Corning？ CellBIND？表面培养皿促进脐带源间充质干细胞生长

背景：培养体系微环境影响干细胞体外扩增,寻找有效的促进细胞贴壁和增殖的培养方法尤为重要。目的：比较不同细胞培养材质对细胞体外扩增的影响。方法：将5.0×10^4培养的人脐带源间充质干细胞分别接种于包被/不包被鸟氨酸Corning 聚苯乙烯培养皿或Corning？ Cel BIND？表面培养皿中培养,分别观察细胞的贴壁、增殖状态、与细胞黏附和细胞增殖有关的蛋白的表达及细胞标志物的表达。结果与结论：与其他类型的培养皿相比,包被多聚鸟氨酸的Corning Cel BIND 表面培养皿在24 h内能够促进人脐带源间充质干细胞贴壁,同时也能使培养的人脐带源间充质干细胞较早的进入对数生长期,细胞增殖数量相对较多,虽然对人脐带源间充质干细胞表面标志物CD73, CD90和CD105的表达没有影响,但能促进细胞中黏附蛋白的表达。且Corning？ Cel BIND？表面培养皿较Corning 聚苯乙烯培养皿更能促进人脐带源间充质干细胞的贴壁和增殖,同时也对细胞表型的表达无影响。提示Corning？ Cel BIND 表面培养皿能够促进细胞吸附,增加细胞数量,且对细胞周期蛋白以及细胞表型的表达没有影响,且包被多聚鸟氨酸能够进一步促进细胞的贴壁和增殖,并稳定表达人脐带源间充质干细胞的细胞表型。     

脐带间充质干细胞的研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞[1-5],MSCs由于它的自我更新和多项分化潜能,而具有巨大的治疗价值[1-3,6-7],日益受到关注.MSCs有以下特点:(1)多向分化潜能,在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3-4]、脂肪细胞[8]、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11-12];(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合[13-14];(3)免疫调控功能,骨髓源MSCs表达MHC-Ⅰ类分子,不表达MHC-Ⅱ类分子,不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子,体外抑制混合淋巴细胞反应,体内诱导免疫耐受[11,15],在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景;(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗.     

人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进

背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能,以及取材方便等优点而日益受到关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法,并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带,利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,即将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养,取第3代脐带间充质干细胞进行生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出,第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中继续培养,2d后即可见有细胞爬出,细胞生长速度较快,5d即可形成细胞克隆。传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。细胞增殖能力旺盛,平均倍增时间为50 h左右,41.24%的细胞处于G2/S期。体外可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性,而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状

背景:关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究.目的:建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状.方法:大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力.结果与结论:两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞:原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代:传代扩增两者之间没有差别.免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45.体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力.     

脐带间充质干细胞的归巢机制

背景：脐带间充质干细胞因其具有取材方便、无污染、易扩增、无伦理学差异、多向分化等优点被作为用于组织工程学及再生医学的理想种子细胞。目的：对脐带间充质干细胞的归巢机制进行阐述。方法：以“Umbilical cord mesenchymal stem cells,homing mechanism or home,脐带间充质干细胞,归巢机制,归巢特点”为关键词应用计算机检索Pubmed数据库、CNKI数据库2003至2012年,选择内容与脐带间充质干细胞、归巢机制、临床应用相关的文章,这些文献为近期发表或发表在权威杂志,共纳入31篇文献。结果与结论：脐带间充质干细胞的免疫调节、多向分化等优势使其作为一种新的治疗手段应用于临床,使众多疾病的治愈成为可能,其中向缺血或损伤组织炎性归巢的特征是脐带间充质干细胞安全有效的应用于临床的关键。了解脐带间充质干细胞归巢特点,研究其归巢机制,使其高效归巢是脐带间充质干细胞应用于细胞治疗的关键问题。     

