ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV／恒河猴模型，掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态，为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考，我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、sTLV、SRV／D和B病毒感染的恒河猴，用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴，使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法，监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况，持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况，IFN—YELISPOT结果和CD4＋T细胞数无相关性，与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围，了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系，完善了SIV／SAIDS模型评价指标，为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。     

基于基因的艾滋病疫苗的研究

T淋巴细胞应答在控制人免疫缺陷病毒或猴免疫缺陷病毒(SIV)感染中有重要作用。通常采用恒河猴感染SIV或嵌合SHIV病毒为实验模型,接种DNA疫苗来诱导T淋巴细胞应答及检验疫苗保护效应。在灵长类动物上,DNA疫苗的免疫原性取决于基因表达水平、SIV蛋白中抗原的选择、融合蛋白的使用、接种途径及佐剂的添加。最近研究表明,用DNA致敏,用表达相应SIV抗原的减毒重组病毒载体进行强化,可以提高特异免疫原性,防止致病病毒的攻击。目前,DNA疫苗作为基于基因的获得性免疫缺陷综合征疫苗已进入治疗性或预防性的临床试验阶段。     

DCs疫苗的制备及动物抑瘤实验研究

目的　为研究疫苗在肿瘤防治领域的应用。方法　选择了以MCA38肿瘤细胞作为体外冲击树状突细胞的肿瘤抗原来源 ,以C57BL/ 6 (H - 2 6)近交系小鼠为实验动物制备树状突细胞疫苗并建立动物实验。结果　树状突细胞疫苗接种组瘤重与对照组相比明显减小 (P <0 0 5 ) ,6 0d无肿瘤生长率明显高于对照组 (P <0 0 5 )。结论　树状突细胞疫苗可有效抑制肿瘤的发生与生长     

SIVmac239毒株经静脉及直肠感染中国恒河猴的比较

目的研究猴免疫缺陷病毒SIVmac239毒株经静脉及直肠途径感染中国恒河猴后的生物学特性和症状表现,并比较由感染途径不同导致的差异,为该模型系统的应用提供依据。方法以SIVmac239毒株经静脉感染19只中国恒河猴,经直肠感染6只中国恒河猴,观察至感染后232或168d,比较其抗猴免疫缺陷病毒(SIV)特异性抗体滴度、CD4 T细胞数量、血浆病毒载量、淋巴结病理改变以及临床表现的变化。结果所有猴均出现SIV抗体阳转。在静脉感染猴,感染后10d检测到SIV特异的IgM,而直肠感染猴始终未能检测到。在感染后168d,静脉感染猴的SIV特异性IgG的平均水平较直肠感染猴高10倍。在观察期内,直肠感染组的CD4 T细胞数下降不如静脉感染组显著。所有猴的血浆SIV载量均在感染后10~14d达到高峰(107拷贝/ml左右),约2个月后降至平台期(103~106拷贝/ml)。2只静脉感染猴及1只直肠感染猴在感染后150~210d死于猴免疫缺陷综合征,呈快速进展型改变。结论SIVmac239毒株静脉及直肠感染接种中国恒河猴,均可建立慢性的SIV感染,其特征与人感染人类免疫缺陷病毒后的改变相似,均可以作为良好的研究获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的动物模型,尤其有助于预防性或治疗性AIDS疫苗的研究。     

食蟹猴体内、外感染SIVmac251后产毒水平的比较研究

目的探索在猴免疫缺陷病毒（SIV）造模之前选择适宜于制作此模型的猕猴个体的方法,以减少感染后血浆病毒水平过低的几率,从而保证实验的质量.方法测定SIV感染前实验猴外周血单个核细胞（PBMC）在试管内感染SIV后的产毒水平,并与该个体在感染同一株SIV后血浆病毒载量的水平进行比较分析,判断此法能否用于选择适于造模的实验猴.结果根据14只食蟹猴的结果,体外与体内的病毒水平符合比为10/14,体内病毒载量偏低的猴6只（6/14）,体外病毒水平偏低者4只,如把这4只猴排除,则余下10只猴体内病毒载量偏低的猴为3只（3/10）.结论应用检测体外PBMC病毒产量水平的方法,选择病毒水平高的猴才用于体内感染SIV.这样能部分去除体内感染的病毒载量偏低的猴.但最终的解决方法仍是建立培育遗传背景清楚的SPF实验猴群.     

