中波紫外线辐射损伤角质形成细胞的p53信号传导通路研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射对角质形成细胞p53信号传导通路的影响.方法 以20、60和120mJ/cm²UVB辐射培养的取自健康儿童包皮的正常人表皮角质形成细胞,应用RT-PCR和免疫印迹方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平,检测分析UVB辐射后2h、24h和48h,p53及其下游分子MDM2、p21、Bax和GADD45的表达.结果 不同剂量UVB辐射角质形成细胞后均可见p53表达水平持续性显著升高(P<0.05).低剂量UVB辐射角质形成细胞后,MDM2、p21、GADD45升高不明显(P>0.05),Bax不表达;UVB辐射剂量升至60mJ/cm²后,MDM2于辐射后2h短暂性显著升高,p21和Bax持续性显著升高.结论 UVB辐射激活了角质形成细胞的p53信号传导通路,p53下游分子的表达具有剂量依赖性和时相性.     

结缔组织疾病

993538 UVB诱导凋亡角朊细胞膜SSA/Ro抗原表达具致病性,但在培养细胞上清液不能测到/王宝玺（协和医大）…//中华医学杂志（英文版）。-1999,112（6）。-512～515 为进一步了解紫外线对患红斑狼疮（LE）患者光敏性的潜在作用,患者照射紫外线后SSA/Ro抗体的产生机制及这种抗体在皮损发病机制中的作用,对原代培养人角朊细胞进行了研究。UVB照射后,以纯化的抗SSA/Ro血清处理,荧光标记的羊抗人IgG和PI染色,然后以RN酶、无RN酶的DN酶或RN酶加DN酶消化。作靶细胞的照射后角朊细胞与纯化的抗SSA/Ro血清共孵,加入或不加入新鲜人血清以提供补体。对SSA/Ro抗原以ELISA法在上清液中测定。UVB照射导致细胞表面出现凋亡小疮,由核糖核酸蛋白组成,内含SSA/Ro抗原,后者可与抗SSA/Ro血清结合,导致补体依赖性细胞毒作用,然而在上清液中并无SSA/Ro抗原被测到。作者认为免疫细胞对SSA/Ro抗原的识别及递呈可能是经细胞-细胞直接接触完成。图3参5（彭振辉）993539 细胞凋亡与系统性红斑狼疮/赵同峰（河南医大肾内科）//中华肾脏病杂志。-1999,15（2）。-124     

表没食子儿茶素没食子酸酯减轻UVB诱导的朗格汉斯细胞凋亡作用

目的 研究中波紫外线(UVB)对人表皮朗格汉斯细胞(LC)的光损伤作用以及绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的光保护作用。方法 采用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化人表皮LC,将分离纯化的LC随机分为对照组、30 mJ/cm² UVB辐射组以及辐射后加用200μg/mL EGCG处理组,4h后以PI染色并经流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 30 mJ/cm² UVB辐射组的凋亡率明显高于对照组,EGCG干预组的凋亡率低于单纯UVB辐射组,但仍高于非照射对照组;且辐射后S期细胞数明显增加。几乎没有G₂/M期的细胞,EGCG处理辐射细胞后,S期细胞数减少。结论 UVB可诱导人表皮LC凋亡,而EGCG具有一定的保护作用。     

紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

目的 观察紫外线照射对人角质形成细胞系HaCaT细胞表达结合珠蛋白的影响。方法 用逆转录-聚合酶链反应法检测长波紫外线UVA、中波紫外线UVB照射后HaCaT细胞各时相结合珠蛋白mRNA表达水平。结果 UVA12J/cm²照射后HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达明显升高。照射后20min结合珠蛋白mRNA表达已开始升高,6h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后2h、4h、6h、24h、48h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)UVB30mJ/cm²照射HaCaT细胞后结合珠蛋白mRNA表达也出现时相变化:4h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后20min、2h、4h、6h、12h、48h、72h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 紫外线UVA、311nmUVB上调HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达,随照射时间,结合珠蛋白mRNA表达呈时相变化。     

中波紫外线辐射剂量与HaCaT细胞凋亡时相的相关性研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射角质形成细胞后,UVB辐射剂量与角质形成细胞凋亡时相的相关性。方法 以20,40,60,80,100和120mJ/cm²的UVB辐射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,检测辐射后2,12,24,48和72h的细胞活性和细胞周期的变化,以及代表不同时相的凋亡通路:即应用广谱Caspase抑制剂VAD-FMK与凋亡细胞中活化的Caspase不可逆的结合检测早期Caspase介导的凋亡;应用AnnexinV及PI双染方法检测后发的细胞膜介导的凋亡;以及应用DNA的梯度凝胶电泳检测晚期细胞核介导的凋亡。结果 UVB辐射可使HaCaT细胞的细胞周期受滞于G2/M期,G2/M期的百分比与辐射剂量成正比。细胞活性于24h后与辐射剂量成反比。各时相的凋亡率均与辐射剂量成正比,但凋亡通路有明显的时相性:即早期(48h内)由Caspase和细胞膜介导凋亡为主,晚期(48h后)则由细胞核介导凋亡为主。结论 UVB诱导的角质形成细胞凋亡具有显著的剂量与时相依赖性特征。宜对其进行多指标、多时相的检测。     

