pBLacZ真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了一种编码β－半乳苷酶的真核基因表达载体ｐＢＬａｃＺ。用它对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ细胞株、原代培养的小鼠皮肤成纤维细胞，以及小鼠活体皮下和大鼠活体骨骼肌中进行了基因转移。经Ｘ－ｇａｌ组织化学染色后的结果证实：此基因载体可在这些组织细胞中有效地表达产生β－半乳糖苷酶活性。     

BQ＿（123）－多聚赖氨酸携载β－半乳糖苷酶基因向血管平滑肌细胞的靶向导入

本研究连接合成了ＢＱ１２３－多聚赖氨酸（ＢＰ）利用ＢＱ１２３对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）膜表面内皮素Ａ型受体（ＥＴＡ）的高度选择性和多聚赖氨酸对ＤＮＡ的强吸附作用，以ＢＰ携载含有β－半乳糖苷酶（β－ＬａｃＺ）基因的表达质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（ｐＳＶ－β－ＬａｃＺ）对培养的ＶＳＭＣ和内皮细胞（ＥＣ）转移基因。结果表明，ＢＰ具有向ＶＳＭＣ转基因性能，且依赖与靶细胞表面ＥＴＡ的结合。     

LacZ基因在体内外骨骼肌中的表达

采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导基因转移技术，将含有大肠杆菌β－半乳糖苷酶的结构基因（ＬａｃＺ基因）及Ｒｏｕｓ肉瘤病毒启动子的质粒（ｐＲＳＶ－ＬａｃＺ）导入体外培养的大鼠原代骨骼肌内；另外，分别将具有ＲＳＶ启动子和巨细胞病毒ＣＭＶ启动子的ＬａｃＺ基因直接注射到活体小鼠肌肉组织内。经转染的体外培养骨胳肌细胞和取自活体的肌肉组织切片行Ｘ－ｇａｌ组织化学检测以判断ＬａｃＺ基因的表达情况。实验结果证明，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的骨胳肌基因转染率约为１０％～２０％。直接肌肉注射含有不同启动子的ＬａｃＺ基因后，肌细胞内均有该基因表达。结果表明，无论在体内或体外，骨骼肌细胞均能被外源性基因所转染并能表达该报告基因。因此，有望使用经遗传工程改造的骨胳肌细胞作为体细胞基因治疗的有效运载细胞。     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅳ．外源基因的在体表达

将ｐＮ２－ＬａｃＺ和ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒直接注射到Ｗｉｓｔａｒ大鼠股四头肌，可以在肌肉中检测到这两种基因的表达产物。注射ｐＮ２－ＬａｃＺ质粒后７天，β－半乳糖苷酶的表达量最高，可达２．４８×１０－４Ｕ／ｇ组织，并且可持续表达３周以上。组织化学染色表明部分肌细胞内有ＬａｃＺ基因表达。当用脂质体介导时，注射含３０μｇ质粒的脂质体─ＤＮＡ复合物，β－半乳糖苷酶的活性同直接注射８０μｇ质粒时的活性无差别，直接注射ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒后７天，单链尿激酶原含量最高，可达５５０ｎｇ／ｇ组织。基因注射后３个月仍可检测到单链尿激酶原。     

利用LacZ基因示踪技术观察血管紧张素：Ⅱ1B受体的组织分布

利用ＬａｃＺ基因示踪技术观察血管紧张素Ⅱ１Ｂ受体的组织分布李文歌陈香美我们利用基因同源重组技术，用一个包含编码β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ基因）基因的血管紧张素Ⅱ１ＢＣＡＴ１Ｂ）同源ＤＮＡ片段，置换ＡＴ１Ｂ基因的外显子序列，通过示踪基因（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ...     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅲ．重组质粒fPGV－MT－LacZ在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