AIDS疫苗研究的新目标:防止疾病而不是感染

自从分离出AIDS病毒以来,科学家就致力于寻求能完全防止感染的疫苗。AIDS病毒易于逃避免疫监测,疫苗研究者担心,即便只有一个病毒感染细胞,就能最终导致发生AIDS病。因此,唯一安全的途径是发现能完全阻止感染的疫苗,造成所谓的“无病毒免疫”。在疫苗研制中,多以SIV感染猴来进行试验。SIV是猿类免疫缺陷病毒,是HIV的猿类病毒。过去及现在令人失望的结果,迫使研究人员重新考虑这种全或无的策略。     

DCs疫苗的制备及动物抑制实验研究

目的：为研究疫苗在肿瘤防治领域的应用。方法：选择了以MCA38肿瘤细胞作为体外冲击树状突细胞的肿瘤抗原来源，以C57BL／6（H－2^6)近交系小鼠为实验动物制备树状突细胞疫苗并建立动物实验。结果：树状突细胞疫苗接种组瘤重与对照组相比明显减小（P＜0．05），60d无肿瘤生长率明显高于对照组（P＜0．05）。结论：树状突细胞疫苗可有效抑制肿瘤的发生与生长。     

恒河猴Mamu-A*01基因与SIV/SHIV感染相关的研究进展

SIV/SHIV感染的恒河猴是研究艾滋病及艾滋病药物筛选、疫苗评价较理想的动物模型.MHC在细胞免疫中起着关键作用,研究表明,MHC-I类分子的多态性与SIV/SHIV感染者的疾病进展有着明显的关联作用,Mamu-A*01是恒河猴中的一种MHC-I类分子,它可以呈递特定的病毒蛋白片段到细胞的表面,从而激发CTL反应.国外发现Mamu-A*01阳性的猴艾滋病恒河猴会出现疾病进展缓慢,存活时间长等特征.本文就恒河猴Mamu-A*01基因与SIV/SHIV感染相关的研究进展做一综述,以期进一步加深对MHC在疫苗研究中的作用的了解,并促进更行之有效地对HIV/AIDS疫苗进行评价.     

猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

目的初步明确猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）耐9-（2-磷酸甲氧丙基）腺嘌呤（PMPA）突变基因位点,指导SIV／恒河猴模型在药物评价中的应用。方法SlVmae239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4^＋T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4^＋T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M5021可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV／恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。     

PCR在猴艾滋病模型中检测SIV基因的应用

我们设计了两对特异的聚合酶链式反应(PCR)扩增SIV基因的引物，建设了SIV感染的PCR基因扩增检测法，实验结果表明，PCR方法可检出0．01Pg水平的SIV基因．PCR法、检测与病毒分离相比较，PCR检查敏感性高，特异性强，特别是恒河猴实验感染后期，病毒分离多为阴性，而PCR检查均获阳性结果。PCR基因扩增检测法应用于猴艾滋病模型的研究．将有助乎艾滋病药物的体内实验治疗和艾滋病疫苗的效果评价。     

猴免疫缺陷病毒急性及慢性感染淋巴结的病理变化

【目的】观察猴免疫缺陷病毒(SIV)急性及慢性感染猴淋巴结的病理改变，以掌握评价抗艾滋病药物、疫苗及免疫调节剂疗效指标，并探索猴艾滋病毒感染及猴艾滋病(SIV／SAIDS)的发病机制。【方法】采用SIVmax病毒急性及慢性感染恒河猴40只，先后分别在不同时间作淋巴结活检68例次及尸检死亡猴7只的淋巴结，对淋巴结进行病理常规切片、染色、光镜检查。【结果】淋巴结的病理变化可分为3个型：(1)增生型(感染后3～6或9个月)；(2)退化型(感染后6～12或14个月)；(3)耗竭型(11个月以上及部分中途死亡猴)。猴SIV感染的淋巴结病变与人HIV／AIDS的淋巴结的病变比较，两者的病变极为相似。【结论】猴SIV感染淋巴结病变的3个型可以作为猴艾滋病发生、发展和恶化的观察指标，SIV感染猴模型可以作为抗艾滋病药物、疫苗和免疫调节剂的疗效评价的动物模型和研究艾滋病发病机制的理想动物模型。     