人脐带间充质干细胞超微结构观察

本研究观察脐带间充质干细胞的超微结构。用胶原酶消化法分离培养足月新生儿的人脐带间充质干细胞(hUCMSC),进行传代培养、扩增,在显微镜下观察其细胞形态。对培养至第3代的hUCMSC进行免疫表型测定,进行成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导分化实验,并在透射电子显微镜、扫描电子显微镜下进行超微结构的观察。结果表明,hUCMSC外观呈梭形和多角形,并可见细胞核;高表达表面标志CD44,CD73,CD105,不表达CD34,CD45,CD31和HLA-DR;能够进行成脂、成骨、成软骨分化。在扫描电子显微镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,在透射电子显微镜下可见到两种不同的细胞形态:一种处于静止期,细胞核大,圆或卵圆形,仅有1个核仁,胞质内细胞器少;另一种处于相对活跃期,同一个细胞内可以看到1个或2个细胞核,细胞器数量丰富、结构清晰,并可见扩张的线粒体。结论:从脐带中分离培养的细胞具有间充质干细胞的生物学特性,具有两种不同状态的超微结构。     

骨髓源与脐带源间充质干细胞的基本生物学特征比较

骨髓（bone marrow,BM）和脐带（umbilical cords,UC）是治疗用间充质干细胞（MSC）的主要来源.本研究旨在比较骨髓源和脐带源间充质干细胞的基本生物学特征和体外免疫抑制能力.采用相同培养条件,原代扩增培养UC-MSC和BM-MSC,比较它们的生长动力学、细胞表型和免疫抑制能力.采用基因芯片技术比较这两种来源的间充质干细胞的表达基因组差异.结果表明,UC-MSC与BM-MSC在细胞形态和细胞表型上相似,但UC-MSC生长更快,可以在体外培养30代以上并不发生可见的形态改变,而BM-MSC生长缓慢,在培养6代以后倍增时间就显著增加.UC-和BM-MSC均可抑制PHA刺激的外周血单个核细胞增殖,其中BM-MSC的抑制能力稍强.基因芯片显示,BM-MSC表达更多的免疫相关基因,而UC-MSC高表达的基因更多地集中于器官发育和生长类基因方面.结论：UC-MSC的高增殖率、低HLA-ABC表达和免疫抑制能力促进了其在细胞治疗中的潜在应用.BM-MSC和UC-MSC差异表达的基因是由它们的组织来源决定的,这将影响在细胞治疗中的选择.     

人脐带间充质干细胞对神经胶质瘤生长的抑制

背景:Wnt信号通路是决定肿瘤发生发展的关键通路。研究表明Dickkopf-1分泌蛋白能阻断Wnt信号向胞内的传递。目的:通过共培养体外观察人脐带间充质干细胞对C6胶质细胞瘤生长的抑制作用及其相关机制。方法:采用不同浓度的人脐带间充质干细胞条件培养液培养C6胶质瘤细胞。分别使用CCK-8和流式细胞仪对细胞增殖和细胞周期进行观察,以Western blotting法检测C6细胞中β-catenin和c-Myc的表达水平。酶联免疫吸附法检测人脐带间充质干细胞分泌Dickkopf-1的水平。利用抗Dickkopf-1的抗体中和人脐带间充质干细胞条件培养液中的Dickkopf-1,检测抗体中和后的效应。结果与结论:人脐带间充质干细胞能够抑制C6细胞的生长,将细胞周期阻滞在G0-G1期。在人脐带间充质干细胞条件培养液的作用下,C6细胞中β-catenin和c-Myc的表达下调。分泌蛋白Dickkopf-1的水平与人脐带间充质干细胞条件培养液的浓度呈正相关。随着条件培养液浓度的增加,人脐带间充质干细胞对C6细胞增殖的抑制效应增强。然而,当抗Dickkopf-1的抗体中和人脐带间充质干细胞条件培养液中的Dickkopf-1后,抑制作用减弱。结果表明,人脐带间充质干细胞通过分泌的一些可溶性因子如Dickkopf-1,能够抑制胶质瘤细胞的生长。     

