甲状旁腺素非PLC依赖PKC通路激活增强成骨细胞CITED1表达

目的通过相关信号通路屏蔽和基因表达分析,探讨甲状旁腺素（PTH）非PLC依赖PKC信号转导途径（PTH/nonPLC/
PKC）的功能,分析其对骨代谢的影响。方法取2~3 d C57BL乳鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,取贴壁生长的第1代细胞,随机分
为4 组：100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）（简称GR（1-28））+10 nmol/L RP-cAMP;10 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）
（简称GR（1-34））+10 nmol/L RP-cAMP;10 nmol/L PTH（1-34）及空白对照组加入等体积的0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid,
TFA）,作用4 h后,提取各组总RNA,行小鼠全基因组表达谱芯片分析,筛选出可能与nonPLC/PKC信号转导通路相关的差异表
达基因,并进行相关通路分析。RT-PCR 筛选及验证上述差异表达基因。培养MC3T3-E1 细胞,分为4 组：GR（1-28）+
RP-cAMP;GR（1-34）+RP-cAMP;GR（1-34）+RP-cAMP+100 nmol/L Go6983 及空白对照组,RT-PCR 法验证比较GR（1-28）和
GR（1-34）引起的基因表达变化情况。结果倒置相差显微镜观察示,培养7 d见细胞排列紧密,为三角形或多边形,呈铺路石样;
细胞培养14 d ALP染色可见胞质中出现蓝染颗粒,成骨诱导培养28 d茜素红染色可见红色矿化结节形成。基因芯片分析结果
中筛选出与PTH的nonPLC/PKC 信号转导通路相关性最大的56 个基因,进行RT-PCR 验证后发现CITED1 的表达量在GR
（1-34）+RP-cAMP组显著高于GR（1-28）+RP-cAMP组及空白对照组,但小于PTH（1-34）组（P<0.05）。MC3T3-E1细胞RT-PCR
验证的结果与其一致,在阻断cAMP/PKA信号通路后,仅CITED1基因表达量在GR（1-28）和GR（1-34）刺激时存在显著不同,
且加入PKC抑制剂（Go6983）后,表达差异消失。结论PTH的nonPLC/PKC信号转导通路的激活能够使得成骨细胞CITED1
的表达量明显升高,介导PTH对成骨代谢的作用。该途径不依赖PLC和PKA信号的激活。
     

信号选择性甲状旁腺素模拟肽促进去势雄性小鼠的骨折愈合

目的观察间断皮下注射信号选择性甲状旁腺素（PTH）模拟肽对去势雄性小鼠骨折愈合的影响。方法36只7周龄C57/
BL雄性小鼠去势,1 周后制作股骨中段骨折模型,术后用人重组甲状旁腺素（hPTH（1-34））,信号选择性PTH模拟肽［Gly1,
Arg19］hPTH（1-34）（G1,R19（1-28））和等量溶解剂注射,于术后14 d和28 d处死,双能X线骨密度仪测量骨痂区骨密度以及骨矿
物含量;术侧骨折愈合情况通过X线、显微CT、生物力学和组织学显示。结果术后14 d,G1,R19（1-28）组骨密度显著高于对照组
（P<0.05）。最大力和刚度G1,R19（1-28）低于hPTH（1-34）组。X线和显微CT显示,G1,R19（1-28）组骨痂的改建和重塑优于对照
组,略差于hPTH（1-34）组。结论信号选择性甲状旁腺素模拟肽G1,R19（1-28）促进骨折的愈合,cAMP/PKA通路对促进骨折愈
合具有重要作用。
     

