SPHK1在调节小细胞肺癌多药耐药中的作用

背景与目的小细胞肺癌约占全部肺癌的15%,化疗是其主要的治疗方法之一,虽然早期对一线化疗方案敏感,但极易出现多药耐药而导致治疗失败。前期基因芯片发现SPHK1与小细胞肺癌的耐药性相关,本研究进一步探讨SPHK1在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法首先通过QRT-PCR和Western blot从基因和蛋白水平检测化疗敏感细胞株H69及多药耐药细胞株H69AR中SPHK1的差异表达;转染siRNA下调H69AR细胞中的SPHK1的表达,通过CCK8检测细胞对各种化疗药物（ADM, DDP, VP-16）的敏感性变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的变化。同时收集小细胞肺癌化疗前组织和血液标本,将其分为化疗敏感组和耐药组,QRT-PCR检测小细胞肺癌患者血液标本中SPHK1的表达,免疫组化法检测小细胞肺癌患者组织标本中SPHK1的表达,分析SPHK1与小细胞肺癌患者预后相关性。结果 SPHK1在耐药细胞H69AR中的表达明显高于H69,下调H69AR中SPHK1的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,促进细胞的凋亡,细胞周期发生G0/G1期阻滞,SPHK1在小细胞肺癌耐药患者中的表达较敏感患者明显增加,SPHK1的表达与患者的性别、年龄无关,与疾病的分期、对化疗的敏感性及生存时间密切相关,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 SPHK1参与调节小细胞肺癌多药耐药,SPHK1可作为评估小细胞肺癌化疗敏感性及临床预后的潜在靶基因。     

FZD1基因对小细胞肺癌多药耐药作用研究

目的:探讨FZD1在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法:运用QRT-PCR和蛋白质印迹法,分别从基因和蛋白水平检测小细胞肺癌敏感细胞株H69及耐药细胞株H69AR中FZD1的差异表达,同时运用QRT-PCR检测化疗敏感及耐药患者血液标本中FZD1的差异表达;采用siRNA抑制耐药细胞株H69AR中FZD1的表达,通过CCK8检测细胞对各种化疗药物(ADM,DDP,Vp-16)敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果:无论是基因水平还是蛋白水平,FZD1在H69AR细胞中的表达明显高于H69细胞,差异有统计学意义,P值分别为0.003和<0.001;FZD1在化疗耐药患者血液标本中的表达较化疗敏感者明显增高,差异有统计学意义,P<0.001。下调H69AR细胞株中FZD1的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,差异有统计学意义,P=0.020;H69AR细胞组的凋亡率为(2.037±0.49)%,较H69细胞组(9.63±0.67)%明显降低,差异有统计学意义,P=0.002。下调H69AR细胞中FZD1的表达后,H69ARSi-FZD1组细胞的凋亡率为(17.093±0.904)%,明显高于空白对照H69AR及阴性对照H69AR-NC组的(2.25±0.967)%,差异有统计学意义,P=0.007。结论:FZD1参与调节小细胞肺癌的多药耐药,下调FZD1基因的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,FZD1可能通过抑制细胞凋亡而影响小细胞肺癌的多药耐药。     

FZDl基因对小细胞肺癌多药耐药作用研究

目的：探讨FZDl在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法：运用QRT—PCR和蛋白质印迹法,分别从基因和蛋白水平检测小细胞肺癌敏感细胞株H69及耐药细胞株H69AR中FZDl的差异表达,同时运用QRT—PCR检测化疗敏感及耐药患者血液标本中FZDl的差异表达;采用siRNA抑制耐药细胞株H69AR中FZDl的表达,通过CCK8检测细胞对各种化疗药物（ADM,DDP,Vp-16）敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果：无论是基因水平还是蛋白水平,FZDl在H69AR细胞中的表达明显高于H69细胞,差异有统计学意义,P值分别为0．003和〈0．001;FZDl在化疗耐药患者血液标本中的表达较化疗敏感者明显增高,差异有统计学意义,P〈O．001。下调H69AR细胞株中FZDl的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,差异有统计学意义,P=0．020;H69AR细胞组的凋亡率为（2．037土0．49）％,较H69细胞组（9．63±0．67）％明显降低,差异有统计学意义,P=0．002。下调H69AR细胞中FZDl的表达后,H69AR—Si—FZDl组细胞的凋亡率为（17．093±0．904）％,明显高于空白对照H69AR及阴性对照H69AR—NC组的（2．25±0．967）％,差异有统计学意义,P=0．007。结论：FZDl参与调节小细胞肺癌的多药耐药,下调FZDl基因的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,FZDl可能通过抑制细胞凋亡而影响小细胞肺癌的多药耐药。     