人脐带源间充质干细胞静脉移植治疗大鼠肝纤维化

背景：近来国内外研究证明,来自其他组织的干细胞能够归巢到肝脏,并可能参与肝组织的再生,这为发展干细胞治疗肝脏疾病提供了新的希望。目的：探究人脐带源间充质干细胞的分离、培养方法,观察脐带间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化模型的修复作用,为脐带间充质干细胞的临床应用提供可靠的理论依据。方法：自然贴壁法分离、纯化人脐带间充质干细胞并进行体外培养和扩增,用皮下多点注射CCl4制备肝纤维化大鼠模型。将22只模型大鼠随机分为模型损伤组（n=11）和细胞移植组（n=11）。细胞移植组在模型制备成功后的第1,2,3周经尾静脉给予1＆#215;106脐带间充质干细胞治疗,4周后将大鼠处死,收集各组大鼠血液检测肝功能;摘取肝脏行苏木精-伊红染色,观察病理变化;免疫组化法观察库普弗细胞的数量及分布;免疫组化法观察治疗组脐带间充质干细胞的定位情况。结果与结论：脐带间充质干细胞经尾静脉移植入肝硬化大鼠后,大鼠的肝功能均明显改善,与对照组比较,差异有显著性意义（P＜0.05）;肝组织苏木精-伊红染色提示,肝纤维化程度明显改善;免疫组化法观察库普弗细胞的数量提示,库普弗细胞数量明显减少;免疫组化方法利用抗BrdU抗体在治疗组大鼠肝脏观察到BrdU标记的脐带间充质干细胞。说明脐带间充质干细胞移植可以改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的组织学结构。     

人脐带源间充质干细胞体内外移植的免疫学特征

背景：部分体外实验证实人脐带源间充质干细胞具有同种异体的免疫耐受特性,然而对其体内研究尚处于异种异体之间,且结果及机制缺少统一性。目的：培养人脐带源间充质干细胞,通过体内外试验分析其移植免疫学特性。方法：应用组织块贴壁法提取人脐带源间充质干细胞,通过体外淋巴细胞混合反应检测其同种异体免疫耐受作用;应用流式细胞仪检测体内行人脐带源间充质干细胞移植前后患者血液中CD4、CD8浓度及比值变化,并通过ELISA方法对比体外淋巴细胞混合培养前后血液、培养上清及体内移植前后患者血液中白细胞介素2,10、γ-干扰素的浓度变化。结果与结论：体内外实验中,混合淋巴细胞反应前后血浆及细胞上清中的细胞因子浓度变化呈相似趋势：白细胞介素10较反应前上升（P〈0.05）,γ-干扰素较反应前下降（P〈0.05）。人脐带源间充质干细胞移植后患者T细胞亚群中CD4＋/CD8＋比值较移植前轻度下降。说明人脐带源间充质干细胞具有同种异体免疫耐受及免疫调节作用。     

人脐带源间充质干细胞体内外移植的免疫学特征

背景:部分体外实验证实人脐带源间充质干细胞具有同种异体的免疫耐受特性,然而对其体内研究尚处于异种异体之间,且结果及机制缺少统一性。目的:培养人脐带源间充质干细胞,通过体内外试验分析其移植免疫学特性。方法:应用组织块贴壁法提取人脐带源间充质干细胞,通过体外淋巴细胞混合反应检测其同种异体免疫耐受作用;应用流式细胞仪检测体内行人脐带源间充质干细胞移植前后患者血液中CD4、CD8浓度及比值变化,并通过ELISA方法对比体外淋巴细胞混合培养前后血液、培养上清及体内移植前后患者血液中白细胞介素2,10、γ-干扰素的浓度变化。结果与结论:体内外实验中,混合淋巴细胞反应前后血浆及细胞上清中的细胞因子浓度变化呈相似趋势:白细胞介素10较反应前上升(P<0.05),γ-干扰素较反应前下降(P<0.05)。人脐带源间充质干细胞移植后患者T细胞亚群中CD4+/CD8+比值较移植前轻度下降。说明人脐带源间充质干细胞具有同种异体免疫耐受及免疫调节作用。     