中波紫外线辐射对人表皮角质形成细胞核因子κB转录活性的影响

目的 探讨中波紫外线(UVB)辐射对表皮角质形成细胞核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法 正常人表皮角质形成细胞取自健康儿童包皮,并培养于37℃、5%CO₂的培养箱中;以20、60和120 mJ/cm² UVB辐射培养细胞;分别提取UVB辐射0、2、24和48 h后角质形成细胞的全细胞蛋白、核蛋白和胞浆蛋白;免疫印迹方法检测分析全细胞蛋白和核蛋白的NF-κB/p65以及胞浆蛋白NF-κB抑制物(IκB-a)的动态变化;电泳迁移率变更分析(EMSA)方法检测分析NF-κB的转录活性。结果 UVB辐射可显著促进角质形成细胞总蛋白和核蛋白中NF-κB的蛋白表达(P<0.05),且表达量与辐射剂量成正比,UVB辐射后2 h即可有NF-κB的蛋白表达水平的升高。24 h后达高峰并持续高水平表达至48 h:不同剂量UVB辐射角质形成细胞后的不同时间,均可促进NF-κB转录活性:UVB辐射可显著抑制角质形成细胞胞浆IκB-a蛋白的表达(P<0.05)。结论 UVB辐射可显著促进角质形成细胞NF-κB的转录活性。     

中波紫外线激活HaCaT细胞炎症信号通路的实验研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)对角质形成细胞(KC)炎症信号通路的影响.方法 UVB(40 mJ/cm²)照射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,分别于照射后0、10、30、60、120、240min收集细胞蛋白和核蛋白,蛋白质印迹法检测NF-κB信号传导通路中的重要分子-磷酸化IκB-α(P-IκB-α)、IκB-α和NF-κB p65蛋白的动态变化,以及MAPK家族的蛋白分子ERK1/2、p38、c-JNK等磷酸化激活的动态变化.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,UVB照射后0.5h IκB-α开始发生磷酸化和降解,在第2、4小时时更加明显;细胞核蛋白p65的量在照射后0.5h开始升高,在随后的2h时达到高峰.UVB照射后10 min HaCaT细胞内的ERK1/2、p38、c-JNK蛋白的磷酸化就开始增加.结论 UVB照射KC可激活细胞内的NF-κB及MAPK信号传导通路.     

UVB与钙离子对体外培养人角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响

目的 研究中波紫外线(UVB)照射以及不同钙离子浓度对角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响.方法 通过改变培养基中的钙离子浓度以及采用不同剂量UVB照射体外培养的人角质形成细胞,在不同时间段以寻常型天疱疮(PV)或落叶型天疱疮(PF)血清作为一抗进行免疫荧光检测,观察寻常型天疱疮抗原(PVA)和落叶型天疱疮抗原(PFA)的表达情况;提取细胞或皮肤表皮组织蛋白质,用PV和PF血清进行免疫印迹检测.结果 无论是否增加钙离子浓度,体外培养人角质形成细胞间隙均可以检测到PV血清特异性着色.只有增加培养基中钙离子浓度后,形成的复层化角质形成细胞间隙才可以检测到PF血清特异性荧光着色.不同剂量UVB照射后的角质形成细胞均不产生PF血清的特异性着色.PF血清与160000条带反应,PV血清可与130000和160000两条带反应.结论 体外培养的单层或复层角质形成细胞均可以表达PVA,提高培养基中钙离子浓度可以诱导培养人角质形成细胞复层化并表达PFA,而UVB照射不能促使人角质形成细胞在体外培养条件下表达PFA.     

NB-UVB和阿维A对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响

目的 探讨阿维A和窄谱中波紫外线(NB-UVB)对培养的正常人角质形成细胞增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)mRNA表达的影响.方法 用1μmol/L阿维A和/或100mJ/cm²NB-UVB处理正常人角质形成细胞12h后,用MTT法、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR法分别检测细胞增殖和HB-EGFmRNA表达的改变.结果 1μmol/L阿维A和100mJ/cm²NB-UVB单独作用时,均可抑制角质形成细胞的增殖和上调HB-EGFmRNA的表达,两者联合作用时,对角质形成细胞增殖的抑制和HB-EGFmRNA的诱导作用更强,分别为19.7%和8.6倍,之后依次为1μmol/L阿维A(14.4%,7.1倍)和100mJ/cm²NB-UVB(8.7%,2.5倍).结论 阿维A和/或NB-UVB处理后,可协同上调HB-EGF的表达,可能参与调节二者对角质形成细胞增殖的抑制作用.     