miR-181d 对小细胞肺癌化疗药物敏感性的影响

目的:探讨miR-181d 在调节小细胞肺癌化疗敏感性中的作用。方法:通过QRT-PCR和Westernblot检测小细胞肺癌敏感细胞株H 69及耐药细胞株H 69AR中miR-181d 的差异表达。上调H 69AR细胞中的miR-181d 表达,检测miR-181d 和BCL 2表达;通过CCK 8 检测细胞对各种化疗药物（ADM、DDP 、VP- 16）的敏感性变化,QRT-PCR检测87例小细胞肺癌组织标本中miR-181d 表达,所有患者均接受EP方案（依托泊苷＋顺铂）化疗,分析其与患者预后及生存时间的关系。结果:miR-181d 在H 69AR及对化疗耐药患者中呈低表达,同时伴随着BCL 2 高表达（P < 0.001）。 上调miR-181d 能降低BCL 2 表达水平,增加H 69AR细胞对化疗药物（ADM、DDP 、VP- 16）的敏感性（P < 0.01）。 miR-181d 的表达与肿瘤的分期、对化疗药物的敏感性及生存时间相关（P <0.001）,高表达miR-181d 的患者总生存时间（OS）和无进展生存时间（DFS）较低表达者延长（P < 0.001）。 结论:miR-181d 可能在小细胞肺癌多药耐药中发挥着重要的作用,miR-181d 可望作为评价小细胞肺癌疗效的预测指标。      

miR-143/145基因簇调控小细胞肺癌耐药性的研究

目的 探讨miR-143/145基因簇在调控小细胞肺癌耐药性中的作用。方法 首先通过RT-PCR检测小细胞肺癌敏感细胞株（H69）和耐药细胞株（H69AR）中miR-143/145簇的差异表达;然后通过转染miR-143/145簇的模拟体（mimics）或抑制物（antagomir）增加或阻断细胞内miR-143/145的水平,通过CCK8和流式细胞技术观察细胞对化疗药物（如ADM、DDP、VP-16）敏感度的变化以及miR-143/145mimic和antagomir对细胞周期和凋亡的影响。结果 miR-143/145簇在H69AR细胞株中表达较H69明显增高;miR-143/145簇mimics能增加miR-143/145的表达,细胞周期发生G2/M期阻滞,细胞凋亡减少,抗凋亡蛋白BCL2的表达增加,从而引起细胞对化疗药物产生耐药;而miR-143/145簇antagomir作用与mimics相反。结论 miR-143/145簇可能通过减少细胞的凋亡从而引起小细胞肺癌耐药。     

miR-135a在调节小细胞肺癌多药耐药中的作用

目的:探讨miR-135a在小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)多药耐药中的作用。方法:收集2008年1月至2013年12月本院肿瘤科及呼吸内科就诊的48例SCLC患者外周血液标本,将其分为化疗敏感组(28例)和耐药组(20例),采用QRT-PCR法检测患者血液标本、SCLC敏感细胞株H69及耐药细胞株H69AR中miR-135a的表达,分析其与临床预后的关系,并应用miR-135a模拟物和抑制剂分别上、下调细胞株中miR-135a的表达,采用CCK-8法检测细胞对各种化疗药物(ADM、DDP和VP-16)敏感性的影响。结果:与化疗敏感组相比,miR-135a在化疗耐药患者血液标本中的表达明显增高[(2.174±3.981)vs(-1.963±3.750),P<0.001];在临床患者血液标本中,miR-135a的表达与患者的性别、年龄无关(P>0.05),与疾病的分期、化疗敏感性及患者的生存时间相关(均P<0.01)。miR-135a在H69AR细胞中的表达明显高于H69细胞[(7.841±0.392)vs(1.047±0.081),P<0.01];通过miR-135a抑制剂下调H69AR中miR-135a的表达能够显著增加细胞对化疗药物的敏感性,H69AR细胞对DDP、ADM及VP-16的IC50值明显下降[(247.09±11.55)vs(76.64±10.00)、(150.83±8.03)vs(40.72±5.06)、(436.63±61.19)vs(163.35±20.00);H69细胞转染miR-135a mimics后对化疗药物DDP、ADM和VP-16的IC50值明显增加[(18.58±1.37)vs(159.27±3.29)、(24.37±2.63)vs(129.19±2.64),(48.55±2.59)vs(359.87±2.92)μg/ml,P<0.01]。结论:miR-135a参与调节SCLC的多药耐药,下调miR-135a基因的表达可能增加细胞对化疗药物的敏感性。     