人脐带源间充质干细胞临床输注前的优化制备

目的 探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)临床输注前制备成细胞悬液,细胞活性和细胞表面抗原的变化.方法 第3～5代人脐带源间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶消化处理,PBS洗涤5次,分别重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)或含有50 U/ml肝素-PBS、100 U/ml肝素-PBS、200 U/ml肝素-PBS中,放置于4℃、22C或37℃条件下,分别延长至1h、2h、3h,检测细胞存活率和细胞表面抗原的变化.结果 HUC-MSs收集后重悬于PBS中,在4℃条件下,随着在体外放置时间的延长,细胞的存活率在随之下降,但细胞存活率明显高于放置22℃、37℃条件下的细胞.将细胞收集后重悬于含有肝素的PBS溶液中,细胞既无聚集现象,而且随着肝素浓度的增加,细胞的存活率相对较高,体外短暂保存HUC-MSCs的效果较好.在含200 U/ml肝素的PBS溶液中,4℃条件下细胞放置3h后经苔盼兰染色镜下计数可知,HUC-MSCs存活率可维持在(91.3±3.08)％,而且HUC-MSCs表面仍高表达CD105、CD73、CD44、CD90.结论 临床输注前制备HUC-MSCs重悬于合200 U/ml肝素-PBS中在4℃条件下3h内可供临床有效输注.     

脐带源间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的护理体会

脊髓损伤是一种严重的致残性损伤,伤者多为青壮年,大多是由于车祸、高处坠落伤致脊柱骨折、脱位而造成脊髓损伤,是脊柱骨折最严重的合并症,临床表现为损伤平面以下的肢体感觉消失、运动功能障碍、神经反射部分或完全消失、括约肌功能障碍所引起的大小便失禁、自主神经系统功能障碍等,对脊髓不完全性损伤者,及时解除压迫后,脊髓功能可部分或全部恢复,但若压迫过久或损伤过重,造成脊髓缺血、缺氧,发生出血坏死或脊髓横断,严重影响患者的生活和心理健康.     

脐带间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

背景：脐血间充质干细胞具有很强的增殖能力和分化能力,在趋向分化作用下可以分化成胰岛β细胞,进而起到治疗糖尿病的作用。 目的：观察移植脐带间充质干细胞对大鼠糖尿病的治疗效果。 方法：30只雄性SD大鼠中随机取6只作为对照组,注射生理盐水;其中24只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后,随机等分为移植组和糖尿病组,移植组大鼠尾静脉注射移植脐带间充质干细胞。 结果与结论：造模后30 d,糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平,且高于对照组（P 〈0.05）。造模后,与糖尿病组相比,移植组大鼠空腹血糖水平显著下降（P 〈0.05）,体质量显著增加（P 〈0.01）,45 d时移植组大鼠空腹血糖水平与体质量接近对照组水平（P 〉0.05）,而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平,且体质量持续下降。提示脐带间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。     

葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长与代谢的影响

背景:目前对人脐带间充质干细胞的研究主要集中干细胞生物学特性与组织分化等领域的研究,对细胞代谢途径调控的报道还很少.目的:考察了不同起始浓度的葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长和代谢特征的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-02/06在北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理研究室完成.材料:采集产妇遗弃健康足月分娩胎儿脐带4份.方法:①从人脐带组织Wharton's Jelly中成功分离出人脐带间充质干细胞,采用流式细胞仪对分离培养的第3代人脐带间充质干细胞免疫分型进行分析.②将细胞以2.5×107L-1.接种于24孔板中,在含有不同起始葡萄糖浓度(0.31,2.78,6.12,21.58 mmol/L)、体积分数为0.10 FBS的DMEM培养基中培养,每隔24 h取样计数.③将细胞以2.5×108L-1的密度接种于25 cm2方瓶中培养96 h后,收集不同葡萄糖浓度作用后的细胞,采用流式细胞仪进行细胞周期分析.④将细胞以2.5×108L-1密度接种于含有不同起始葡萄糖浓度DMEM培养基75 cm2方瓶中,培养96 h后,离心收集上清和细胞,分别用干细胞代谢物检测与酶活性分析.主要观察指标:①人脐带间充质干细胞细胞形态和表面抗原表达.②细胞生长情况.③细胞周期检测.④细胞胞内外营养物、代谢副产物及酶活性的测定分析.结果:①采用流式细胞仪对人脐带间充质干细胞进检测,阳性表达的有CD13,CD29,CD44,CD105,CD147,CD90,CD71,表达率均高于90%,而造血干细胞特有标记CD34,CD45及白细胞抗原HLA-DR、CD38呈阴性表达.②葡萄糖能促进人脐带间充质干细胞的生长,但当培养基中缺失葡萄糖时,细胞也可维持生长,在120 h细胞达到最高密度11.6×107L-1.⑨细胞群体在G0/G1期的分布比例显著高于S期和G2/M期,随着葡萄糖浓度的增加,细胞群体处于G0/G1期的比例逐渐降低,S期相应增加.④当葡萄糖浓度为21.58 mmol/L时,己糖激酶与丙刚酸激酶活性分别比缺失葡萄糖时增加了39.7%和64.3%,而谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸等氨基酸的比消耗速率却随着葡萄糖浓度的增加而显著降低.结论:当培养基中缺失葡萄糖时,细胞可利用氨基酸等营养物维持生长;随着葡萄糖浓度的增加,细胞周期分布和葡萄糖代谢途径关键酶活发生改变,从而影响了人脐带间充质干细胞的生长与代谢特征.     

