丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原异质性分析

目的探讨不同基因型丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白的抗原特性及其用于抗-HCV检测的意义。方法分别构建和表达含有HCV1型和6型NS3基因片段的重组质粒和重组蛋白，以EIJSA法和Western blot分析不同基因型重组蛋白与已知抗-HCV阳性血清的抗原反应性。结果HCV1型和6型NS3重组蛋白氨基酸序列的同源性为83．2％；85份抗-HCV阳性血清以此不同基因型HCV NS3单片段抗原检测，阳性检出率分别为61．2％(1型)和58．8％(6型)，其中有7份标本以NS3-1型抗原检测阴性，但可被NS3-6型抗原检出，反之，有9份血清以NS3-6型重组蛋白检测为阴性，而NS3．1型检测阳性；54份大学生体检血清和39份阴性质控血清以此两种抗原检测均为阴性。结论HCV1型和6型NS3重组蛋白存在抗原异质性，在发展HCV抗体检测试剂时需考虑加入不同基因型的NS3抗原。     

庚型肝炎病毒NS5区优势抗原表位的表达及其抗原性的初步评价

目的 表达庚型肝炎病毒（HGV）基因且NS5区部分基因重组抗原，分析其抗原性。方法 分别亚克隆了HGV NS5a、NS5b以及NS5b与C区嵌和的基因至pThoiC表达载体上，构建成3个重组表达质粒，分别大肠埃希菌JM109（DE3），用IPTG诱导表达重组蛋白。表达产物经纯化后采用Western blot和间接ELISA方法分析3个重组蛋白的抗原性。结果 经酶切和序列分析鉴定正确，3种表达蛋白均高效表达且相对分子质量与预期大小相符。Western blot分析和间接ELISA试验表明，3种表达蛋白均能与抗－HGV阳性血清发生特异性反应。将应用重组蛋白检测的抗－HGV抗体与混合重组抗原（包括C区合成肽、NS5a合成肽、NS3区基因重组抗原）的检测结果进行了比较，在混合重组抗原阳性的22份血清中，P5a检出率为68％（15／22），P5b检出率为91％（20／22），Pc-5b检出率为73％（16／22）。在70份阴性标本中，3种抗原的检出率分别为P5a:7%(5/70);P5b:1%(1/70);Pc-5b:6%(4/70)。3个重组抗原单独检出阳性的标本，其中有一部分经RT－PCR检测亦为阳性。结论 原核表达的NS5区蛋白所检测的抗－HGV抗体不能完全被其他区段的抗原所覆盖，是免疫诊断HGV感染所必需的抗原表位之一。     

pSG5／NS5A5B△C质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的:构建pSG5/NS5A5B△C质炷,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达.方法:使用已经构建的pTM1-△C质粒,并检验其在NS2NS5A5B△C质粒为模板,根据pTM1、HCV NS5A5B△C、pSG5序列和酶切位点特点设计引物,PCR扩增得到HCVNS5ASB△C基因片段,将目的片段插入psG5载体中,经筛选阳性克隆、Sac Ⅰ和Bg/Ⅱ分别酶切鉴定后,用FuGene 6转染试剂转染入Huh7细胞.用免疫荧光染色、Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh-7细胞中的表达.结果:限制性内切酶Sac Ⅰ和BglⅡ分别酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致.荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白,该蛋白主要表达于细胞质,表达率达40%以上.Western blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C(82 ku)一致的条带.结论:成功构建了pSGS/NS5A5B△C质粒,并在Huh7细胞中成功瞬时表达,为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础.     