为观察外源性基因在心血管细胞内的表达，本工作构建了含有外源性标记基因ＬａｃＺ的逆转录病毒质粒ｆＰＧＶ－ＭＴ－ＬａｃＺ。应用脂质体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包裹质粒，转染培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，经Ｇ４ｌ８筛选、克隆以及β－半乳糖苷酶的酶活测定，证明外源性基因可以在血管平滑肌细胞中表达。揭示血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的一种靶细胞。     

双启动子报告基因表达载体的构建及其在真核细胞中表达活性测定

目的 研究含双启动子表达载体在真核细胞中的表达活性。方法 构建分别含有ＣＭＶ及ＣＭＶ－ＳＶ４０启动子的ｐＣ－ＬａｃＺ及ｐＣＳ－ＬａｃＺ真核表达载体。用阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将其转染至ＴＪ９０５真核细胞中,对转染后２４～７２ｈ的细胞提取物进行β－半乳糖苷酶活性检测;并与转染标准ｐＳＶ－ｇａｌ载体的细胞提取物的酶活性进行比较分析。结果 ＴＪ９０５细胞中转染ＣＳ－ＬａｃＺ的β－半乳糖苷 酶活性明显高于其它两种载体（Ｐ〈０．０５）。且转染后４８ｈ是酶活性达高峰的时间。结论 两种启动子同时启动的基因表达效率较高。这为今后基因治疗中提高外源基因表达效率提供了一条有益的探索之路。     

脂质体介导的骨骼肌细胞的基因转移

采用２种阳离子脂质体──ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ和ｌｉｐｏｆｅｃｔａＭＩＮＥ作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。骨骼肌细胞为取自新生ＳＤ大鼠骨骼肌经２ｄ培养的原代细胞，外源性基因来自质粒ｐＲＳＶＬａｃＺ中的报告基因──β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因。结果证明用此２种阳离子脂质体可使ＬａｃＺ基因在培养骨骼肌细胞中表达率达到２０％。这说明应用阳离子脂质体在真核细胞中实施转基因是一种有效方法。     

酵母PHO81基因上游调控序列的初步研究

ＰＨＯ８１基因的表达受无机磷酸盐浓度的调控，属阻遏型基因。利用本组构建的ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因，对ＰＨＯ８１基因５＇上游核苷酸序列作限制性内切酶缺失分析。以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１的表达水平，测定上游长度不同的变种表达ＰＨＯ８１基因的水平，提示ＰＨＯ８１基因起始密码上游可能存在着两个ＵＡＳ功能区。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的免疫效果

用已构建的不同载体乙型肝炎。基因疫苗（ＰＣＲ３．１－Ｓ，ｐｃＤＮＡ３－Ｓ）和乙型肝炎Ｃ基因疫苗（ＰＣＲ３．１－Ｃ０分别给Ｂａｌｂ／ｃ小鼠多点肌肉注射，２周后追加免疫一次，用ＥＬＩＳＡ法及ＭＴＴＩ地分别检测小鼠血清抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢＣ抗体及地ＨＢｓＡｇ或ＨＢｃＡｇ的特异性增殖反应。结果：免疫接种２周后小鼠血清抗－ＨＢＳ及抗－ＨＢＣ抗体ＯＤ值分别为０．８３７３和０．７９６１均明显高于对照组（０．１２     

人端粒酶启动子(hTERTp)真核表达载体的构建

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）的启动子,构建真核表达载体pEGFP—hTERT。方法以人类基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增hTERT上游序列长约1135bp的启动子片段,克隆入绿色荧光蛋白GFP的基因上游,测序鉴定。结果DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,片段长度为1135bp。结论人端粒酶启动子的真核表达载体pEGFP—hTERT构建成功,为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。     

HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的 构建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达.方法 采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoR Ⅰ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体.分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFast BacTMDual+[DR1/Fc].对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Western blot检测HLA-DR1的表达.结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA和Western blot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象.结论 成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础.     