Shugoshin1在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药中的作用

目的:探讨Shugoshin1在非小细胞肺癌A549细胞对多西紫杉醇耐药中的作用。方法:用Western-blot及RT-PCR检测Sgo1在非小细胞肺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxotere及亲本A549中的表达差异。通过构建Sgo1的si-RNA质粒和过表达质粒经慢病毒包装分别转染A549/Taxotere及亲本A549细胞,利用Western-blot及RT-qPCR鉴定其干预效果。MTT比色法比较下调及上调Sgo1的表达后细胞对化疗药物多西紫杉醇敏感性的影响。结果:在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药细胞株中,Sgo1的表达明显高于其亲本细胞株A549。通过外源性筛选和鉴定,经慢病毒包装载体,成功构建了Sgo1表达上调和下调的细胞株;MTT试验发现:抑制Sgo1的表达能显著增加A549/Taxotere对多西紫杉醇的敏感性,而外源性上调Sgo1的表达能明显降低A549对多西紫杉醇的敏感性。结论:Sgo1的表达与非小细胞肺癌细胞株A549紫杉醇耐药性密切相关。     

顺铂通过Notch4 信号通路增强口腔鳞癌干细胞的自我更新能力

目的：研究Notch4 信号通路对口腔鳞癌PJ15 和PJ41 细胞的肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）自我更新能力的影响及其作用机制。方法：利用TCGA数据库分析Notch4 基因在头颈部肿瘤中的表达。2 μmol/L 顺铂处理口腔鳞癌PJ15 和PJ41 细胞48 h,再加入Notch 通路抑制剂DAPT作用24 h,采用流式细胞术检测CSC比例,Western blotting 法和qPCR法检测CSC标志物（Sox2、Bmi-1、Oct4、Nanog）和Notch4 信号通路中的下游基因（JAG1、HEY1、HEY2、HES1、HES2、DLL4 等）的表达。采用siRNA技术敲降Notch4,Western blotting 法和qPCR 法检测si-Notch4 和顺铂对CSC标志物表达水平的影响,干细胞成球实验检测CSC的自我更新能力。结果：头颈部肿瘤组织中Notch4 基因呈高表达（P=0.046）。顺铂处理后,PJ15 和PJ41 细胞中NICD4 和CSC标志物（Sox2、Bmi-1、Oct4、Nanog ）和Notch4 信号通路的下游基因（JAG1、HEY1、HEY2、HES1、HES2、DLL4）的表达水平较对照组均显著增加（均P<0.05）,ALDH1 阳性细胞群体比例显著增加（P<0.05）;再加入Notch 通路抑制剂DAPT 作用24 h 后上述基因表达量均显著下降（P<0.05 或P<0.01）。敲降Notch4 后,与对照组相比,si-Notch4 组PJ15 细胞[ （1.33±0.47）vs（8.00±0.82）个,P<0.01]和PJ41 细胞[ （1.00±0.82）vs（7.67±1.25）个,P<0.01]球体的数量和大小均显著减少;再加入2 μmol/L DDP作用24 h,si-Notch4 组Nanog 和Bmi-1 基因表达量与对照组无显著差异。结论：激活Notch4 信号通路可增加口腔鳞癌PJ15 和PJ41 细胞的干细胞自我更新能力。     

运用saRNA激活p21基因表达上调对肺癌细胞生长及化疗敏感性的影响

目的:探讨利用针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21WAF1/CIP1(p21)的基因启动子的saRNA (dsp21-322) 特异激活p21基因的表达对肺癌细胞生长及耐药的影响.方法:化学合成针对p21启动子区的saRNA,将其转染非小细胞型肺癌细胞系A549,利用RT-PCR技术及Western blotting技术检测细胞中p21表达情况,进而观察p21表达改变后细胞凋亡情况及对顺铂药物敏感性的影响.结果:在转染dsp21-322的 A549肺癌细胞中,p21的mRNA和蛋白的表达均有所上调.p21表达的上调可引起A549细胞生长的的明显抑制并可增强其对顺铂的化疗敏感性.结论:p21基因在肺癌药物耐药性的过程中发挥了作用,为应用saRNA上调抑癌基因治疗肿瘤提供了新的思路.     