NIPA2通过JAK/STAT信号通路对高糖诱导的成骨细胞凋亡的调控作用及其机制

目的：探讨普瑞德-威利/安格曼综合征区域蛋白2（NIPA2）对高糖诱导的成骨细胞凋亡的影响,阐明其作用机制。方法：将成骨细胞MC3T3-E1采用26 nmol·L^-1高糖处理24 h,将细胞分为HG+si-con组（转染si-con）、HG+si-NIPA2组（转染si-NIPA2）、HG+si-NIPA2+DMSO组（转染si-NIPA2后再用DMSO处理）和HG+si-NIPA2+AG490组（转染si-NIPA2后再用AG490处理）,另设对照组。采用脂质体法转染MC3T3-E1细胞,再用26 nmol·L^-1高糖处理;采用qRT-PCR法检测MC3T3-E1细胞中NIPA2 mRNA表达水平,Western blotting法检测细胞中NIPA2、P21、Cleavedcaspase-3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：与对照组比较,HG组MC3T3-E1细胞中NIPA2 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。敲减NIPA2后,与HG+si-con组比较,HG+si-NIPA2组MC3T3-E1细胞中NIPA2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,P21和Cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,MC3T3-E1细胞在48和72 h时细胞增殖活性明显降低（P<0.01）,细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,JAK/STAT信号通路相关蛋白p-JAK2和p-STAT3的表达水平明显升高（P<0.01）。与HG+si-NIPA2+DMSO组比较,HG+si-NIPA2+AG490组MC3T3-E1细胞中NIPA2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,P21和Cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,在48和72 h时细胞增殖活性明显升高（P<0.01）,细胞凋亡率明显降低（P<0.01）。结论：NIPA2对高糖诱导的成骨细胞增殖和凋亡具有调控作用,其调控机制与JAK/STAT信号通路有关。     

临床有效剂量的洛伐他汀对前列腺癌PC3细胞的影响

目的：研究临床有效剂量的洛伐他汀对前列腺癌PC3细胞的影响。方法：将PC3细胞分为空白对照组、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO)对照组、洛伐他汀处理组、洛伐他汀与甲羟戊酸（mevalonic acid）同时处理组,处理时间点分别为24、48和72 h。运用MTT方法检测细胞活力,［³H］掺入法和细胞计数法检测细胞增殖改变,Western blot检测凋亡关键分子casepase3、casepase7、多聚ADP-核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase,PARP］裂解蛋白（cleaved PARP, cPARP）等。结果：临床有效剂量2 μmol/L洛伐他汀作用PC3细胞48 h后细胞增殖率比DMSO对照组降低了39.29%［（63.69%±3.69%）vs（102.98%±6.84%）,P=0.000］,72 h后降低了44.24%［（52.79%±9.88%）vs (97.03%±0.87%), P=0.048］; 2 μmol/L洛伐他汀作用PC3细胞72 h后,数量显著减少［(4.86×10⁵ ± 0.10×10⁵) vs (9.66×10⁵ ± 0.10×10⁵), P=0.000］; PC3细胞活力在2 μmol/L洛伐他汀作用48和72 h后分别降低了50.12% ［(56.52%±6.40%) vs (106.64%±5.27%),P=0.000］和60.05%［(41.99%±11.64% ) vs (102.94%±8.49%),P=0.000］,此外,2 μmol/L洛伐他汀还诱导凋亡关键分子caspase7活化及其受体PARP蛋白裂解。结论：临床有效剂量的洛伐他汀可抑制前列腺癌细胞PC3的增殖并诱导细胞凋亡。     

p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达

目的 构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响.方法 设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR 检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选.22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Western blot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡.结果 酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108 TU/ml. p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P<0.01),其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高.Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01).p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(P<0.01);p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P<0.05,P<0.01).结论 成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡.     