中药艾可清体外抑制猴免疫缺陷病毒活性的观察

以猴免疫缺陷病毒（SIV）和相应的CEMx－174细胞系统为模型,以3-叠氮胸苷（azidothymidine,AZT）为阳性对照药物,以抗原阳性细胞抑制率、病毒产量、细胞病变和SIV－1p27抗原表达抑制率为指标,观察了以清热解毒中药（紫花地丁、夏枯草、黄芩等）为主组成的艾可清复方对SIV的体外抑制作用。结果表明：中药艾可清在亚细胞毒性浓度（1：320）对抗原阳性细胞抑制率为69．6％,病毒产量显著下降,SIV-1p27抗原表达抑制百分率为94．67％,基本可以抑制细胞病变。综合4项指标,艾可清抑制SIV活性ED50为1：1280。提示该方在体外具有明显的抑制SIV活性作用。     

AIDS疫苗需在人群中进行临床试验

用猴免疫缺陷病毒(SIV)灭活疫苗在猴模型中进行疫苗临床实验方法研究,所积累的资料,预示一种人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗的原型正在出现。但在有效的HIV灭活疫苗可用于人类之前,仍存在许多需要解决的问题: 1.抗原多样性如果证明外层包膜糖蛋白抗原特异性在临床上具有重要意义,在病毒纯化和浓缩过程中就可将有关抗原的必须组合加     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

口腔暴露可导致SIV迅速传播

研究人员在近期出版的《获得性免疫缺陷综合征》(AIDS)杂志上刊文指出,在恒河猴口腔内接种猿猴免疫缺陷病毒(SIV)可导致这种病毒迅速扩散；该结果有可能预示HIV感染亦可出现类似的进程,从而进一步阻碍有效的疫苗应答。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

艾滋病猴特异性细胞免疫的胞内细胞因子检测方法优化与应用

目的为准确检测艾滋病猴模型特异性细胞免疫,优化、确定胞内细胞因子染色(ICS)影响因素和条件。方法使用三种多克隆激活剂分别刺激SIV感染猴外周血单个核细胞(PBMC),确定最佳阳性刺激物和刺激时间;然后使用五种浓度SIVmac239混合肽库分别刺激SIV感染猴PBMC,体外培养,不同时间点进行细胞染色和流式检测,确定肽库的最适刺激浓度和最佳刺激时间。最后,初步应用该方法检测SIV感染猴细胞免疫水平。结果PMA+离子霉素组合可用作本实验的阳性刺激物;2 μg/mL肽库,37℃ 5% CO₂ 培养16 h,能更有效的刺激T细胞分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ。结论该方法的优化对艾滋病药物的临床前评价和疫苗研发等研究具有重要意义。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

动物实验表明AIDS无潜伏期

美国的两个研究小组近日报道说,AIDS(获得性免疫缺陷综合征,艾滋病)病毒可在感染发生的几天之内就使半数以上的能够辨认并抗击病毒的免疫细胞遭受严重破坏;该研究发现将迫使科学家们重新评估如何防治这种致命的病毒感染。在猴子中进行的两项独立实验证实猴免疫缺陷病毒(SIV)进入机体后即开始攻击 CD4记忆 T-细胞,并在几天内摧毁半数以上。美国国立变态反应和传染病研究所(NIAID)的 Mario Roederer 博士及其同事在近期出版的《自然》杂志上刊文指出,研究结果有可能要求研究人员重新考虑抗 HIV 药物和疫苗的设计策略,抑制并减缓早期病毒的感染。通过检测 CD4记忆 T-细胞存量以预测不同 HIV 感     

中药注射液喘可治对艾滋病猴模型Th17和Treg平衡的影响

【目的】研究温阳补肾中药注射液喘可治对艾滋病模型猴辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)平衡的影响。【方法】选用12只猴免疫缺陷病毒(SIV)慢性感染的中国恒河猴,分别连续给予肌肉注射喘可治(治疗组,剂量为0.4 mg·kg-1·d-1)及生理盐水(对照组)2个月;于治疗前、治疗第4周和第8周分别检测SIV病毒载量,采用流式细胞仪分析外周血CD4、CD8、Th17(CD4+IL-17A+)和Treg(CD25+FoxP3+)细胞动态变化。【结果】喘可治对病毒载量,CD4、CD8细胞数无明显影响,可使CD25+FoxP3+和CD25+FoxP3-细胞显著减少(P0.05),CD4+IL-17A+显著减少(P0.05),Th17/Treg比值略降低。【结论】喘可治可同时降低SIV慢性感染猴外周血的Th17和Treg细胞水平。