1b型丙型肝炎病毒NS3-4b重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的 构建1b型丙型肝炎病毒(HCV) NS34b基因重组腺相关病毒载体并了解其在HEK 293细胞中的表达,为进一步研究HCV重组腺相关病毒疫苗及其树突状细胞疫苗奠定前期基础.方法 收集基因1b型的丙型肝炎病人血清,用RT-PCR的方法扩增NS3-4b全长片段,与腺相关病毒的表达载体pAAV.CMV.eGFP重组,构建pAAV.CMV.HCV.NS3-4b重组表达载体,转染HEK293细胞,检测其蛋白表达情况.结果 PCR扩增获得的NS3-4b条带与预期大小(2838 bp)一致,重组质粒经双酶切和测序证实NS3-4b基因已重组成功,重组质粒转染HEK 293细胞后Western Blot图可见有目的蛋白表达.结论 成功构建腺相关病毒重组HCV NS3-4b载体并且其能在真核细胞中表达.     

血清中丙型肝炎NS3抗原ELISA检测方法的建立和初步应用

目的 评价血清中丙型肝炎病毒(HCV)游离NS3抗原的酶联免疫吸附(ELISA)检测方法的特异性和灵敏度,初步探讨该方法在临床应用中的意义.方法 对77例正常人血清标本,173例抗-HCV阳性标本和3708例抗-HCV阴性的其他类型肝炎血清标本检测HCV游离NS3抗原;对部分HCV NS3抗原阳性标本进行验证,包括HCV RNA测定、中和试验和免疫斑点试验;对11例患者的25份系列血清标本进行了HCV游离NS3抗原、HCV RNA和HCV抗体的联合检测,并结合临床资料综合分析.结果 3708例抗-HCV阴性的其他类型肝炎血清标本中有48例为HCV NS3抗原阳性,其中3030例单纯乙型肝炎和445例其他类型肝炎血清标本中分别有44例和4例为HCV NS3抗原阳性;173例HCV抗体阳性标本中有42例为HCV NS3抗原阳性;77例正常人血清标本的HCV NS3抗原检测结果均为阴性;15例HCV NS3抗原阳性标本中有9例为HCV RNA阳性;23例HCV NS3抗原阳性标本的中和率和免疫斑点试验的阳性率分别为87.0%和69.6%;25份系列血清标本的检测结果显示其HCV NS3抗原的吸光度值与时间呈负相关,并有2例HCV NS3抗原阳性标本随着血清中HCV NS3抗原的吸光度值下降,其HCV抗体转阳.结论 血清中HCV游离NS3抗原的ELISA检测方法有较好的特异性和敏感度,在发展中国家应用此方法进行HCV感染的早期诊断有一定的临床意义和推广价值.     

丙肝病毒单片段抗体检测分析

目的 探讨丙型肝炎病毒感染者抗.HCV各区段抗体的反应性及单片段抗体ELISA测定临床应用的可行性和应用价值.方法 留取经2种第三代丙肝病毒总抗体ELISA检测试剂A、B检测结果为阳性的血清36份、可疑血清2份、阴性血清40份,用丙肝单片段抗体检测试剂C对其进行检测,并以CHIRON公司第三代免疫印迹丙肝抗体确认试剂D检测结果作为对照.结果 78份血清中,抗HCV-C、NS3、NS4、NS5四区单片段抗体阳性检出率分别为44.87%、47.44%、30.77%、28.21%;单片段抗体检测试剂C的阳性率为43.59%,与第三代总抗体检测试剂A、B的阳性率(分别为48.72%和46.15%)无显著差异;试剂A、B检出的阳性血清36份中,根据试剂C的核心区、NS3、NS4及NS5区单片段抗体检测结果综合判断确定阳性结果34份,不确定结果2份,阳性符合率为94.44%;2份可疑血清根据单片段抗体检测结果综合判断均为不确定结果;40份阴性血清中,单片段抗体检测检出阴性结果40份,阴性符合率为100%.试剂C对所有78份血清检测结果为阳性34份,不确定4份,阴性40份;而确认试剂D检测结果为阳性34份,不确定3份,阴性41份.结论 NS3区和c区为抗-HCV ELISA检测中的主要血清学标志;单片段检测试剂C与第三代总抗体检测试剂A、B之间的检出率无显著差异,结果符合良好,且与国际上公认的CHIRON第三代免疫印迹丙肝抗体确认试剂检测结果高度一致.单片段抗体检测在临床判断病情、病毒复制情况及预后方面较总抗体检测能提供更多信息.     