葡萄糖酸锌碳点在细胞成像和体外促进成骨分化中的作用

目的：通过一步水热法合成葡萄糖酸锌碳点（Zn-CDs）,探讨Zn-CDs的细胞成像及其对小鼠前成骨细胞向成骨方向分化的促进作用。方法：一步水热法合成Zn-CDs,采用透射电子显微镜（TEM）、荧光光谱仪和傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）观察检测Zn-CDs的表征。将不同浓度（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 mg· L^-1） Zn-CDs浸提液与小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1共培养作为实验组,空白对照组仅加入细胞培养液。采用MTT法检测各组MC3T-E1细胞相对增殖率（RGR）;采用激光共聚焦成像观察MC3T3-E1细胞的成像特点;采用qRT-PCR法检测各组MC3T3-E1细胞中Runt相关转录因子2基因（Runx2）、碱性磷酸酶基因（ALP）和骨钙素（OC） mRNA相对表达水平;茜素红染色检测各组细胞中钙化结节数。结果：TEM检测,成功合成粒径为5.25 nm的Zn-CDs。荧光光谱,Zn-CDs具有360 nm紫外光激发和450 nm蓝光发射的荧光性质,并表现激发波长依赖特性。FT-IR检测,Zn-CDs表面主要由羧基和羟基基团构成。与空白对照组比较,共培养24 h时1 000.00 mg·L^-1Zn-CDs组MC3T3-E1细胞的RGR明显降低（P<0.01）。荧光成像,Zn-CDs与MC3T3-E1细胞共培养后,细胞呈现蓝色、绿色和红色的荧光图像,形态轮廓清楚且荧光强度细胞质比细胞核强。qRT-PCR检测,随着Zn-CDs浓度的增加,MC3T3-E1细胞中Runx2、ALP和OCmRNA相对表达水平逐渐升高。茜素红染色,诱导21 d后不同浓度Zn-CDs组MC3T3-E1细胞中钙结节数多于空白对照组。结论：Zn-CDs可以有效地进行MC3T3-E1细胞荧光成像,且Zn-CDs具有一定的促MC3T3-E1细胞向成骨方向分化的作用。     

CITED1 63-84 氨基酸片段是影响其细胞定位与成骨作用的关键区域

目的生物信息学分析发现CITED1 63-84氨基酸片段为其重要的功能片段,进一步研究CITED1 63-84氨基酸片段突变
(丝氨酸突变为丙氨酸）是否影响其进核及成骨分化,探讨其在成骨分化过程中的生物学调控功能。方法CITED1 63-84 突变
质粒（9S>A）,CITED1质粒及空白质粒分别转染MC3T3-E1细胞,培养2 d,用100 nmol/L PTH（1-34）刺激细胞,行细胞免疫荧
光实验,共聚焦镜下观察细胞内CITED1位置变化。将CITED1 63-84突变质粒（9S>A）,CITED1质粒及空白质粒按相应体系
转染MC3T3-E1 细胞,分为两组,一组成骨诱导4 周,另一组成骨诱导基础上进行10 nmol/L PTH（1-34）间歇刺激（每48 h 刺
激4 h）4周,测ALP酶活性及Ca离子浓度并进行ALP及茜素红染色。行RT-PCR实验分析成骨相关基因ALP2,RUNX2,OC的
表达量。结果PTH（1-34）可促进CITED1 进核,将CITED1 氨基酸63-84 片段突变后,可明显抑制该反应。4 周成骨诱导后,
CITED1过表达明显抑制成骨细胞分化,ALP及Ca离子浓度明显低于对照组,而CITED1突变质粒（9S>A）过表达ALP及Ca离
子浓度明显高于CITED1 组,与对照组基本相同。进一步研究表明,CITED1 过表达抑制PTH（1-34）诱导的成骨细胞分化,而
CITED1 突变质粒（9S>A）可逆转该反应。ALP染色及茜素红染色也验证了以上结论。RT-PCR结果提示：CITED1 突变质粒
（9S>A）过表达成骨相关基因ALP2,RUNX2,OC明显高于CITED1质粒过表达。结论CITED1 63-84片段丝氨酸为其重要的
功能位点,可影响其细胞进核及成骨分化。     

杜仲叶提取物对MC3T3-E1细胞增殖作用的实验研究

目的研究杜仲叶提取物（Euec）对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1细胞生长、增殖的影响及其分子机制。方法采用Euec与MC3T3-E1细胞体外共同培养,MTT法检测不同浓度Euec处理MC3T3-E1细胞24、48、72h后的细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果4．0～125．0μg／ml的Euec能促进MC3T3-E1细胞增殖,其中7.8μg／ml的Euec对MC3T3-E1细胞增殖的促进作用最强。流式细胞仪检测显示,6.25μg／ml的Euec作用MC3T3-E1细胞48h后,G0/G1期成骨样细胞显著减少,S期成骨样细胞增多,G2/M期成骨样细胞显著增多。结论Euec可促进MC3T3-E1细胞向G2／M期转换,使G1期的成骨样细胞减少,G2期的成骨样细胞显著增加,从而促进细胞的有丝分裂和细胞的增殖。     

