人高转移性和低转移性前列腺癌细胞株荧光差异凝胶电泳图像分析

目的:比较人高转移性前列腺癌细胞株(PC-3M) 和人低转移性前列腺癌细胞株(PC-3) 间差异表达的蛋白质,拟发现早期诊断和逆转前列腺癌转移的分子标志物。方法: 应用差异凝胶电泳(DIGE),分离PC-3M和PC-3 细胞株的总蛋白,用图像分析软件比较分析并识别细胞间的差异表达蛋白质。结果: 应用DIGE进行分离后,成功地获得了蛋白质组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）成功鉴定出11种蛋白质,其中9个蛋白质点仅在PC-3中有表达,2个蛋白质点仅在PC-3M中有表达。结论: 人高、低转移前列腺癌细胞株的蛋白质组表达存在明显差异,这些差异蛋白质有可能为进一步发现前列腺癌转移相关分子和阐明前列腺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据。     

RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立

目的 为研究CD147分子在前列腺癌PC-3细胞中的生物学功能,通过RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达CD147分子的前列腺癌PC-3细胞株.方法 利用脂质体2000将靶向CD147干扰质粒导入前列腺癌细胞中,干扰前列腺癌细胞中CD147分子的表达;有限稀释法获取单个细胞克隆,通过G418筛选出抗性克隆并利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western-blot免疫印迹法分别从转录水平和蛋白水平进行鉴定.结果 与转染pSilencer-Scramble对照质粒比较,转染pSilencer-CD147干扰质粒明显抑制CD147基因和蛋白表达水平(P<0.05).结论 靶向CD147的干涉载体能有效沉默PC-3细胞中CD147基因和蛋白的表达,通过G418筛选建立出稳定细胞株,为进一步研究CD147的功能打下基础.     

人前列腺癌细胞骨转移潜能差异表达蛋白的研究

目的 研究人前列腺癌不同骨转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选前列腺癌骨转移相关蛋白并探讨其功能.方法 应用蛋白质组学和免疫印迹等.方法比较和筛选来源相同但具有不同骨转移潜能的前列腺癌细胞株(PC-3/骨转移亚克隆T3B/淋巴结转移亚克隆P2-4)的蛋白质表达差异.构建高迁移率族蛋白1(HMGB1)的真核表达载体Pgenesil-1/HMGB1siRNA转染至高骨转移潜能的T3B细胞中,通过动物实验观察HMGB1对前列腺癌细胞骨转移的影响.结果 蛋白质组学技术获得6个有意义的蛋白质,分别参与细胞骨架构成、转录调控、磷酸化过程和物质代谢等功能.成功构建siRNA表达载体Pgenesil-1/HMGB1siRNA,转染后可使T3B细胞HMGB1的蛋白表达水平显著降低(P<0.05).动物实验显示,抑制HMGB1表达可明显降低T3B细胞的骨转移能力(P<0.05).结论 高骨转移潜能的前列腺癌细胞株中存在与前列腺癌骨转移相关的蛋白质,HMGB1与前列腺癌骨转移密切相关.应用siRNA干扰技术能有效地抑制HMGB1基因的表达,同时也能有效抑制前列癌细胞的骨转移能力.     

hERβ全长基因真核表达载体的构建及在PC-3M细胞中的表达

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:RT-PCR法从人卵巢组织钓取hERβ全长基因,序列测定后,应用基因重组技术构建真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经酶切和PCR电泳鉴定后,采用质脂体转染法转染PC-3M细胞。结果:经限制性酶切鉴定和测序分析证实,成功地完成hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达,PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并在PC-3M细胞内成功表达。     

抗凋亡基因Bfl-1在前列腺癌中的表达及作用

目的 检测Bcl2相关蛋白A1(Bfl-1) mRNA在前列腺癌细胞株、前列腺癌组织及良性前列腺增生组织中的表达,观测阻断Bfl-1表达对前列腺癌细胞的影响,探讨Bfl-1在前列腺癌发生发展中的作用.方法 采用RT-PCR、实时荧光定量PCR(Q-PCR)、cDNA探针原位杂交(ISH)等技术检测Bfl-1 mRNA在前列腺癌组织、细胞株和良性前列腺增生组织的表达水平;结合临床资料分析Bfl-1的表达与临床病理指标的关系;利用反义寡核苷酸干预前列腺癌细胞株,RT-PCR检测Bfl-1表达,MTT法检测细胞的存活,倒置显微镜下观察前列腺癌细胞的形态变化.结果 RT-PCR、Q-PCR结果显示Bfl-1 mRNA在激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和DU145中高表达,在激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP中未见表达,表达差异有统计学意义(P＜0.05);原位杂交结果显示Bfl-1mRNA在前列腺癌组织中高表达,而在良性前列腺增生组织中未见表达,表达差异有统计学意义(P＜0.05);有转移、分期高的前列腺癌病例的Bfl-1 mRNA表达水平高于无转移、分期低的病例(P＜0.05);Bfl-1反义寡核苷酸转染PC-3和DU145细胞后,Bfl-1表达下调,细胞生长受到抑制(P＜0.05),细胞脱落、碎裂形成大小不一的细胞团块.结论 激素非依赖性前列腺癌细胞的生长与Bfl 1过表达有关;干预Bfl-1表达可能成为晚期前列腺癌治疗的新策略.     