丙型肝炎病毒抗原检测方法的建立

目的以特异性单克隆抗体为基础建立丙型肝炎病毒(HCV)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法,探索从血浆或血清中检测HCV抗原的可能性.方法利用我们制备的抗-HCV核心及NS3区单克隆抗体(McAbs),进行多种交叉组合模式的分析,确立实验室模式,并测定348份义务献血员血样,确定此方法的Cutofff值,并分析146份抗-HCV阳性及225份抗-HCV阴性血浆,阳性结果用套式PCR试剂盒确证.结果构建了以抗-HCV核心区单抗C39及NS3区单抗C7-6为包被抗体,以C39及NS3区C7-57为标记抗体的夹心ELISA检测模型,以C7为抗原,其检出灵敏度为5ng/ml,其Cutoff值为阴性对照均值±0.25.146份抗-HCV阳性样本中,11份为抗原反应阳性,225份抗-HCV阴性样本中,16份为抗原阳性,这些阳性样本经PCR检测后,23份为HCVRNA阳性.结论用单抗构建的HCV抗原检测方法分别从抗-HCV阳性及阴性样本中检测出HCV抗原反应阳性样本,并经PCR确证,表明直接从血浆样本中检测HCV抗原是可能的,这将对于HCV和基础研究及控制HCV的传播有重要意义.     

HCV非结构蛋白3真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3的构建

目的：构建HCV NS3基因真核表达载体，为进一步研究和解析HCV NS3基因诱发不死化人肝细胞癌化的机制准备了条件。方法：将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-3011质粒转化感受态菌JM109并扩增；提取pBRTM/HCV1-3011质粒；从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV NS3片段；并将其插入到克隆载体pMD18-T中，再与表达载体pcDNA3.1(-)重组，以得到重组的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3；最后限制性酶切鉴定HCV NS3表达载体。结果：从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCV NS3片段大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1/NS3内。结论：成功地构建了HCV NS3基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3。     

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2 细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究     

丙型肝炎病毒NS4区多肽的抗原性研究及应用

为挑选NS4中的优势抗原表位用于丙型肝炎病毒(HCV)的血清学检测,对相应区段的多肽进行了细致分析,以选择合适的肽段进行研究。在以Goldkey软件分析NS4肽氨基酸序列的基础上,采用人工合成肽技术合成了3条多肽,分别含15,21和28个氨基酸残基(依次命名为P15P21和P28),并研究了各肽段的抗原性。通过DNA合成和基因工程技术,表达了选择的优势抗原决定簇。将其用于HCV阳性和阴性系列血清的检测,结果表明,根据上述研究构建的融合NS4多肽抗原的抗原性优于合成肽,可用于作为HCVEIA的试剂。     

HCV核心-包膜E2抗原融合基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫应答试验

目的：观察一种结构新颖的HCV融合抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果，探讨其用于防治丙型肝炎的可行性。方法：用重叠延伸PCR拼接编码小鼠IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE的DNA片段，PCR分别扩增HCV核心抗原基因和包膜E2抗原基因，将3段基因插入真核表达载体pcDNA3.1，构成重组表达质粒pST-CE2t，转染COS7细胞，免疫组化检测HCV抗原的表达。将pST-CE2t和HCV核心抗DNA疫苗pcDNA3.1core分别肌肉注射接种BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果：pST-CE2t可在COS7细胞内表达HCV核心抗原和E2抗原，接种于BALB/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答，其中抗HCV核心抗原免疫应答的强度明显超过pcDNA3.1core，且更趋向于TH1型免疫应答。结论：pST-CE2t对于丙型肝炎的防治有潜在的应用价值。     

