人精原干细胞的体外培养及其功能鉴定

目的:通过应用多种培养条件下的生殖细胞共培养体系,寻求人精原干细胞(SSC)长期体外生存和扩增的优化途径。方法:应用磁式分选所获得的α6+Thy-1+c-k it-细胞,分别以STO、MEF、Sertoli细胞为饲养层,于DMEM/F12、DMEM或DMEM-SF培养液条件下短期培养,然后选择胎儿Sertoli细胞作为共培养体系,在32℃、5%CO2、DMEM/F12(含10%胎牛血清)培养条件下,分别观察成人和胎儿生殖细胞的长期培养结果。并应用免疫组化技术和SSC移植技术对培养细胞进行初步生物学特性和功能鉴定。结果:在短期培养中,α6+Thy-1+c-k it-细胞在存在饲养层时,可在DMEM和DMEM/F12培养液中稳定生存,1周内存活率可达90%。长期培养条件下,α6+Thy-1+c-k it-细胞逐渐与Sertoli细胞形成紧密的贴附或镶嵌关系,呈单个、成对、短链状或小团簇状;胎儿SSC与成人类似,部分以圆球形散在分布于Sertoli细胞表面,并常可观察到明显的成对或短链状细胞,部分呈有突起的长梭形扁平细胞,与Sertoli细胞相互形成紧密连接;经反复传代3个月,仍可观察到稳定存在的圆球形SSC贴附于Ser-toli细胞表面。由PKH26标记的α6+Thy-1+c-k it-细胞在移植后2个月可迁移至裸鼠生精小管基膜,表现为单个或成对的细胞。生精小管内荧光细胞计数显示α6+Thy-1+c-k it-细胞在体外培养2、4周后仍然保留54.9%和9.2%的SSC。结论:该培养系统的进一步优化将有利于体外产生大量SSC,并有助于进一步深入了解SSC的生物学特性和男性生精功能障碍的治疗。     

人精原干细胞特异性标志的初步筛选

目的:寻求可能用于人精原干细胞(SSC)分离和纯化的特异性表面标志。方法:通过免疫组化方法,应用造血干细胞(HSC)表面标志c-kit、Thy-1,人胚胎干细胞(ES)表面标志阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、SSEA-4、碱性磷酸酶(ALP),原始生殖细胞(PGC)标志SSEA-1以及小鼠SSC表面标志α6和β1整合素对成人及胎儿睾丸SSC的特异性表达进行筛选和鉴定。结果:在成人睾丸组织中,α6整合素在生精小管生殖细胞表面存在较广泛而显著阳性表达,而β1整合素主要在生精小管基底部细胞存在显著阳性染色,Thy-1在成人睾丸生精小管基底部细胞可见散在阳性染色,少量间质细胞中亦可见阳性染色。上述3种抗原标志在成人生殖细胞表面的表达具有一定的特异性。在胎儿睾丸生精小管中,可见SSEA-1在生殖细胞表面存在显著阳性表达,具有明显特异性。结论:α6、β1整合素和Thy-1可作为阳性标志用于人SSC的分选。SSEA-1可作为识别胎儿SSC的特异性标志。     

经睾丸网移植小鼠精原干细胞的研究

目的研究经睾丸网移植小鼠同种精原干细胞的可行性。方法经~(60)Co-γ射线全身照射后,在基因型相似的Balb/c小鼠间经睾丸网进行精原干细胞移植,移植后3个月,观察其生精恢复情况。结果形态学证实,成功移植的小鼠精原干细胞生精过程部分恢复。结论在基因型相似的Balb/c小鼠间经睾丸网进行精原干细胞移植是可行的。     

精原干细胞移植研究近展

在非灵长类哺乳动物睾丸中，As(Asingle)型精原细胞是精子发生的干细胞。在As型精原细胞分裂的基础上，其子代细胞彼此分开变为两个新的T细胞，或者仍停留在一起，成为通过细胞间桥连接的Aal(Aaligned)型精原细胞。Apr精原细胞是精子发牛普系中的第一代细胞，它将进入分化旁路，进一步发展     

BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定

目的:建立小鼠精原干细胞长期培养体系,探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法:收集出生4~6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良的两步消化法获得细胞悬液,种植到铺有明胶的培养皿中,分别于种植后1、5、24 h通过差速贴壁法去除体细胞,获得高度纯化的精原干细胞,种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分;添加20 ng/ml大鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和200 ng/ml DDNF受体α1(GFRα1)促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT-PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果:饲养层上培养3~4 d后精原干细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块状;小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上;而GFRα1显著表达在培养的精原干细胞膜表面;RT-PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRα1、Sox2和c-Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论:BALB/c小鼠精原干细胞可在体外长期培养(3个月),该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。     

小鼠精原干细胞分选

目的:寻求富集小鼠精原干细胞的有效方法。方法:取6周龄雄性昆明白小鼠20只,手术制作成双侧隐睾模型,继续饲养2~3个月后,切取睾丸,用酶两步消化法制成单细胞悬液,加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c-k it抗体冰浴20 m in后,利用流式细胞仪筛选出具有side scatterlo、α6-integrin+、c-k it-特征的细胞,苔盼兰染色监测细胞活性。另取20只小鼠作为对照组,相同条件下饲养相同时间。结果:隐睾小鼠筛选出的精原干细胞占睾丸细胞总数的2.8%,95%以上的细胞具有活性。结论:利用免疫荧光激活细胞分选术能分离出大量有活性的精原干细胞。     