脐带和胚胎肝来源间充质干细胞生长特性的比较

背景：不同来源的干细胞具有不同的分子特征及生长特性,对疾病治疗的机制及效果可能会有所差异。目的：比较两种来源间充质干细胞的生物学特性。方法：分离培养人脐带源、胚胎肝来源的间充质干细胞,传至第5代时分别进行细胞形态观察,细胞群体倍增时间计算,细胞表面标志鉴定,诱导分化能力检测。另外将脐带源间充质干细胞继续培养至第10,15代,绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间。结果与结论：两种来源的间充质干细胞在对数生长期均为梭形,旋涡状生长,均具有成骨、成脂、成软骨分化的能力。两种间充质干细胞的生长曲线均为S形。第5代胎肝来源间充质干细胞的倍增时间为（34.37±0.31）h,脐带源间充质干细胞的倍增时间为（35.63±0.38）h,差异无显著性意义（P〉0.05）。第10代和第15代脐带源间充质干细胞的倍增时间分别为（52.6±0.53）h和（53.27±0.92）h,与第5代比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结果可见两种来源间充质干细胞生物学特性基本相同,肉眼观察胎肝来源间充质干细胞比脐带源间充质干细胞形态稍小,增殖较快,但统计学上差异无显著性意义。     

IL-1β促进脐带间充质干细胞的造血支持作用

本研究旨在探讨IL-1β对人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)的造血支持的影响。将分离得到的hUC-MSC以2×106接种于75 cm2培养瓶中,贴壁2 h后,加入10 ng/ml IL-1β培养36 h后收集培养上清和细胞。观察有/无IL-1β的条件培养液对CD34+细胞造血支持的影响;real time PCR检测加/不加IL-1βMSC的造血相关因子mRAN的变化;ELISA法检测造血相关因子的差异。结果表明,含有IL-1β的MSC条件培养液能明显增强CD34+细胞集落形成能力,且以粒系和粒-单核集落形成单位为主。IL-1β促进了MSC GM-CSF、G-CSF、IL-6的mRNA的表达,促进GM-CSF、G-CSF、IL-6蛋白自脐带MSC的分泌。结论:IL-1β能够增强MSC的造血支持能力,尤其是向髓系分化的能力。     

体外模拟干细胞微环境培养扩增脐血及脐带基质源性间充质干细胞

背景：建立稳健的扩增体系,在体外扩增时最大限度地获得治疗剂量的干细胞数,同时保存干细胞的特性是临床实验室亟待解决的问题。目的：建立体外模拟干细胞微环境细胞外基质扩增脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞的方法,并与传统的2-D培养体系比较。方法：建立体外模拟干细胞微环境细胞外基质,体外分离脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞后分别接种到细胞外基质及传统的2-D塑料培养体系,分别从细胞计数及细胞表面标志物的变化,评估两种扩增体系对脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞体外扩增的优劣。结果与结论：使用骨髓源性的细胞外基质培养体系单位时间脐血间充质干细胞及脐带间充质干细胞产量是2-D体系的4～6倍,并且流式细胞仪检测显示细胞外基质体系能更好地保持干细胞的表面标记。因此,3-D较2-D培养系更接近生理环境,已建立的骨髓源性细胞外基质培养体系能保持间充质干细胞的特性,为短时间内快速获取更大数目同质、高活性的间充质干细胞提供了可能。