益母草和枸杞对UVB损伤角质形成细胞的保护作用

目的探讨中草药益母草、枸杞对中波紫外线损伤角质形成细胞的保护作用及作用机制。方法用益母草和枸杞对HaCaT细胞进行预处理24h,采用30mJ/cm2、40mJ/cm2、50mJ/cm2剂量的UVB照射细胞,以MTT法检测细胞生存率,以酶联免疫吸附实验检测细胞上清液中TNF-α的分泌量,以Annexin-V凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。结果经UVB照射后,细胞损伤程度与UVB照射剂量有关,益母草和枸杞均可提高UVB照射后角质形成细胞的生存率,减少细胞因子TNF-α的分泌。UVB照射后早期细胞损伤以凋亡为主,晚期以死亡为主,UVB照射8h后益母草和枸杞预处理的HaCaT细胞凋亡率明显减少(P<0.05)。结论UVB对角质形成细胞有损伤作用,且与照射剂量相关,益母草和枸杞对角质形成细胞具有光保护作用。抑制TNF-α的释放和减少细胞凋亡可能是其保护作用机制之一。     

Induction of Ro/SSA antigen expression on keratinocyte cell membrane by heat shock and phorbol 12-myristate 13-acetate as well as estradiol and ultraviolet B

Skin is one of the main target organs in lupus erythematosus and in some circumstances, skin lesions precede systemic manifestations. Previous studies have demonstrated that Ro/SSA antigen antibody might be involved in the pathogenesis of lupus erythematosus. The present study was performed to investigate the factors regulating expression of Ro/SSA antigens on the cell surface of keratinocytes. Cultured normal human keratinocytes were treated with 50-200 mJ/cm(2) of ultraviolet B (UVB) irradiation, 10(-9) to 10(-5) mol/l of 17beta-estradiol, 5-10 microg/l of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), and 42 and 45 degrees C heat shock, respectively. The Ro/SSA antigen expressions were determined by indirect immunofluorescence. The results showed that keratinocytes receiving UVB irradiation expressed Ro/SSA antigen on cell membranes in a dose-dependent fashion. 17beta-estradiol treatment also induced Ro/SSA antigen expression dose-dependently. Keratinocyte expression of Ro/SSA antigens was also induced by heat shock stimulation. The 45 degrees C heat shock showed a stronger effect than 42 degrees C heat shock. Keratinocytes incubated for 24 h after heat shock had more antigen-expressing cells than those incubated for 6 h after heat shock. PMA at 5 and 10 microg/l also strongly induced Ro/SSA antigen expression. These results suggest that Ro/SSA antigen expression can be regulated by many factors and that protein kinase C signal transduction pathway might be involved in this process.     

NB-UVB对黑素细胞黑素合成相关基因表达的影响

目的：研究NB-UVB照射对黑素细胞的细胞活性、黑素合成、黑素合成相关基因表达的影响。方法：培养黑素细胞系PIG1，利用MTT法检测不同剂量NB-UVB（400、800、1200、1600、2000 mJ/cm2）照射后细胞的增殖率，采用NaOH裂解法测定细胞中的黑素含量，RT-PCR和Western blot方法检测UVB照射后12个黑素合成相关基因Tyr、Tyrp1、Tyrp2、OA1、MART-1、Pmel17、VAT-1、OCSP、syntenin、CHCHD3、flotillin-1、GPNMB的mRNA和蛋白的表达。结果：NB-UVB照射剂量在400、800、1200 mJ/cm² 时，细胞活力无明显变化，照射剂量为1600、2000 mJ/cm²时细胞活力明显下降。NB-UVB照射剂量为400、800、1200 mJ/cm² 时，随着照射剂量的增加，黑素的合成增加；NB-UVB照射后，12种黑素体蛋白中，Tyr、Tyrp2、GPNMB、Syntenin、MART-1的基因mRNA及蛋白表达显著升高。结论：UVB照射显著增加了黑素合成和相关基因的表达。     