人精原干细胞分离、培养与鉴定

目的 :分离、鉴定和培养人精原干细胞(SSC),以获得纯化、富集的人SSC并为其研究与应用奠定基础。方法:通过免疫荧光方法检测睾丸组织中CD90表达情况;应用两步酶消化和差速贴壁法分离人睾丸生精细胞,以CD90为人SSC标志,用免疫磁珠分选技术(MACS)对人睾丸生精细胞进行分选,并利用RT-PCR和免疫细胞化学对分选所得CD90+细胞进行鉴定;同时用SG培养液将CD90+细胞与支持细胞进行体外共培养。结果:MACS分选所得CD90+细胞大小、形态特征较为均一,RT-PCR检测其表达人SSC标记性基因,免疫荧光检测其高表达人SSC特异标记GFRA-1、GPR125和UCHL-1,阳性率达90.5%,其在SG培养液中与支持细胞共培养14 d后仍可保持良好活性。结论:CD90可作为人SSC特异性标志之一,结合差速贴壁和MACS可高效分选人SSC,分选所得SSC可在SG培养液中进行体外培养。     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞是具有自我更新和多向分化潜能等特性的多能干细胞 ,可在自身基因和 /或外来信号调节下最终分化为精子 ,对其研究近年来倍受关注。本文介绍了精原干细胞的富集、初次分选技术 ,增殖调控因子以及移植技术的研究进展。     

生长因子对人精原干细胞体外存活和增殖的影响

目的:探讨3种生长因子——干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)和碱性成纤维细胞生长因子(bF-GF)对精原干细胞(SSCs)体外存活及增殖的作用。方法:在培养液中加入不同浓度的SCF、LIF和bFGF,各生长因子均设浓度为0、5、10、20μg/L4个浓度组,每种生长因子不同浓度1式3份,每隔8～12h观察细胞的体外存活及增殖情况。应用光镜、电镜观察SSCs的形态结构特点。结果:培养液中加入不同浓度的SCF、LIF及bFGF后,SSCs的存活时间均比对照组有所延长,组间比较差异有显著性(P<0.05)。结论:生长因子SCF、LIF和bF-GF等可促进SSCs体外存活及增殖。     

精原干细胞移植现状和应用前景

精原干细胞是雄性生殖干细胞,它的自我增殖能力为男性生殖细胞永久产生所必需。随着体外培养、冷冻保存、卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)技术的发展,精原干细胞移植技术在医学基础研究和临床应用方面越来越显示出重要的应用前景。本文对精原干细胞的起源、分化、移植现状和移植技术在医学领域的应用前景进行综述。     

环磷酰胺干扰精原干细胞功能的初步研究

目的:初步探讨环磷酰胺对精原干细胞分化功能的干扰作用。方法:根据W istar大鼠生精细胞发育不同阶段分为1、3、9周龄组,每组24只,随机均分为实验组和对照组,实验组腹腔内注射环磷酰胺100 mg/(kg.体重),对照组注射等量生理盐水,24 h后用原位缺口末端标记法检测生精细胞凋亡。另取仅有精原干细胞的1周龄W istar雄性大鼠60只,随机均分为实验组和对照组(给药方法同上),在给药后24 h、3周、9周分别用免疫组化法检测c-K it蛋白,流式细胞仪分析细胞周期。结果:环磷酰胺干预后,1周龄实验组与对照组大鼠生精细胞凋亡差异无显著性(P>0.05),其余各周龄组实验组生精细胞凋亡均显著增高(P<0.01)。1周龄实验组大鼠睾丸在环磷酰胺处理后不同时间点的细胞周期S期细胞比例、精原细胞c-K it蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.01)。结论:环磷酰胺诱导精原干细胞凋亡不明显,可能更重要的是干扰精原干细胞的增殖分化功能。     

小鼠精原干细胞体外培养体系的建立

目的:建立小鼠精原干细胞体外扩增的培养体系。方法:取出生后2~6d的雄性ICR小鼠30只,脱颈法处死,切取睾丸后,采用两步酶消化法制成单细胞悬液,添加特定培养液,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养。培养后通过BrdU整合实验检测其增殖能力,并用碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定。结果:小鼠精原干细胞在体外稳定增殖,所得克隆AP强阳性,标记物检测GFRα-1+/Oct-4+/VASA+/SCP3-,基因表达GFRα-1+/Oct-4+/SCP3-,证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。结论:在本研究建立的培养体系下小鼠精原干细胞可稳定传代并保持未分化状态,为探索体外精子发生过程提供了良好的研究平台。     

精原干细胞去分化和多能性的研究进展

精原干细胞是具有终身有丝分裂能力进行自我复制同时也可分化成单倍体精子的生殖细胞。最近,一些研究发现精原干细胞可在体外被诱导成多能干细胞。提示精原干细胞可成为再生医学所需多能干细胞的很好来源,尤其是获得没有免疫排斥、患者自身来源的多能干细胞。本综述将重点介绍目前对精原干细胞多能性的认识及其在再生医学中应用的优势。     

精原干细胞龛境研究进展

精原干细胞是一群能够自我更新并具有多向分化潜能的永生细胞。"干细胞龛"理论最初是在造血系统中提出来的,龛同样也存在于睾丸组织中。精原干细胞龛在睾丸中是半开放的隔离体系,具有特定的数量调控及随年龄变化的特征。两种内源性因子nanos2和Plzf调控精原干细胞自我更新。龛细胞分泌因子胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)也调节精原细胞的更新。     

精原干细胞龛境研究进展

精原干细胞是一群能够自我更新并具有多向分化潜能的永生细胞。＂干细胞龛＂理论最初是在造血系统中提出来的,龛同样也存在于睾丸组织中。精原干细胞龛在睾丸中是半开放的隔离体系,具有特定的数量调控及随年龄变化的特征。两种内源性因子nanos2和Plzf调控精原干细胞自我更新。龛细胞分泌因子胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）也调节精原细胞的更新。