一种新型hPTH(1-34)基因相关肽的制备及其应用的初步研究

目的:对hPTH(1-34)进行结构改造,提高蛋白水解酶的稳定性,增强酶活性,使之更适合制成滴鼻剂,并验证治疗骨质疏松症的效果.方法:确定将hPTH(1-34)改造成为Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro后,构建表达质粒pED-4PhPTH(1-34),转化E.coli BL21(DE3)LysE,乳糖诱导表达,经分离纯化获得目的多肽.将目的多肽与二甲基-β-环糊精、聚丙烯酸、EDTA制成滴鼻剂,治疗卵巢摘除大鼠(OVXed Rats)的骨质疏松症.结果:获得纯度较高的Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro,将制成的滴鼻剂用于卵巢摘除大鼠,与生理盐水滴鼻治疗组相比能显著增加大鼠椎骨骨密度(P<0.01)及股骨头骨小梁厚度(P<0.001),对鼻黏膜没有损伤.结论:Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症效果明显,有进一步开发的前景.     

Necroptosis与细胞凋亡在激素诱导成骨细胞死亡中的相互作用

目的探讨Necroptosis与凋亡在激素诱导成骨细胞死亡中的相互作用。方法向MC3T3-E1细胞内添加浓度为10-6 mol/L 的地塞米松诱导细胞死亡，随后在本组细胞中分别添加凋亡抑制剂z-VAD-fmk（40 μmol/L）和Necroptosis抑制剂Necrostatin-1 （40 μmol/L），作用2 h 后，AV/PI 双染观察细胞死亡的变化情况，并对细胞进行Hoechst 染色计算凋亡率，用透射电镜观察细 胞超微结构的改变，测定细胞线粒体膜电位和ATP水平，对Necroptosis 和凋亡通路的相关蛋白进行Western blot 检测。结果 10-6 mol/L地塞米松可以诱导MC3T3-E1细胞同时发生凋亡和Necroptosis。AV/PI双染的结果发现，当凋亡受到抑制后，更多的 细胞发生坏死（P<0.01），而透射电镜结果也证实细胞发生了坏死样改变，Hoechst 染色结果发现，凋亡细胞数明显减少（P< 0.01）；当使用Necroptosis特异性抑制剂Necrostatin-1将这种作用阻断后，包括Hoechst染色和AV/PI双染的结果都证实凋亡的 细胞数明显增多（P<0.01），同时，在这一作用过程中伴随着MMP及ATP的明显变化（P<0.01）。结论在激素诱导成骨细胞死亡 过程中，Necroptosis和凋亡在一定条件下可以相互转化，这一转化过程中伴随着线粒体功能的明显改变。     

RETINOIC ACID DOWN-REGULATES BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 7 EXPRESSION IN RAT WITH CLEFT PALATE

Objective To evaluate the effects of retinoic acid （RA） on expression of bone morphogenetic protein 7 （ BMP-7 ） in rat fetus with cleft palate, and the effects of RA on proliferation and apoptosis of osteoblasts. Methods All-trans RA （ATRA） was used to induce congenital cleft palate in Wistar rat. BMP-7 mRNA expression in maxillary bone tissue of fetal rats was measured by Northern blotting analysis. Flow cytometry and MTF assay were used to measure the apoptosis and proliferation of ATRA-treated MC-3T3-E1 cells. BMP-7 mRNA and protein expressions in ATRA-treated MC-3T3-E1 cells were detected by RT-PCR and Western blotting analysis. Remilts ATRA could induce cleft palate of rat fetus. The incidence rate of cleft palate induced by 100 mg/kg AT-RA （45.5%） was significantly higher than 50 mg/kg ATRA （ 12.5%, P 〈 0. 05 ）. BMP-7 mRNA expression decreased in maxillary bone tissue of rat fetus with cleft palate. MC-3T3-E1 cells proliferation treated with 1 × 10^-6 mol/L ATRA decreased by 60%, the cell apoptosis increased by 2 times. BMP-7 mRNA and protein levels in MC-3T3-E1 cells treated with 1 × 10^-6 mol/L ATRA decreased by 60% and 80%, respectively, compared with ATRA-untreated cells （ P 〈 0.05 ）. Conclusions BMP-7 may play an important role in embryonic palate development. RA may possess the ability to down-regulate cell proliferation through regulation of BMP-7 gene expression.     