真核表达载体pEGFP-VASP-lC的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-VASP-lC并稳定转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,为进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR技术从人内皮细胞株ECV304细胞中获得VASP-lC区的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-C1中,构建的重组质粒经脂质体介导转染HeLa细胞,Western blot鉴定VASP-lC区在HeLa细胞中的稳定表达。结果:RT-PCR成功地扩增出一条约310bp的片段,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western blot证明人VASP-lC区能以融合蛋白的形式在HeLa细胞中稳定表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-VASP-lC,获得了稳定表达人VASP-lC区基因的HeLa细胞克隆,便于进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用。     

HBeAg真核表达载体的构建及表达

目的构建HBeAg真核表达载体,观察其在HeLa细胞的表达。方法用PCR方法从质粒PHBV1.5中扩增乙肝病毒前C/C基因,克隆到pCDNA3.1的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建HBeAg表达载体,通过酶切、PCR及测序鉴定,并把载体转染HeLa细胞,用RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA和MEIA检测其表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在HeLa细胞中表达前C/C蛋白,并可分泌表达HBeAg。结论构建了HBeAg表达载体,为运用RNA干扰技术进行HBeAg的抑制研究奠定基础。     

蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统的表达与鉴定

目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白66。结果获得重组cystatin的杆状病毒,Sf9细胞能表达出与蛇毒cystatin单抗、5×His单抗结合的蛋白,相对分子质量约15 kD。结论蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中成功表达。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的 利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域(gAd)基因.方法 以人基因组为模板,PCR法扩增人gAd基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体:Bacmid的大肠杆菌DH10Bac.筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid-gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物.结果 重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果 显示,Bacmid-gAd组和对照组相比,在相对分子质量15 000～25 000之间多出一清晰的蛋白条带,免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合.结论 人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础.     

利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组乙型肝炎病毒核心蛋白。方法构建含有HBVC基因的杆状病毒转移载体pFastBac Dual—HBV core，转化大肠埃希菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid DNA转染昆虫细胞Sf9，获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染Sf9细胞进行乙型肝炎病毒核心蛋白表达，然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达情况。结果成功构建了含HBVC基因的重组杆状病毒，而且在昆虫细胞Sf9中表达了乙型肝炎病毒核心蛋白。结论利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，成功地表达了乙型肝炎病毒核心蛋白，为进一步研究奠定了基础。     

TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测

 目的构建具有自主跨膜能力的Apoptin融合蛋白表达载体,使其分泌表达,避开包涵体复性,简化制备工艺。方法人工合成TAT序列,与Apoptin序列融合,连接到pET22b+载体上,构建原核分泌表达载体pET22b+-TAT-Apoptin,IPTG诱导目的蛋白分泌表达到大肠杆菌周质空间,提取蛋白行SDS-PAGE分析,MTT法检测分泌表达的融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用。结果重组TAT-Apoptin蛋白可分泌至大肠杆菌周质空间中,以可溶状态存在,对胃癌823细胞的最大抑制率为83.95%。结论成功构建重组TAT-Apoptin蛋白表达载体,分泌表达的可溶性融合蛋白具有生物活性。     

pBV-BPI600重组表达载体的构建及其在E.coli中的表达

①采用RT PCR技术 ,以HL 60细胞mRNA为模板扩增获得编码BPI氨基端 1 93个氨基酸 (rBPI2 1)的基因片段 (BPI60 0 ) ;EcoRI/BamHI酶切扩增产物获得BPI 2 0 0bp和BPI 4 0 0bp 2个基因片段。②成功构建PUC1 8 BPI2 0 0和PUC1 8 BPI4 0 0重组克隆载体 ,DNA测序分析结果与文献报道一致。③成功构建pBV2 2 0 BPI60 0重组表达载体 ;转化E .coliDH5α感受态细胞 ,诱导目的重组蛋白表达 ;经SDS PAGE电泳和Western blot鉴定 ,证实表达的重组蛋白确为外源基因 (BPI 60 0bp)编码的产物BPI2 1重组蛋白。