运用saRNA激活p21基因表达上调对肺癌细胞生长及化疗敏感性的影响

目的：探讨利用针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21WAF1/CIP1（p21）的基因启动子的saR-NA（dsp21-322）特异激活p21基因的表达对肺癌细胞生长及耐药的影响。方法：化学合成针对p21启动子区的saRNA,将其转染非小细胞型肺癌细胞系A549,利用RT-PCR技术及Western blotting技术检测细胞中p21表达情况,进而观察p21表达改变后细胞凋亡情况及对顺铂药物敏感性的影响。结果：在转染dsp21-322的A549肺癌细胞中,p21的mRNA和蛋白的表达均有所上调。p21表达的上调可引起A549细胞生长的的明显抑制并可增强其对顺铂的化疗敏感性。结论：p21基因在肺癌药物耐药性的过程中发挥了作用,为应用saRNA上调抑癌基因治疗肿瘤提供了新的思路。     

MRP1介导肿瘤的多药耐药

目的:探讨多药耐药相关蛋白基因MRP1介导肿瘤耐药机制,寻找逆转耐药的方法.方法:建立肝细胞癌单基因耐药细胞株HepG2/MRP1,体外转录合成目的siRNA片断,脂质体介导转染单基因肝细胞癌耐药细胞株,MTT法检测细胞对化疗药的敏感性,流式细胞仪检测药物浓度及细胞表面MRP1蛋白表达.结果:成功建立多药耐药细胞株,并筛选出靶向MRP1基因高效的siRNA分子.转染HepG2/MRP1细胞后,MRP1 mRNA及MRP1表达水平明显下调,细胞内DNR蓄积量增加,对ADM的IC50下调,相对逆转率达90％.转染前后细胞对化疗药敏感性、细胞内药物浓度、细胞表面MRP1蛋白质表达均有显著差异.结论:肿瘤多药耐药与MRP1高表达密切相关,RNAi技术能有效逆转由MRP1介导的肿瘤细胞的多药耐药.     

CXCL4对非小细胞肺癌H460细胞顺铂耐药性的影响及其机制探讨

目的:探讨血小板因子4（CXCL4）对人非小细胞肺癌H460细胞顺铂耐药性的影响及其作用机制。方法:体外诱导法建立顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞株H460/DDP,并鉴定其生物学特性。采用CCK-8法分别检测H460及H460/DDP对顺铂的耐药性。qRT-PCR及Western Blot检测亲本细胞株H460及顺铂耐药株H460/DDP中CXCL4的mRNA及蛋白表达水平。通过CCK-8法检测过表达或者敲低CXCL4后亲本细胞株H460或顺铂耐药株H460/DDP对顺铂的敏感性。最后利用Western Blot及qRT-PCR法探讨CXCL4抵抗非小细胞肺癌化疗敏感性的调控机制。结果:成功构建了非小细胞肺癌顺铂耐药株H460/DDP（H460/DDP IC50=55.005 μg/ml）,CCK-8结果提示顺铂耐药株H460/DDP与亲本细胞株H460细胞的增殖速度没有明显差异（P＞0.05）;顺铂耐药株H460/DDP中,CXCL4 mRNA及蛋白水平均显著增高（P＜0.000 1）;在亲本细胞株H460中稳定过表达CXCL4能显著降低其对顺铂的敏感性（P＜0.000 1）,而于顺铂耐药株H460/DDP中敲低CXCL4能显著增加H460/DDP对顺铂的敏感性（P＜0.000 1）;Western Blot及qRT-PCR结果显示,CXCL4能激活Wnt/β-catenin 信号通路,促进下游基因MYC、CyclinD1、MMP-7、CDK4的表达。结论:CXCL4通过调控Wnt/β-catenin 信号通路促进非小细胞肺癌对顺铂的耐药性。     