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒,表达纯化融合蛋白,分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct;合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em;分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30,筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm,转化E．coli M15,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白;可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白;Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性;纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化,该融合蛋白可作为HCV诊断抗原,也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。     

登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定

目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RTPCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut 菌诱导表达,SDSPAGE检测表达产物。结果RTPCR得到1.85kb的NS3基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长NS3基因;Mut 酵母转化菌可分泌表达Mr约78000的蛋白质,与DEN2多抗和登革2型病毒患者恢复期血清的免疫印迹证实它为型特异的重组NS3蛋白质。结论成功将克隆的全长DEN2NS3基因在酵母菌中表达,获得的重组NS3蛋白质具有免疫反应性。     

HCV NS5A基因在hepG2细胞中的表达以及对PI3K的影响

目的：探讨HCV—NS5A对PI3K表达的影响。方法：应用PCR技术从含有HCV全长开放阅读框的质粒中获得NS5A全长基因片段，利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．0（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定，NS5A基因已正确插入到pcDNA3．0（-）中，再利用脂质体转染HepG2细胞。结果：经RT—PCR及Western blot检测，HCV的NS5A基因在HepG2细胞中获得表达，而且在表达重组NS5A的转染HepG2细胞中，检测到PI3K蛋白的表达。结论：NS5A可在体外激活PI3K及其信号通路。     

慢性1b型丙型肝炎病毒感染者包膜2基因正选择位点分析及功能意义

目的:纵向分析自然免疫压力下慢性1b型HCV感染者E2基因的系统进化模式及正选择位点,初步探讨E2基因正选择位点的分布与已知功能区之间的关系。方法:未抗病毒治疗的3例慢性1b型HCV感染者及其系列血清样本均来自中国人HCV感染患者系列标本库(CQueen cohort)。对每例感染者3个连续时间点的血清样本进行HCV5′端6000bp基因组的扩增、克隆,每个时间点随机挑选25～33个克隆对E2基因测序,用MEGA软件构建系统进化树,用固定效应似然法检测HCV E2基因的正选择位点。结果:3例HCV慢性感染者的9份血清样本均获清晰、无杂带的6030bp的目的片段。慢性HCV感染者体内病毒准种的复杂程度并非随着感染时间的延长而进行性增加,在某个时间点上准种变异株的序列可能会趋于一致。准种优势变异株在间隔半年时间以上已发生更替。对每位患者动态的准种变异株进行正选择位点的分析,共检测到5个氨基酸(aa)位点:aa384、aa399、aa410、aa475和aa522,分布于HCV E2基因HVR1区、HVR2区及HCV E2-CD81分子结合区。结论:基于动态变化的HCV准种优势株的相关研究,可考虑选择间隔半年以上时间点的血清样本作为研究对象。慢性HCV感染过程中,HCV E2基因位于重要功能区的aa位点受到了宿主强烈的免疫压力,aa384、aa399及aa410位点的变异可能导致HCV发生体液免疫逃逸;而aa475和aa522位点的变异则可能通过影响HVR2区的功能或HCV E2-CD81分子的亲和力或改变CD81分子的结构而导致HCV发生先天免疫逃逸。该研究为分析HCV C-NS3基因片段的正选择位点奠定了良好的基础。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性研究

目的 研究HCV核心蛋白在大肠杆菌中的非融合表达及重组蛋白的免疫学特性。方法 用DNA重组技术在两种表达质粒（pQE3O和pTrcHisA）、4种宿主菌（DH5a,TOP10,BL21和M15）中表达HCV全长及羟基端部分缺失的核心蛋白（aal～191,aal～154和aal～69）,表达蛋白经SDSF-PAGE检测,免疫印亦分析,亲和层析法纯化后免疫BALB/C小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCV抗体水平。结果 HCV核心蛋白C154,C191在pQE30/M15中获得了表达,表达量分别占菌体总蛋白的18.2%和9.3%。免疫印迹分析的结果显示在C154和C191相应位置处出现杂交条带。ELISA结果显示C154和C191诱导小鼠产生了抗HCV抗体。结论 表达的重组蛋白具有抗原特异性和免疫原性。“截断”型HCV核心蛋白的抗原性和免疫原性并未因羧端的部分缺失而减弱。     

