高葡萄糖刺激血管内皮细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调、活性氧增加及细胞凋亡

目的研究在高葡萄糖刺激的条件下,人脐静脉内皮细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表达、细胞内活性氧以及细胞凋亡的变化。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态;免疫荧光法检测人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的表达;高葡萄糖刺激人脐静脉内皮细胞,用逆转录聚合酶链反应检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA水平,Western blotting检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4蛋白表达的变化,DCFH-DA检测细胞内活性氧生成量,流式细胞仪和Hoechst染色检测细胞凋亡。结果高葡萄糖刺激人脐静脉内皮细胞时,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA及蛋白表达上调,细胞内活性氧生成增加,细胞凋亡增加。结论高葡萄糖处理促进人脐静脉内皮细胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表达上调并引起细胞内活性氧生成和凋亡增加。     

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在心肌细胞分化中的作用

目的探讨尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在心肌细胞分化中的作用。方法用核糖酶技术获得尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4低表达小鼠胚胎干细胞克隆,将小鼠胚胎干细胞分化为胚小体。应用荧光染料2,7二氯氢化荧光素二酯和定量氮蓝四唑试验检测活性氧水平;逆转录聚合酶链反应和Western blot测定尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶mRNA水平和心室肌肌球蛋白轻链2蛋白表达水平;DNA laddering检测细胞凋亡;原位杂交分析尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在胚胎心脏中的表达。结果活性氧清除剂N乙酰基半胱氨酸、过氧化氢酶和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制剂二甲苯基碘可抑制胚胎干细胞分化成心肌细胞,而较低浓度(1nmol/L~100nmol/L)的过氧化氢可明显促进心肌细胞分化,但较高浓度(1μmol/L)的过氧化氢显示出抑制作用(P<0.001)。实验发现,心肌细胞分化过程中内源性活性氧的产生主要来自尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4。应用核糖酶技术抑制胚胎干细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的表达,可引起活性氧水平下降(P<0.001),肌球蛋白轻链2含量显著降低,使心肌细胞的分化受到明显的抑制(P<0.001)。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的高水平表达使干细胞产生大量活性氧,也显著抑制心肌细胞的分化(P<0.05)。结论尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4通过产生活性氧在心肌细胞分化中起关键作用。     

硒对人脐静脉内皮细胞ECV-304单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 观察硒对人脐静脉内皮细胞ECV-304单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响方法分别用高葡萄糖、糖基化终末产物，高胰岛素和过氧化氢孵育人脐静脉内皮细胞ECV-304；在先加入100nmol／L硒后，再给予以上4种因素．分别检测人脐静脉内皮细胞ECV0304MCP-1mRNA的表达并比较。结果 4种因素均可作为独立因素，导致人脐静脉内皮细胞ECV304MCP-1mRNA表达量增加：硒能抑制4种因素所致的MCP-1mRNA表达。结论 硒抑制MCP-1 mRNA在人脐静脉内皮细胞ECV-304中的表达。     

血小板因子4促进人脐静脉内皮细胞Toll样受体2的表达

目的 探讨血小板因子4对人脐静脉内皮细胞Toll样受体2表达的影响.方法 采用人重组细胞因子血小板因子4刺激人脐静脉内皮细胞株ECV304,通过RT-PCR和Western Blotting分别检测ECV304中Toll样受体2 mRNA和蛋白表达.细胞免疫组织化学法检测血小板因子4刺激后ECV304中Toll样受体2的表达量.结果 血小板因子4刺激人脐静脉内皮细胞株后能促进Toll样受体2 mRNA和蛋白表达.与空白组相比,100μg/L血小板因子4处理人脐静脉内皮细胞株能在基因及蛋白水平促进其Toll样受体2表达并呈现一定的时间依赖性(n=5,P<0.05),且肝素不能抑制血小板因子4的这种作用.细胞免疫组织化学法也显示与空白组(0.001 385±0.000 953)相比,血小板因子4处理后人脐静脉内皮细胞Toll样受体2表达显著增多(0.060 399±0.020 998,P<0.05).结论 血小板因子4促进人脐静脉内皮细胞株表达Toll样受体2,此效应可能与血小板在动脉粥样硬化中的作用有关.     

