卵巢癌相关基因HE4通过接合转移的方法在杆状病毒表达系统中成功表达。     

SARS荧光免疫诊断技术研究

目的应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS核蛋白基因,产生无感染性的核蛋白抗原,利用此蛋白制备抗原片,用于检测血清中SARS特异性抗体.方法从非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS核蛋白基因片段,将核蛋白基因插入杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染昆虫细胞,收获细胞,经丙酮固定,制成SARS抗原片,建立了SARS荧光免疫方法(IFA).结果用此抗原片检测多份血清,仅与SARS病人血清起反应,而与正常人及其它发热病人血清不起反应.结论利用该方法制备抗原片,不需要P3实验室,操作简便,为诊断与研究SARS提供了方便而安全的方法.     

对医院护理管理队伍建设的几点思考

文章分析了当前医院护理管理队伍存在的主要问题：知识结构不合理；专业思想不纯正；接受继续教育不足：工作效能低下。提出了建设高素质护理管理人才队伍的思路：严格标准，搞好选才；加强思想教育和引导；加大培养力度；建立科学考评和激励机制；完善人才合理流动措施；合理编制，突出效率。     

医学科技成果信息资源网络开放利用的原则探析

医学科技成果信息资源网络开放利用，为资源的开放共享创造了良好条件，它使医学科技信息得到了高效传播和最大利用。网络开放利用医学科技成果信息资源，利用的主体和核心是其信息内容。信息内容是网络用户从中提取知识和所需资料的主要来源，同时也是信息破坏者发动攻击的主要目标之一，因而，信息内容的安全是信息安全的基本问题，主要包括信息内容的规范性、完整性与真实性、知识产权保护与利用的合理性等。要做好这些工作，应该遵循相应的原则和要求。     

政府公共财政支出分配公平性研究进展

政府公共财政支出是社会再分配的一种形式，其目的是促进社会公平。因此，政府的公共财政支出应该具有较强的目标针对性，应该向社会贫困人群倾斜，使其从中受益。本文通过查阅国内外政府公共财政支出分配公平性的相关文献资料。阐述了相关研究的进展情况，井着重探讨了政府公共财政支出分配公平性的内涵、研究范围、测算方法和研究意义。以及实际研究中存在的问题，最后提出我国政府公共财政支出分配公平性的研究方向和需要进一步完善的地方。     

长春新碱过量引起严重毒副反应1例的护理体会

报道1例霍奇金淋巴瘤患者因误用长春新碱（VCR）10mg一次性静脉推注后治疗护理情况。其出现间断性神志恍惚、眼睑闭合不全、言语不清、口腔黏膜糜烂、全身疼痛、麻痹性肠梗阻、尿潴留、手足麻木等症状,经积极解救,禁食,持续胃肠减压、胃管内注入麻油、开塞露、生理盐水灌肠,合理应用肠外营养,注重疼痛、心理护理,做好口腔、肛周护理,预防感染加重,患者病情得到控制好转出院。