STUDY ON PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELL(PBMC) PROLIFERATIVE RESPONSES TO DIFFERENT HCV ANTIGENS IN PATIENTS WITH HEPATITIS C

为探讨丙型肝炎(HC)病人细胞免疫功能和丙型肝炎病毒(HCV)的致病机制及机体对其免疫保护作用,收集24例HC病人(急性3例,慢性21例),用3H-TdR掺入法研究病人外周血单个核细胞(PBMC)对不同HCV抗原增殖反应,并用流式细胞仪(FACS)检测了PBMC中CD4+、CD8+淋巴细胞亚群在HCV抗原刺激后的变化.结果:HC病人PBMC对HCV合成肽CP9,NS和基因重组抗原C,E1,E2,NS3刺激后出现不同程度增殖反应,刺激指数(SI)分别为1.69±0.51,1.61±0.54,1.68±0.58,1.49士0.44,1.44±0.44和1.33±0.33.3例急性HC中2例病人的PBMC对HCV抗原呈有效增殖反应(SI≥2.1),且血清HCVRNA阴转伴ALT正常.细胞表型分析显示:增殖的细胞表型是CD4+淋巴细胞,而CD8+淋巴细胞增殖反应较弱.结论:HC病人PBMC确实存在对HCV抗原的增殖反应;CD4+淋巴细胞比CD8+淋巴细胞增殖反应要强,急性HC病人PBMC对HCV抗原有效的增殖反应预示可能有良好的临床愈合.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响

目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用,并观察端粒酶活性原位检测法的应用价值.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5′(表达HCV NS3 N端多肽),pRcHCNS3-3′(表达HCV NS3C端多肽)和空白质粒pRcCMV转染NIH3T3细胞,分别获得11、11和8个阳性克隆;采用链霉素抗生物素-过氧化物酶法(SP)免疫组织化学方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法和端粒酶聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的定位和定量变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5′或pRcHCNS3-3′转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞质中,并以前者表达的阳性信号为强(χ2=6.667,P<0.05),各组细胞端粒酶活性存在显著差异(F=143.083,P<0.01),其中质粒pRcHCNS3-5′转染的NIH3T3细胞端粒酶活性最强,11个克隆均呈阳性,质粒pRcHCNS3-3′转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞最弱;HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(rs=0.808 4,P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性(rs=0.501 96,P<0.01).结论 (1) HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化;(2) HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;(3) 进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的技术.     

丙型肝炎病毒全长cDNA模板的构建及鉴定

目的 构建具有功能的丙型肝炎病毒(HCV)全长cDNA克隆。方法 应用长模板RTPCR法扩增1份上海地区HCV感染者血清的RNA(基因型为1b)，分段扩增、融合拼接成9．2kb的基因片段，克隆人含有HCV基因两端非编码区序列的载体作为模板。为检测此过程是否发生对特定变异株的选择，分析4个独立克隆的HVRl序列。对原核细胞中表达的HCV核心蛋白、NS3蛋白酶及解旋酶，以蛋白印迹实验确证其免疫反应性。并构建NS3／4A-SEAP表达系统检验NS3的蛋白酶活性。结果 获得丙型肝炎病毒全长cDNA模板。不同克隆间HVR1序列存在较大差异，提示长模板RT-PCR所制备HCVcDNA具有HCV基因准种(quasispecies)的特性。该模板编码基因在原核细胞内得到高效表达，并具有良好的免疫反应性。在NS3／4A-SEAP表达系统内，NS3可切割、释放其下游的SEAP，具有蛋白酶活性。结论 本工作为构建全长功能性HCV cDNA模板及感染性克隆奠定了基础。