118例志愿者紫外线最小红斑量值测定

目的 测定118例志愿者长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)的最小红斑量(MED)正常值。方法 以SUV1000型日光紫外模拟仪为光源,测定118例健康志愿者和非炎症性皮肤病患者UVA-MED和UVB-MED正常值。结果 UVA-MED均值男性为55J/cm²(18-95J/cm²),女性40J/cm²(15-100J/cm²);UVB-MED均值男性31mJ/cm²(12-95mJ/cm²),女性29mJ/cm²(8-95mJ/cm²)。男性UVA-MED显著高于女性(P<0.05),UVB-MED两性间差异无统计学意义(P>0.05)。皮肤光反应类型为Ⅲ型的受试者UVA-MED和UVB-MED均显著低于Ⅳ型(两种类型皮肤UVA-MED:在男性、女性均P<0.05;UVB-MED:在男性P<0.05,女性P<0.01)。女性的年龄与MED值无关;30-49岁男性UVB-MED低于其他年龄组,UVA-MED与年龄无关。遮光部位测得的UVA-MED和UVB-MED与户外停留时间长短无关。结论 皮肤光反应类型是决定MED的重要因素。     

核因子-κB反义寡核苷酸抑制紫外线诱导的HaCaT细胞反义分泌白介素6

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)反义寡核苷酸转染体外培养的HaCaT细胞反义株HaCaT后,对紫外线(UV)诱导的HaCaT细胞反义分泌炎症因子白介素6(IL-6)的抑制作用。方法 蛋白质印迹方法测定不同剂量中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞反义后NF-κBp65的变化;逆转录-聚合酶链反应测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后p65m RNA表达的变化;酶联免疫吸附测定法测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的HaCaT细胞反义分泌IL-6水平。结果 10、20、30mJ/cm² UVB辐照HaCaT细胞反义后均可显著促进NF-κBp65表达(P<0.05),不同浓度的NF-κBp65反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm² UVB诱导的p65mRNA表达和IL-6分泌均有显著抑制作用(P<0.05)。结论 脂质体介导的NF-κBp65反义寡核苷酸转染HaCaT细胞反义,可以抑制UV辐射诱导的HaCaT细胞反义产生IL-6,表明UV诱导HaCaT细胞反义产生IL-6可能是通过UV激活NF-κBp65的表达产生的。     

The cytotoxic effect of neonatal lupus erythematosus and maternal sera on keratinocyte cultures is complement-dependent and can be augmented by ultraviolet irradiation

Summary To elucidate the role of autoantibodies and ultraviolet (UV) exposure in the pathogenesis of the skin lesions in neonatal lupus erythematostis (NLE). keratinocytes were cultured, as the target cells, from a patient with NLE and from a normal neonate. We demonstrated that the expression of nuclear/cytoplasmic Ro/SSA and La/SSB molecules on to the surface of NLE keratinocytes occurred to a much greater extent than that on normal keratinocytes. A dose of 200 ml/cm² UVB irradiation on NLE keratinocytes induced a 2.5–3-fold increase in Ro/SSA and La/SSB expression compared to non-irradiated cells. Sera derived from both the NLE patient and from his mother exhibited a cytotoxie effect on NLE keratinocytes, but not on control cells, in the presence of complement. Furthermore, the cytotoxieity of the sera was enhanced on UVB-irradiated NLE keratinocytes. whereas it had no cytotoxie efects on UVB-irradiated control cells. This suggests that the abnormal expression of both Ro/SSA and La/SSB on the surface membrane of NLE keratinocytes induces the autoantibodies and complements to injure the cells. This complement-mediated cytotoxic effect can be augmented by UV irradiation, a concept not incompatible with the exacerbation of the skin eruption in sun-exposed skin sites.     

SSA/Ro antigen expression in simian virus 40-transformed human keratinocytes

SSA/Ro antigen is a soluble cellular component to which antibodies are frequently produced in patients with Sj?gren's syndrome and systemic lupus erythematosus. Its exact location within the cell has yet to be determined. In this study we report the expression of SSA/Ro antigen in simian virus 40 (SV40)-transformed keratinocytes. The locations of SSA/Ro, U1RNP, and DNA antigens were studied by indirect immunofluorescence using monospecific antibodies. SSA/Ro antigen was detected in both the nucleus and cytoplasm of SV40-transformed keratinocytes tested with three monospecific sera. Primary cultured keratinocytes derived from adult human skin showed localized immunofluorescent staining within the nucleus. When Ca++ concentration of the medium was switched to 0.05 mM, these cells expressed cytoplasmic SSA/Ro antigens within 48 h. Depletion of the antibody activity with insolubilized human spleen extract abolished the staining. Surface expression of this antigen could not be detected in either primary or transformed cells. Localization of U1RNP and DNA was not altered. These results indicate that expression of SSA/Ro antigen in human keratinocytes is modulated by SV40 infection and that this antigen is expressed to a greater degree in cells that are less differentiated, transformed, or proliferating.