内毒素的跨膜信号转导及其在全身炎症反应综合征中的作用

失控性炎症反应是目前临床上最为常见的病理现象，是创伤后并发症发生发展的重要机制。细菌脂多糖（LPS）是最常见的诱导失控性炎症反应的主要因素之一。单核／巨噬细胞表面LPS相关受体是机体识别并启动炎症反应的始动因素，是诱导炎症反应失控的关键环节之一，单核／巨噬细胞膜表面存在多种LPS相关受体，其中清道夫受体（SR）、CD14、Toll样受体4（TLR4）为高亲和力或敏感性LPS受体。SR与单核／巨噬细胞清除、灭活LPS有关；CD14和TLR4是介导LPS激活细胞的重要受体。TLR2、β2整合素、L-selectin等为低亲和力LPS受体，作为“二级受体”在促进LPS诱导的促炎症和抗炎症反应中可能发挥重要的“催化作用”。TLR4可能是LPS激活血管内皮细胞的受体途径。单核／巨噬细胞表面防御性受体（如SR）下调、兴奋性受体（如CD14、TLR4、TLR2等）上调，可能是感染过程中单核／巨噬细胞由早期的防御性（清除、灭活LPS）转化为后期的效应性（释放大量的炎症和抗炎症介质）的重要机制。深化研究LPS跨膜信号转导的分子机制，可望为有效控制失控性炎症反应提供新思路。     

内毒素血症时血浆氧化型低密度脂蛋白的变化及其对库普弗细胞-内毒素反应的影响

目的：探讨内毒素血症时血浆氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL)的变化规律及Ox-LDL对库普弗细胞（KC）－内毒素（LPS）反应的影响。方法：Wistar大鼠36只，随机分为对照组（6只）和LPS组（分为1，5，10mg/kg三组，每组10只），复制大鼠内毒素血症模型，采用ELISA方法检测对照组及注射内毒素后0.5,1,3,5,8h时血浆Ox-LDL水平变化及其与LPS的量效关系。分离培养小鼠KC，分别用Ox-LDL(10-100μg/ml），抗小鼠清道夫受体（SR）单抗（10μg/ml）及抗CD14单抗（10μg/mol)＋Ox-DLD(100μg/ml）预处理KC1h后，再分别与1，10ng/mlLPS孵育3h，观察以上预处理对LPS诱导KC释放肿瘤坏死因子－α(TNF-α）的影响及其与KC表面CD14的关系。细胞上清TNF－α水平采用ELISA法检测。结果：注射LPS后，3组大鼠血浆Ox-LDL水平均显著增高，以10mg/kg组升高最明显。Ox-LDL预处理KC，能显著增强内毒素对KC的激活作用，表现为TNF－α含量明显升高，呈明显的量效关系。Ox-LDL的这种增强作用。结论：内毒素血症早期血浆Ox-LDL水平明显增高，与LPS呈明显的量效关系；Ox-LDL能明显增强LPS对KC的激活作用，其机制可能与促进LPS与细胞表面CD14结合有一定关系。     

慢性重型肝炎患者血中LPS、LBP和sCD14的水平及其临床意义

探讨LBP、sCD14水平在慢性重型肝炎(慢重肝)患者伴肠源性内毒素血症中的作用.应用基质显色法和ELISA双抗体夹心法,检测24例慢重肝患者血中LPS、LBP和sCD14的水平,并以10名献血员和16例慢性乙型肝炎患者作为对照.结果慢重肝患者在早期、中期、晚期,其血中LPS、LBP和sCD14的水平均明显高于慢乙肝患者及献血员;慢重肝死亡者其LPS、LBP和sCD14的水平也显著高于存活者.提示慢重肝患者伴肠源性内毒素血症时,血清中LBP和sCD14的水平,可显著提高机体对内毒素的敏感性.在内毒素浓度较低时,仍可诱导Kupffer细胞释放TNF-α,从而加剧肝细胞损伤.     