阿托伐他汀抑制同型半胱氨酸诱导的内皮细胞凋亡涉及NADPH氧化酶及p38MAPK途径

目的观察阿托伐他汀对同型半胱氨酸（Hcy）诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡及活性氧的影响,并探讨其作用机制。方法Hcy单独或联合阿托伐他汀、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶抑制剂（DPI）或p38促细胞分裂剂激活性蛋白激酶（p38MAPK）阻断剂（SB203580）处理人脐静脉内皮细胞后,检测细胞凋亡率,活性氧水平,NADPH氧化酶活性,caspase-3 mRNA的表达和p-p38MAPK的表达。结果阿托伐他汀明显抑制Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡及活性氧的产生,并能拮抗Hcy诱导的NADPH氧化酶的激活,p38MAPK蛋白的磷酸化及caspase-3 mRNA表达的增加。NAC、DPI、SB203580可产生相同的作用。结论阿托伐他汀可能通过抑制NADPH氧化酶的激活,p38MAPK磷酸化途径抑制Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞活性氧的产生和细胞凋亡。     

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与动脉粥样硬化

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是一种多亚单位酶复合体,是细胞中一种可诱发的电子传递系统.尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶体,它的激活受蛋白激酶C等信号途径介导.研究表明NADPH氧化酶和近年来新发现的gp91phox同工酶即NOX蛋白家族可能通过损伤血管内皮、促进低密度脂蛋白氧化等参与动脉粥样硬化的发生和发展.     

视黄醇类X受体激动剂通过抑制Rac-1蛋白的激活对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应

目的 探讨视黄醇类X受体激动剂能否对抗高糖环境诱导人血管内皮细胞产生的氧化应激反应及Rac-1蛋白在黄醇类X受体激动荆抗氧化应激过程中的作用.方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞,以葡萄糖(33 mmol/L)干预模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞学和激光共聚焦显微镜的方法 检测细胞内的活性氧离子水平,化学发光法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性.用GST pull-down和免疫杂交的方法 检测Rac-1蛋白的激活.结果 (1)高糖干预显著增加内皮细胞内活性氧离子水平及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(2)Rac-l蛋白抑制剂NSC23766显著降低高糖诱导下内皮细胞活性氧离子的生成及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(3)视黄醇类X受体激动剂9顺维甲酸和SR11237显著下调高糖环境下内皮细胞内活性氧离子水平及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(4)视黄醇类X受体激动剂9顺维甲酸和SR11237抑制高糖干预对内皮细胞Rac-1蛋白的激活.结论 视黄醇类X受体激动剂通过抑制Rac-1蛋白的激活对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应.     

联合运用晚期糖基化终产物和同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附因子1 mRNA表达及机制

目的探讨联合运用晚期糖基化终产物和同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1表达的影响和氧化应激的机制。方法酶消化法获取人脐静脉内皮细胞。逆转录聚合酶链反应检测血管细胞黏附分子1基因的表达。活性氧检测试剂盒检测细胞内氧自由基的荧光信号强度。结果晚期糖基化终产物(10-4～10-1g/L)和同型半胱氨酸(1.35×10-3～1.35g/L)组呈浓度依赖性诱导人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1的表达,晚期糖基化终产物(10-4g/L)和同型半胱氨酸(1.35×10-3g/L)联合作用能进一步增加人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1基因的表达(1.09±0.18),与单独晚期糖基化终产物(0.14±0.07)和同型半胱氨酸组(0.18±0.06)相比其表达分别增加了7.78倍和6.05倍(P0.01);还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶特异性抑制剂二亚苯基碘能显著抑制晚期糖基化终产物和同型半胱氨酸联合诱导的血管细胞黏附分子1基因的表达(0.20±0.09比1.19±0.23,P0.01);晚期糖基化终产物组和同型半胱氨酸组均能增加人脐静脉内皮细胞内氧自由基的荧光信号强度,晚期糖基化终产物和同型半胱氨酸联合作用时,细胞内氧自由基的荧光信号强度水平进一步升高,且二亚苯基碘能明显抑制上述效应。结论晚期糖基化终产物和同型半胱氨酸能增加细胞内氧自由基的荧光信号水平,使血管细胞黏附分子1基因的表达上调,且两者存在协同效应;氧自由基水平的增加是导致血管细胞黏附分子1基因表达升高的重要因素;血管细胞黏附分子1可能是通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶途径实现的。     