玉米紫色植株色素对染氟MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度的玉米紫色植株色素（Maize Purple Plant Pigment,MPPP）对体外染氟的MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用。方法：通过MTT法分别观察浓度范围均为10-10~10-2mol/L的MPPP和NaF对细胞增殖情况的影响,根据上述结果选择两者适宜浓度,再进行联合培养,最终观察MPPP对染氟的MC3T3-E1细胞增殖的影响。结果：氟对MC3T3-E1细胞增殖无促进作用,较高浓度的氟可抑制细胞增殖（P〈0.05）;培养48 h,终浓度为10-5mol/L的MPPP可促进染氟（10-3mol/L）MC3T3-E1细胞增殖（P〈0.05）。结论：MPPP可增强染氟MC3T3-E1细胞的增殖能力。     

活性氧与铁死亡通路相互作用在丙酮醛引起的小鼠胚胎成骨细胞损伤中起重要作用

目的 探讨活性氧和铁死亡在丙酮醛诱导小鼠胚胎成骨细胞（MC3T3-E1）损伤中是否存在相互作用。方法 应用丙酮醛损伤MC3T3-E1细胞建立模拟糖尿病骨质损伤的细胞模型。应用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定MC3T3-E1细胞的存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位;双氯荧光素（DCFH-DA）荧光显微镜照相法检测胞内活性氧水平;碱性磷酸酶试剂盒检测定碱性磷酸酶活性;茜素红染色观察成骨细胞晚期标志物-矿化结节的形成;铁离子试剂盒检测铁离子水平;Western blot检测成骨细胞的抑制铁死亡的标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达水平。结果 0.6 mmol/L 丙酮醛处理MC3T3-E1细胞24 h可明显减少GPX4的表达（P<0.001）,同时可使胞内铁离子浓度升高,细胞存活率降低,线粒体膜电位丢失,胞内活性氧水平升高,碱性磷酸酶活性降低和矿化结节减少（P<0.001）。应用2 mmol/L 活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸和丙酮醛共处理MC3T3-E1细胞24 h可增加GPX4的表达（P<0.01）,应用4 μmol/L铁死亡抑制剂铁抑素-1与丙酮醛共处理成骨细胞24 h可使胞内活性氧水平降低（P<0.001）;应用N-乙酰半胱氨酸或铁抑素-1与丙酮醛共处理成骨细胞24 h均能对抗丙酮醛引起的上述其他细胞损伤（P<0.001）。结论 活性氧与铁死亡通路相互作用在丙酮醛引起MC3T3-E1成骨细胞损伤中起重要的作用。     

磷酸肌酸对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化的影响

目的 探讨磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)对体外培养的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖、成骨分化及矿化的影响.方法 在体外培养的MC3T3-E1细胞中,分别加入含不同浓度(5,10,20 mmol·L-1)的PCr进行培养,并以不给予PCr药物处理的组为空白对照组.采用MTT法检测MC3T3-E1细胞的增殖情况;使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测MC3T3-E1细胞内ALP的活性;采用Western Blot法检测MC3T3-E1细胞内ALP、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的蛋白表达情况;利用茜素红染色法检测MC3T3-E1细胞形成矿化的能力.结果 PCr可以促进MC3T3-E1细胞的增殖且具时间依赖性,当处理12 h时,PCr对细胞无明显促增殖作用(P＞0.05);然而当处理48 h时,PCr(5,10,20mmol·L-1)对细胞的促增殖作用可分别达到137％、146％、153％.PCr(10,20 mmol·L-1)使MC3T3-E1细胞内ALP的活性分别增加到空白对照组的1.37和2.14倍(P ＜0.05,P＜0.01),并且显著上调ALP蛋白表达(P＜0.01,P＜0.01).PCr(5,10,20 mmol·L-1)还可明显上调MC3T3-E1细胞内BMP-2的蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01),并使MC3T3-E1细胞形成的矿化结节数增加(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).结论 PCr可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化,具有促成骨作用.     