CD14和SR-A蛋白表达与内毒素介导的急性肝损伤的关系

目的 观察肝组织清道夫受体A(SR-A)和脂多糖(LPS)受体CD14在内毒素介导的急性肝损伤中的表达及其意义.方法 Wistar大鼠90只,随机均分为内毒素血症(LPS)组和生理盐水注射(NS)组,LPS组经尾静脉注射LPS 5rng/kg,建立内毒素血症和急性肝损伤动物模型.NS组尾静脉注射0.2ml生理盐水作为对照.分别于注射后0、1.5、3、6、12h检测血浆LPS、TNF-α、IL-1、丙氨酸转氨酶(ALT)及总胆红素(TB)含量,肝组织中SR-A和CD14蛋白表达情况.光镜观察肝组织病理变化,电镜观察库普弗细胞(KCs)超微结构的变化,并测定KCs的吞噬功能.结果 随时间延长,LPS组KCs从形态和功能上呈现激活改变(数量增多、体积增大、吞噬功能增强),血浆TNF-α、IL-1含量明显增加,肝细胞变性、坏死等病理改变以及肝功能损害进行性加重,同时肝组织中SR-A表达明显下降、CD14表达明显升高(P<0.01).结论 肝组织中进行性的SR-A表达下降和CD14表达增强可能是内毒素介导急性肝损伤的重要机制之一.     

对细菌内毒素致病作用的新认识

细菌内毒素（LPS）不仅是革兰阴性（G－）细菌细胞壁外膜的主要结构成分，而且是G－细菌感染的主要致病因子，与人类健康和疾病等密切相关，宿主细胞膜上的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRR)是介导细胞识别LPS，并启动LPS反应的首要环节，现已发现清道夫受体（scavenger receptor,SR),CD14,Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4),TLR2,β2整合素和L-selectin等多种膜蛋白参与清除LPS或激活细胞的作用。目前认为，LPS受体可能是多种蛋白组成的复合物，不同宿主个体对LPS反应差异性与其基因背景有关，LPS受体及其诱性的细胞因子等基因的多态性与LPS反应敏感性，脓毒症的易感性和病人预后均存在不同程度的内在联系。     

人肠上皮细胞内毒素低反应性及其机制探讨

为探讨人正常肠上皮细胞对内毒素（LPS）刺激低反应性的机制，用ELISA法检测LPS刺激肠上皮细胞18h后IL－8的分泌水平，用RT－PCR及RPA法检测肠上皮细胞LPS跨膜信号转导相关受体TLR4，TLR2，CD14和MD2 mRNA的表达及LPS刺激对其表达的影响，结果表明：LPS刺激不能引起肠上皮细胞IL－8的分泌，而IL－1β刺激却能引起其分泌；人正常肠上皮细胞TLR4，TLR2，CD14和MD2mRNA的表达均较弱，LPS刺激后，TLR4，CD145 CD14和MD2 mRNA表达进一步降低，而TLR2的表达无显著变化，说明肠上皮细胞对LPS的低反应性与细胞表达LPS相关受体低表面有一定的内在联系，从而进一步证实TLR4，CD14，MD2在介导LPS跨膜信号转导中起重要作用。     

库普弗细胞清道夫受体、CD14表达变化及其与内毒素性肝损伤的关系

目的　从细胞受体水平探讨内毒素性肝损伤过程中肝内库普弗细胞 (KC)由防御性逐步转化为效应性的机制。　方法　经尾静脉注射不同剂量内毒素 (LPS)复制轻、中、重度内毒素血症小鼠模型。肝内KC表面清道夫受体 (SR)、CD14表达测定采用免疫组化法 ,并进行计算机图像分析。　结果　注射LPS后 1h ,高剂量组肝内KC表面SR表达明显减少 ,至 3h ,低剂量和中剂量组KC表面SR表达也开始明显减少 ,并随观察时间延长 ,3组KC表面SR表达均进行性减少 ,3组间SR的吸光度差异有显著性意义。 3组肝内KC表面CD14表达在注射LPS后 1h均明显增多 ,并随时间延长而更加明显 ,但 3组间CD14的吸光度无统计学意义。相关分析显示 ,各剂量组肝内SR与CD14表达变化呈显著负相关。血浆丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、总胆红素 (TB)和肝组织内丙二醛 (MDA)水平变化分别与SR表达下调呈显著负相关 ,与CD14表达上调呈显著正相关。肝组织结构改变及动物死亡率也与肝内KC表面SR、CD14表达变化呈明显的平行关系。　结论　内毒素致肝损伤过程中 ,肝内KC表面SR表达下调、CD14表达上调可能是KC防御功能减弱、致炎作用增强的重要机制。     