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与心血管疾病关系的研究进展

活性氧的增加与心血管疾病密切相关,而产生活性氧的主要酶体是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADPH氧化酶)。NADPH氧化酶对动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭的发生发展起着重要的作用;而心房颤动又可引起NADPH氧化酶的增加。     

bcl-2在神经酰胺致人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的研究bcl-2在神经酰胺诱导人脐静脉内皮细胞凋亡过程中的作用。方法原代培养人脐静脉内皮细胞,用不同浓度神经酰胺进行诱导并观察bcl-2的表达及细胞凋亡情况,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法测定bcl-2mRNA和蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果神经酰胺以剂量依赖性诱导人脐静脉内皮细胞凋亡,对照组和5、12.5、25及50μmol/L神经酰胺处理24h后各组细胞凋亡率分别为2.13%±0.12%、13.24%±1.32%、29.67%±2.32%、34.43%±3.36%及38.56%±2.21%,神经酰胺处理组bcl-2mRNA及蛋白的表达较对照组显著降低(P<0.05)。结论神经酰胺在诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞时,bcl-2表达减低,从而引起细胞凋亡。     

分泌性内皮抑制素真核质粒治疗小鼠肝癌的初步研究

目的 构建并表达分泌性内皮抑制素真核表达质粒,以此对肝癌进行基因治疗。方法 人工合成Ig κ信号肽序列,和内皮抑制素编码序列一起克隆入pcDNA3.1质粒。重组质粒转染上清液作用于ECV304内皮细胞,MTT法检测内皮细胞的增殖。局部注射重组质粒治疗接种在小鼠腿部肌肉内的H_(22)肝癌瘤株,疗程结束后解剖称取瘤重。结果 构建的内皮抑制素真核表达质粒转染上清液可以抑制内皮细胞的增殖抑制率为29.2％。经质粒裸DNA注射治疗后,治疗组瘤重[(1.34±0.96)g]比空载体组[(2.70±0.82)g]和生理盐水组[(3.73±1.41)g]明显减小(P<0.05)。结论 分泌性内皮抑制素真核表达质粒用于H_(22)肝癌的基因治疗有一定效果。     

血管内皮生长因子对过氧化氢诱导的内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的研究血管内皮生长因子对过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡的影响,同时检测凋亡相关基因Bcl-2 mRNA与Fas mRNA表达的变化。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分成对照组、过氧化氢组和过氧化氢 血管内皮生长因子组,12 h后,采用原位末端标记法和流式细胞仪分别观察各组细胞的凋亡数和凋亡率,通过逆转录聚合酶链反应观察各组细胞中凋亡相关基因Bcl-2 mRNA与Fas mRNA表达的变化。结果过氧化氢组凋亡细胞数(27.83±2.14)明显高于对照组(2.50±1.05)(P<0.01)和过氧化氢 血管内皮生长因子组(13.00±2.10)(P<0.01)。过氧化氢组细胞凋亡率(14.17%±0.45%)明显高于对照组(1.55%±0.87%)(P<0.01)和过氧化氢 血管内皮生长因子组(5.69%±0.38%)(P<0.01)。与过氧化氢组比较,过氧化氢 血管内皮生长因子组Fas mRNA表达明显减少(40.67%±2.16%比94.50%±3.45%,P<0.01),而Bcl-2 mRNA表达明显增加(60.33%±1.75%比23.17%±1.17%,P<0.01)。结论血管内皮生长因子能拮抗过氧化氢诱导的内皮细胞凋亡,其抗凋亡的机制可能与上调Bcl-2 mRNA表达与下调Fas mRNA表达有关。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