CD147RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞系生物学行为的影响

目的 研究针对CD147 RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞系生物学行为的影响.方法 利用针对CD147 RNA干扰片段构建的表达载体转染PC-3细胞,获得稳定表达株.通过RT-PCR和Western blotting 鉴定后进行前列腺癌细胞侵袭力实验和动物实验.结果 RT-PCR和Western blotting结果表明干扰片段可以较好地封闭前列腺癌PC-3细胞CD147分子mRNA和蛋白表达水平;与转染空质粒组相比.CD147干扰组前列腺癌PC-3细胞侵袭力下降,荷瘤裸鼠成瘤力下降(P＜0.05),抑瘤率达32.82%.结论 KNA干扰封闭CD147基因能抑制前列腺癌细胞的侵袭力和成瘤力.有可能成为前列腺癌基因治疗的新途径.     

雄激素受体对IgG蛋白表达及前列腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的 研究前列腺癌细胞中雄激素受体(AR)对免疫球蛋白lgG表达的影响,及对前列腺癌细胞增殖、迁移的作用.方法 (1)Western blot检测雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCap与去势抵抗性前列腺癌细胞株PC-3中AR、IgG蛋白的表达;(2)AR基因(pCDNA3.1+)转染PC-3构建AR过表达的PC-3-AR细胞,沉默LNCap中AR基因表达构建LNCap-siAR细胞;Westernblot检测AR及IgG表达量;Q-PCR检测细胞株中IgG mRNA表达量;四氮甲基唑氮、细胞划痕方法检测细胞的增殖及迁移能力.结果 LNCap细胞与PC-3细胞相比较,AR高表达,IgG低表达(P＜0.05).PC-3-AR细胞lgG降低表达(P＜0.01),细胞增殖及迁移能力减弱;LNCap-siAR细胞IgG增高表达(P＜0.01),细胞增殖及迁移能力增强.结论 AR调控IgG蛋白表达呈负相关并与前列腺癌细胞增殖、迁移能力相关.     

热休克蛋白60在多西紫杉醇治疗激素非依赖性前列腺癌过程中的差异表达

目的 分别比较热休克蛋白60(HSP60)在多西紫杉醇(Docetaxel)诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及耐药前后表达的差异,并探讨其意义。方法 采用20μmol/L Docetaxel诱导PC-3细胞凋亡,后采用逐渐加量的方式培养PC-3细胞Docetaxel耐药株;采用双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)技术定量筛选未处理组PC-3细胞与凋亡PC-3细胞,及PC-3细胞敏感株与耐药株的差异蛋白,并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对其进行成分鉴定,进而检测HSP60的表达。结果 HSP60在Docetaxel诱导PC-3凋亡细胞中表达上调,在Docetaxel耐药株中表达下调。结论 HSP60在PC-3凋亡细胞中高表达,在Docetaxel耐药株中的低表达,提示其可能与PC-3细胞的凋亡及耐药有重要关系。     

MADD抑制人前列腺癌PC-3细胞凋亡作用的研究

目的：检测含促分裂素原活化蛋白激酶激活死亡结构域蛋白（MAPK-activating death domain-containing protein,MADD）在前列腺癌组织及良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,BPH）组织中的表达并探讨其对前列腺癌细胞凋亡的作用。方法：收集40例人前列腺癌及35例BPH组织,免疫组化染色技术检测MADD的表达情况;Western blot技术检测MADD在人前列腺癌细胞株（LNCaP、PC-3和PC-3M）和良性前列腺细胞株（BPH1）中的表达情况;应用MADD siRNA转染人前列腺癌PC-3细胞,Western blot检测其MADD、caspase-3和PARP表达,MTT和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡变化。结果：MADD在前列腺癌组织中的表达高于BPH组织（P=0.000）;人前列腺癌细胞株LNCaP、PC-3M和PC-3中MADD表达水平明显高于良性前列腺细胞株BPH1（P=0.009、P=0.001、P=0.000）,沉默PC-3细胞中MADD表达,导致活化型caspase-3和PARP降解产物表达增加,并诱导PC-3细胞凋亡增加和增殖活力降低（P=0.000）。结论：前列腺癌组织中MADD表达明显增高,MADD在前列腺癌中可能作为凋亡抑制因子发挥功能。     

食管鳞状细胞癌与癌旁组织蛋白表达谱的差异

目的应用蛋白质组学方法筛选食管鳞状细胞癌组织与癌旁正常食管组织中的差异表达蛋白质。方法收集10例食管鳞状细胞癌组织及其配对的正常食管组织,提取组织蛋白质,进行二维电泳,经图像分析识别差异表达蛋白,应用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱分析鉴定差异表达蛋白质;应用免疫组化检测HSP27、ANX1在40例食管鳞状细胞癌组织标本及其配对的食管正常上皮组织中的表达。结果通过肽指纹图谱分析鉴定了6个差异表达蛋白质,SCCA1、KRT4和ANX1在食管鳞状细胞癌组织中表达下调,TIM1、MnSOD和HSP27在食管鳞状细胞癌组织中表达上调。免疫组化检测显示HSP27在食管鳞状细胞癌组织中高表达,ANX1在食管鳞状细胞癌组织中低表达,与蛋白质组学的分析结果一致。结论食管鳞状细胞癌与癌旁正常组织之间存在蛋白质表达差异。寻找食管鳞状细胞癌组织与正常食管组织之间表达差异蛋白质,为探讨食管鳞状细胞癌发病分子机制提供了有用依据。