内毒素及其增敏系统在烫伤后金葡菌脓毒症中的改变及意义

利用大鼠20％体表面积Ⅲ度烫伤复合金葡菌攻击致脓毒症模型，探讨内毒素及其增敏系统－脂多糖结合蛋白（LBP）和脂多糖受体CD14在G＋菌脓毒症中的变化规律及其与机体过度炎症反应的关系。70只Wistar大鼠随机分为正常对照组（10只），烫伤对照组（10只）和烫伤脓毒症组（50只），检测动物心，肝，肺，肾等组织中LBP，CD14和TNF－α mRNA表达的改变，同时测定组织和血浆内毒素水平，小肠组织二氨氧化酶（DAO）的活性及病理形态学改变，结果显示，烫伤合并金葡菌感染后动物小肠组织DAO活性显著降低，并且至感染后24h仍处于较低水平，同时血浆内毒素水平明显升高，于金葡菌攻击后2h达峰值（P＜0．05），6h则迅速恢复至正常范围，心，肝，肺，肾等组织中LBP，CD14和TNF－α，mRNA表达广泛上调，至24h仍维持于较高水平，肝脏LBP mRNA与肝组织TNF－α基因表达的改变呈显著正相关，提示烫伤后金葡菌感染可导致肠源性内毒素移位和内毒素增敏系统LBP，CD14表达广泛上调，后者作为金葡菌致病因子和内毒素的共同受体对金葡菌脓毒症的发生，发展可能具有促进作用。     

新型细菌内毒素竞争性受体拮抗剂Lipid A结构类似物的研究现状

细菌内毒素(ET)是存在于革兰氏阴性茵细胞壁上的脂多糖(LPS)，其通过诱导机体内的单核巨噬细胞释放多种介质分子而发挥其生物学效应。LPS的活性部分为类脂A(Lipid A)。以内毒素的活性中心Lipid A的分子母核为模板，对其结构类似物进行分子合成，并获得具有能拮抗内毒素受体CD14的竞争性拮抗剂，是一项有着十分广阔应用前景的工作。     

创伤患者外周血单核细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化

目的 研究创伤患者外周血单核细胞内内毒素复合受体-Toll样受体4（TLR4）/髓样分化蛋白-2（MD-2）mRNA的表达变化，观察其与临床预后的关系。方法 35例创伤患者[损伤严重度评分（ISS）≥9分]与14例正常对照，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增TLR4，MD-2，以β肌动蛋白（β-actin)的表达作为内参照，比较TLR4，MD-2的表达水平；采用鲎试剂法测血浆脂多糖（LPS）浓度；同时观察患者的预后情况。结果 所观察的创伤患者中，血浆LPS浓度均发生不同程度的升高；TLR4，MD-2基因的表达均降低，但预后良好的可在伤后第5天恢复正常水平，预后差的在伤后第5天的表达仍处于低水平。结论 创伤可引起内毒素血症创伤后人外周血单核细胞内TLR4，MD-2mRNA的表达与患者的免疫机能，预后情况密切相关。     

内毒素增敏系统与严重烧伤脓毒症的关系及其临床意义

目的 探讨严重烧伤患者内毒素增敏系统--脂多糖结合蛋白/脂多糖受体CD14(LBP/CD14)的变化与严重脓毒症的关系及其临床意义.方法 选择35例烧伤体表总面积大于30%患者,根据烧伤脓毒症的定义和诊断标准分为脓毒症组(19例)和非脓毒症组(16例),应用酶联免疫吸附试验检测患者烧伤后1、3、5、7、14、21、28...     