人肺癌细胞株化疗敏感性与基因表达的关系

目的探讨人肺癌细胞株对化疗药物的敏感性与多药耐药相关基因和凋亡调控基因表达的关系。方法采用MTT法检测5株肺癌细胞SPCA1、NCI-H446、SH-77、95C和95D对阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、卡氮芥(BCNU)的敏感性。流式细胞术检测多药耐药基因P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)等耐药相关基因和Fas、bcl-2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果不同肺癌细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析显示,肺癌细胞株对MMC的敏感性与GST-π和bcl-2的表达呈负相关,P值分别为0.040和0.030,GST-π和bcl-2的表达水平较高者,MMC的IC50较高,敏感性较低;对DDP的敏感性与p53蛋白表达水平呈负相关(P=0.036);对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关(P>0.05)。结论人肺癌细胞株对不同化疗药物敏感与否有不同的机制,对MMC的敏感性与GST-π和bcl-2的表达有关,对DDP的敏感性与p53的表达有关。     

FANCF基因沉默增强多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对马法兰的敏感性

目的:使用小片段干扰RNA（siRNA）沉默FANCF基因表达,观察其对FA/BRCA途径的影响及对多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对交联剂马法兰的敏感性变化。方法:FANCF siRNA瞬时转染多药耐药细胞株RPMI8226/R,采用CCK-8法检测转染前后细胞对马法兰的敏感性变化,RT-PCR,western-blot法检测FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2基因表达量的改变,彗星实验检测DNA损伤,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:FANCF siRNA转染耐药骨髓瘤细胞后,对马法兰的IC50值由17.29μmol/L降至4.88μmol/L;western-blot检测出瞬时转染FANCF siRNA后FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2 蛋白表达量明显较转染前减低;彗星实验检测出转染后耐药细胞的DNA损伤增多;转染后马法兰诱导细胞凋亡率由（77.67±0.62）%升高至（88.37±0.25）%,提示FANCF基因沉默可使耐药RPMI8226/R细胞对化疗药物马法兰重新恢复敏感性。结论:FANCF基因沉默可抑制FA/BRCA途径中FANCD2及下游BRCA2基因表达,从而阻断FA/BRCA途径介导的DNA修复,增强马法兰对多药耐药骨髓瘤细胞株RPMI8226/R的细胞毒性,增加细胞凋亡率,为解决临床耐药问题提供一个新的思路。     

Neu RNAi对卵巢癌细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用

目的探讨nenRNAi对卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用,寻找下调基因表达并逆转化疗耐药的方法,为卵巢癌的基因治疗探索新途径。方法应用含有u6启动子的pSilencer 1．0-U6表达载体构建neu基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（pSilencer—neu）,用脂质体方法将pSilencer—neu转染卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP,另设未转染组及转染pSilencer—control组为对照。显微镜下观察转染前后细胞的变化;用RT—PCR及Western Blot检测neu基因mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;加入顺铂后检测RNAi对SKOV3／DDP顺铂药物敏感性的影响。结果neuRNAi可明显下调卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP中neu的基因表达;使其细胞生长受到抑制,生长速度减慢,生长曲线低平;细胞凋亡增加且细胞周期发生变化,G1／G0期细胞增多,S期细胞则减少;顺铂耐药实验显示,转染RNAi的SKOV3／DDP细胞IC50明显下调,细胞凋亡率显著增加。结论应用RNAi可以部分阻抑neu基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP中的表达,使SKOV3／DDP细胞生长减慢、凋亡增加,而且对顺铂的敏感性增强。     

多药耐药对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭活性、耐药机制及丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的:通过化疗药物诱导建立多株人肝癌多药耐药细胞模型,探讨多药耐药获得对细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响,耐药机制及与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路表达的相关性.方法:采用多柔比星( adriamycin,ADM)高浓度冲击和小剂量缓升2种方法诱导建立人肝癌细胞(HepG2、SMMC-7721和BEL-7402)耐药模型.比较耐药细胞株与亲本细胞株间的差异,主要包括采用生物发光法进行药物敏感实验并计算耐药指数;RT’-PCR法和免疫组织化学法检测相关耐药基因(p-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1、肺癌耐药蛋白、乳腺癌耐药蛋白、蛋白激酶C、谷胱甘肽-S-转移酶-π和拓扑异构酶Ⅱ)mRNA及相应蛋白的表达.免疫组织化学法检测与细胞增殖活性相关的Ki-67和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达:FCM法检测细胞周期、细胞凋亡率的改变Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力的改变最后,分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测MAPK信号通路中ERK1、ERK2、ERK5、JNK1、JNK2和p38a基因及相应蛋白的表达.结果:共建立6株ADM耐药细胞株;与亲本细胞株相比,耐药细胞株耐药指数均＞5,并对多种化疗药耐受性增强,多药耐药相关基因及蛋白的表达均上调2～10倍,以高浓度冲击法诱导的细胞中蛋白表达上调明显.耐药细胞中Ki-67及PCNA蛋白的表达量均升高20倍以上,细胞周期被阻滞在S期,体外侵袭能力增强1.3～2.5倍;ADM干预后,细胞凋亡率减少60％以上.MAPK信号通路中不同基因和蛋白表达量均有不同比例升高,以ERK1、ERK2升高明显.结论:ADM能够诱导多株人肝癌细胞产生多药耐药,导致细胞增殖活性升高、细胞周期改变、抗凋亡能力及侵袭能力增强.MAPK信号通路中相关蛋白表达的上调与细胞多药耐药有一定关系.     