重构型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达载体诱导人肺腺癌细胞凋亡的意义

目的构建天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)表达载体,观察Caspase3表达载体对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响。方法应用基因重组方法,建立重构型Caspase3基因的真核表达系统pcDNA3.1revCaspase3质粒和野生型pcDNA3.1Caspase3质粒。将实验细胞分为3组转染pcDNA3.1revCaspase3质粒组,转染pcDNA3.1Caspase3质粒组,转染pcDNA3.1质粒空白对照组。前2组用Caspase3抑制剂DEVDfmk干预。应用Caspase3酶活性分析、流式细胞仪及甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测A549细胞Caspase3酶活性变化及细胞凋亡和增殖情况。结果(1)pcDNA3.1revCaspase3质粒组、pcDNA3.1Caspase3质粒组的A549细胞Caspase3酶活性分别是(11.87±0.92)%、(5.34±0.38)%(t=16.02,P<0.01);用Caspase3抑制剂DEVDfmk干预后,pcDNA3.1revCaspase3质粒组酶活性为(7.04±0.48)%,仍明显高于野生型pcDNA3.1Caspase3质粒组的(4.51±0.20)%(t=11.86,P<0.01)。(2)流式细胞分析结果显示,pcDNA3.1revCaspase3质粒组、pcDNA3.1Caspase3质粒组和pcDNA3.1质粒组的A549细胞凋亡率分别是(20.1±3.5)%、(7.8±2.8)%、(1.4±0.3)%,3组差异有统计学意义(F=44.01,P<0.01)。(3)MTT比色检测显示pcDNA3.1revCaspase3质粒组、pcDNA3.1Caspase3质粒组和pcDNA3.1质粒组的A549细胞生存率分别是(35.7±1.1)%、(72.8±2.9)%、(85.4±4.8)%,转染pcDNA3.1revCaspase3质粒组生存率明显低于其他两组(F=375.07,P<0.01)。结论pcDNA3.1revCaspase3在A549细胞内有较强的自身活化能力,对Caspase3抑制剂抵抗作用较强,可明显诱导A549细胞凋亡并抑制A549细胞生长。     

胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．方法:从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性内切酶KpnI,BamHI和EcoRI, BamHI识别位点．按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )．测序正确的重组子pcDNA3．1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3．1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用半定量RT-PCR及Wlestern blot比较转染不同质粒的 MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异．结果:经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体 pcDNA3．1( ),组成重组子pcDNA3．1-a(含正向克隆),pcDNA3．1-b(含反向克隆)．重组子 pcDNA3．1-a,pcDNA3．1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株．与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示转染pcDNA3．1-a的 MKN45细胞中其mRNA的表达上调35．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其mRNA 的表达下调32．1％;Western blot结果显示转染 pcDNA3．1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50．3％．结论:成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．     

过表达转录因子E2F1对小脑颗粒神经元凋亡的影响

目的探讨过表达转录因子E2F1对小脑颗粒神经元凋亡的影响。方法构建pE2F1表达质粒,转染293细胞验证其表达,双报道基因系统检测其转录活性。体外培养小脑颗粒神经元,钙磷法转染pE2F1表达,转染pcDNA空载体组作为对照,于转染12、24、48h后运用Hoechst 33258染色检测转染细胞的核固缩率（即凋亡率）;转染pE2F1和pcDNA 48h后的小脑颗粒神经元进行高钾和低钾处理12h,统计细胞凋亡率。结果成功构建pE2F1表达质粒,且证实该质粒具有转录活性。与转染pcDNA空载体组比较,转染pE2F1后不同时间点小脑颗粒神经元的凋亡率差异无统计学意义（P〉0．05）。pE2F1转染组和pcDNA转染组高钾处理后的凋亡率分别为（12±4）％和（11±3）％,差异无统计学意义（P〉0．05）;低钾处理后的凋亡率分别为（42±3）％和（30±2）％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论过表达E2F1对小脑颗粒神经元的凋亡无明显影响,但抑制低钾处理诱导的小脑颗粒神经元凋亡。     

HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module

AIM: To investigate the possible mechanism by which hepatitis B virus X protein (HBx) mediates apoptosis of HepG2 cells.METHODS: HBx expression vector pcDNA3.1-X was transfected into HepG2 cells to establish an HBx high-expression cellular model as pcDNA3.1-X transfected group. The pcDNA3.1-X and pSilencer3.1-shHBX (HBx antagonist) were cotransfected into HepG2 cells to establish an HBx low-expression model as RNAi group. Untransfected HepG2 cells and HepG2 cells transfected with negative control plasmid were used as controls. Apoptosis rate, the expression of Fas/FasL signaling pathway-related proteins and the phosphorylation levels of MLK3, MKK7 and JNKs, which are upstream molecules of death receptor pathways and belong to the family of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), were measured in each group.RESULTS: Compared with HepG2 cell group and RNAi group, apoptosis rate, the expression of Fas and FasL proteins, and the activation of MLK3, MKK7 and JNKs were increased in the pcDNA3.1-X transfected group. The activation of JNKs and expression of FasL protein were inhibited in the pcDNA3.1-X transfected group when treated with a known JNK inhibitor, SP600125. When authors treated pcDNA3.1-X transfected group with K252a, a known MLK3 inhibitor, the activation of MLK3, MKK7 and JNKs as well as expression of FasL protein was inhibited. Furthermore, cell apoptosis rate was also significantly declined in the presence of K252a in the pcDNA3.1-X transfected group.CONCLUSION: HBx can induce HepG2 cell apoptosis via a novel active MLK3-MKK7-JNKs signaling module to upregulate FasL protein expression.     

p38丝裂素活化蛋白激酶在高糖损伤人脐静脉内皮细胞中的作用

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶在高糖导致人脐静脉内皮细胞损伤过程中的作用及p38丝裂素活化蛋白激酶激活是否为蛋白激酶C依赖途径。方法体外分离培养人脐静脉内皮细胞,加入22 mmol/L葡萄糖及PMA、GF109203X(蛋白激酶C特异抑制剂)、SB203580(p38丝裂素活化蛋白激酶特异抑制剂)培养72 h。采用Western-blot检测磷酸化p38丝裂素活化蛋白激酶蛋白的表达,用逆转录聚合酶链反应检测p38丝裂素活化蛋白激酶mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果高糖及PMA使磷酸化p38丝裂素活化蛋白激酶蛋白表达量与mRNA水平明显升高,人脐静脉内皮细胞凋亡率明显升高。高糖培养人脐静脉内皮细胞72 h后磷酸化p38丝裂素活化蛋白激酶蛋白表达量、mRNA水平、人脐静脉内皮细胞凋亡率分别由0.189±0.0103、0.313±0.0153和5.15%上升至0.605±0.0407、0.447±0.0252和16.8%(P<0.05)。SB203580和GF109203X预处理后使p38丝裂素活化蛋白激酶蛋白磷酸化的表达量与mRNA水平明显下降,人脐静脉内皮细胞凋亡率下降(P<0.05)。结论p38丝裂素活化蛋白激酶激活在高糖导致人脐静脉内皮细胞损伤过程中起促进作用,p38丝裂素活化蛋白激酶激活可能为蛋白激酶C依赖途径。p38丝裂素活化蛋白激酶特异阻断剂对高糖损伤内皮细胞有保护作用。     

弓形虫P~(30)的克隆表达及其对巨噬细胞凋亡的影响

目的　获得能表达弓形虫P3 0 蛋白的小鼠巨噬细胞克隆并观察内源性表达的P3 0 蛋白对小鼠巨噬细胞凋亡的影响。方法　通过PCR扩增获得P3 0 基因片段 ,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(- )中 ,利用酶切、DNA序列分析鉴定阳性克隆 ,采用脂质体将重组质粒转染到RAW 2 6 4 .7巨噬细胞中 ,通过Hygromycin筛选和PCR、免疫组化鉴定 ,用流式细胞术DNA倍体分析计算稳定转染和瞬时转染P3 0 基因的巨噬细胞的凋亡率。结果　 1.PCR、酶切、连接的产物经电泳鉴定 ,均与预期设计相符合 ,DNA序列分析发现重组质粒中的目的基因序列与文献报道相符。2 .PCR和免疫组化鉴定发现转染P3 0 重组质粒的巨噬细胞能稳定地复制质粒并表达弓形虫P3 0 蛋白。 3.P3 0 稳定转染的细胞凋亡率均在 2 %左右 ,不同细胞之间没有区别。 4 .瞬时转染空载体和P3 0 重组质粒的巨噬细胞其凋亡率均在 6 %左右 ,没有区别。结论　 1.获得了含P3 0 基因的重组质粒以及能稳定表达弓形虫P3 0 蛋白的小鼠巨噬细胞克隆。2 .无论是稳定转染还是瞬时转染 ,均不能引起巨噬细胞的凋亡 ,说明内源性表达的弓形虫P3 0 蛋白对小鼠巨噬细胞的凋亡没有影响。