IGF-Ⅰ联合BMP-2促MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞的增殖和分化及钙化效应

目的：探讨重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ（rhIGF—Ⅰ）和重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）单独或联合应用对MC3T3-E1和NIH 3T3细胞增殖、分化和钙化的影响。方法：单独或联合应用不同浓度rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2作用于小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1和小鼠成纤维细胞株NIH 3T3，采用四唑盐比色法（MTT）和流式细胞技术检测细胞增殖，碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞分化，放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素水平（OC），以及Von kossa钙化染色法观察细胞的钙化。结果：1～50ng／ml rhIGF—Ⅰ作用于MC 3T3-E1细胞或5～75ng／ml rhIGF—Ⅰ作用于NIH 3T3细胞后，均能显示明显的促细胞增殖作用（P〈0．01），使S期细胞百分率升高、G1期细胞百分率减少，以及使胞内ALP活性、钙化面积百分比增高（P〈0．05）。10～100ng／ml rhBMP-2也可促进MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞的增殖作用（P〈0．01），使S期细胞百分率升高、G1期细胞百分率减少，并使2种细胞ALP活性、钙化面积百分比升高（P〈0．05）。各浓度rhIGF—Ⅰ或rhBMP-2对MC 3T3-E1及NIH 3T3细胞作用8h、24h和48h的MTT检测结果相似。rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2联合作用后，对2种细胞的促增殖、增强ALP活性、促钙化的作用均较各自单独作用更为明显（P〈0．05）。单独或联合应用不同浓度rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2对细胞分泌的OC水平均无显著性差异（P〉0．05）。结论：rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2具有明显的促进细胞增殖、早期分化及钙化的协同作用，但对成骨末期细胞分化影响不大，而其活性主要与使用剂量有关。     

聚乙烯亚胺介导miR-2861模拟物转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化

目的：通过非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI）介导miRNA-2861（miR-2861）模拟物转染MC3T3-E1细胞系,探讨miR-2861/PEI复合物在前成骨细胞中的转染效率及其对细胞增殖和成骨向分化的影响。方法：将适量的PEI分别与miR-2861和阴性对照（NC）以元素N/P=10的比例混合形成基因/载体复合物。将miR-2861/PEI复合物作为实验组,NC/PEI复合物作为阴性对照组以排除人工合成的双链基因对成骨作用的干扰。采用MTT法筛选PEI复合miR-2861模拟物的最佳使用浓度;应用荧光成像和茎环法RT-PCR技术分别检测10、30、50和100 nmol·L^-1 miR/PEI复合物对MC3T3细胞的瞬时转染效率和miR-2861的表达情况;采用qRT-PCR技术和茜素红染色检测用选定浓度瞬时转染miR-2861/PEI复合物作用下MC3T3细胞的成骨能力。结果：与空白对照组比较,100 nmol·L^-1 miR-2861/PEI复合物作用72h时MC3T3细胞增殖率明显下降（P<0.05）。随转染浓度增加,miR-2861/PEI复合物在MC3T3细胞中的转染效率逐渐升高。茜素红染色及定量分析,实验组诱导21 d后出现较多的钙盐沉积结节,而空白对照组和阴性对照组均较少。结论：以PEI作为载体可使miR-2861模拟物有效转染MC3T3-E1细胞并在细胞中高表达,miR-2861模拟物具有一定的促MC3T3-E1细胞成骨向分化的作用。     

炎性因子对C2C12细胞、MC-3T3-E1细胞成骨、成肌相关基因表达的影响

目的：探讨炎性因子对成肌和成骨细胞成肌、成骨相关基因表达的影响。方法：小鼠腹腔巨噬细胞上清液及白介素（IL）1β处理C2C12细胞及MC-3T3-E1细胞，观察炎性因子对两种细胞成骨、成肌相关基因的表达的影响。结果：小鼠腹腔巨噬细胞上清液促进C2C12细胞MyoD、Myogenin的表达，差别均有统计学意义（P〈0．001）；促进MC-3T3-E1细胞碱性磷酸酶（ALP）的表达，吸光度比值上升为原来的3倍多，差别有统计学意义（P〈0．001）。IL-1β单独对C2C12细胞和MC-3T3-E1细胞的成肌、成骨因子的表达影响无统计学意义（P〉0．05）。结论：巨噬细胞上清液可上调MC-3T3-E1细胞的成骨相关基因表达；上调C2C12细胞的成肌相关基因表达。IL-1β单独不能对C2C12细胞和MC-3T3-E1细胞的成肌、成骨基因的表达产生影响。