吉非替尼敏感性不同的非小细胞肺癌中miRNA-7表达的差异及临床意义

目的检测吉非替尼敏感性不同的非小细胞肺癌中miR-7的表达差异,并探讨其临床意义。方法采用吉非替尼(Gefitinib)药物大剂量冲击法诱导H827,建立耐吉非替尼肺癌细胞亚系H827-7/GR,有限稀释法将H827-7/GR细胞单克隆化,CCK-8法检测耐药前后细胞株及各单克隆细胞对吉非替尼的敏感性;RT-PCR方法检测H827、H827-7/GR和耐药单克隆细胞株以及其他对吉非替尼敏感性不同的肺癌细胞株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的表达差异。结果 H827/GR耐药指数大于100;获得的6株耐药单克隆细胞株对吉非替尼的半生长抑制浓度(the half growth inhibition concentration,IC50)值不同;和吉非替尼敏感株H827相比,诱导的耐药细胞株H827/GR、耐药单克隆细胞株和吉非替尼耐药株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的相对表达水平均降低(P<0.05)。结论在非小细胞肺癌中,耐药细胞中miR-7的相对表达水平均较敏感细胞系降低,提示miR-7的低表达可能与非小细胞肺癌耐药性相关,其可能是潜在的肺癌药物敏感性预测分子标志物。     

dlk1促进肺鳞癌细胞增殖的相关分子机理研究

背景与目的 印记基因dlk1因在多种肿瘤组织中出现异常表达而受到研究者越来越多的关注,但dlk1基因与肺癌的关系尚无报道.本研究首先在肺癌组织中检测了dlk1基因的表达,并进一步利用肺癌细胞系H520对dlk1基因促进细胞增殖的分子机制进行了初步研究.方法 首先,采用RT-PCR在30对非小细胞肺癌肿瘤及其配对癌旁组织中检测dlk1基因的表达.然后,克隆人源dlk1基因,转染并筛选出稳定表达dlk1基因的肺癌细胞.最后,利用CCK8法研究dlk1基因对细胞增殖能力的影响,并用Western blot技术分析细胞周期蛋CyclinB1的表达.结果 RT-PCR结果显示,dlk1基因在36.7%的非小细胞肺癌肿瘤组织中表达水平高于癌旁肺组织.在成功获得了稳定表达外源性dlk1基因的肺癌细胞H520-dlk1的基础上,CCK8实验及平板集落实验显示,稳定转染dlk1可以明显促进肺鳞癌细胞H520的增殖能力(P<0.05).同时,稳定表达DLK1蛋白可以上调细胞周期蛋白CyclinB1的表达水平(P<0.05).结论 dlk1在非小细胞肺癌中存在异常高表达,它可以通过上调细胞周期蛋白CyclinB1的表达,促进肺鳞癌细胞H520的增殖.提示dlt1基因的异常表达可能在肺癌的发生演进中发挥作用.     

载体表达小干扰RNA逆转卵巢癌的多药耐药

目的:探讨载体表达的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)逆转卵巢癌细胞多药耐药的可行性。方法:浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR/AR;脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/mdr1a和pSN/mdr1b)转染OVCAR/AR细胞;实时定量RT-PCR检测MDRlmRNA的表达;流式细胞术检测P-gp的表达,罗丹明试验检测P-gp的药物转运功能;MTT法检测OVCAR/AR细胞对化疗药的抵抗性。结果:转染pSN/mdr1a和pSN/mdr1b后,OVCAR/AR细胞的MDR1mRNA和P-gp的表达均显著下降,P-gp的转运功能减少,OVCAR/AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性逆转。结论:载体表达的siRNA可持久有效地抑制卵巢癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达,并逆转其多药耐药。