烧伤大鼠肺泡巨噬细胞CD14蛋白表达对细胞因子的影响

目的：探讨严重烧伤对大鼠肺泡巨噬细胞(AM)CD14膜蛋白(mCD14)表达变化及其对AM分泌细胞因子的影响。方法：20％Ⅲ度烧伤大鼠检测早期外周血LPS浓度。AM以烧伤血清及LPS刺激，再分别以抗CD14抗体作用，免疫组化检测mCDl4蛋白表达变化；ELISA检测培养液中川TNFα和IL—6浓度。结果：烧伤血清和LPS刺激后．mCD14蛋白表达从1h起就开始增加，2h达峰值，尔后逐渐减弱，上述改变在12h内持续，细胞因子分泌相应增加；抗CD14抗体阻断CD14作用后，mCD14的蛋白表达显著降低，细胞因子分泌亦相应减少。结论：严重烧伤后随LPS增加，激活内毒素信号传导通路，使AM分泌细胞因子增加，此作用可以被抗CDl4抗体所阻断，提示严重烧伤后可以通过调节CD14的作用而减少细胞因子的合成和分泌。     

N-乙酰半胱氨酸对急性梗阻性化脓性胆管炎时内毒素性急性肝损伤的保护作用

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对大鼠急性梗阻性化脓性胆管炎(AOSC)时内毒素介导的急性肝损伤的保护作用及其机制。方法健康Wistar大鼠96只,随机均分为3组(n=32):急性胆管炎组(AOC组),结扎大鼠胆总管,于胆总管内注入大肠埃希菌O111:B4(菌落浓度5×1012cfu/L),建立急性AOSC动物模型;NAC预处理组(AOC+NAC组),建模前2h给予300mg/kg NAC预处理;胆总管结扎组(BDL组),仅结扎胆总管。3组动物分别于术后0、4、8、16h活杀取材(每组每时间点8只),检测肝组织中脂多糖(LPS)受体CD14及NF-κB蛋白水平,测定血浆LPS、TNF-α、丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素(TB)水平,光镜观察肝组织病理学变化。结果随病程延长,AOC组血浆LPS、TNF-α、ALT、TB水平逐渐增高,肝细胞变性、坏死等病理改变逐渐加重,而肝组织中CD14和NF-κB蛋白表达显著增加。AOC+NAC组各时间点肝组织中CD14和NF-κB蛋白表达,血浆LPS、TNF-α、ALT、TB水平及肝组织病理学改变均低于AOC组(P<0.01)。结论 AOSC时内毒素介导的急性肝损伤与肝组织CD14、NF-κB表达上调有关。NAC预处理可通过抑制CD14表达及NF-κB活化而减轻AOSC时内毒素介导的急性肝损伤。     

X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4表达的影响

CD14是LPS/LBP复合物的受体,以LPS-LBP-CD14三联体形式介导LPS诱导细胞活化.TLR4是Toll样受体中发现较早的一个受体,是LPS信号跨入细胞所必需的跨膜受体[1].CD14和TLR4作为巨噬细胞膜上的跨膜受体将细胞外信号传到细胞内,通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子NF-κB和Jun/Fos,释放IL-1和IL-6等细胞因子而发生炎性反应.本研究探讨X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞CD14和TLR4表达的影响,为临床应用X射线进行抗炎、抗肿瘤治疗提供理论和实验依据.     

脂多糖结合蛋白功能位点分析

脂多糖结合蛋白(LBP)属于I型急性期反应蛋白,分子量60kU,对LPS中的类脂A具有高度亲和性,正常人血清中的浓度为3～7mg/L,在致炎因素作用下可升高50～100倍。G-菌释放的LPS在体内以多聚体的形式存在,LBP把多聚体转换为单聚体,并把单聚体的LPC转移给细胞LPC受体CD14,激活细胞,导致炎症反应。LBP可显著放大LPS的致炎作用,故pg/ml数量     

烧伤大鼠离体肺泡巨噬细胞CD14的表达及分泌IL-6的调控研究

目的探讨严重烧伤对大鼠肺泡巨噬细胞(AM)CD14膜蛋白(CD14)和mRNA基因表达变化的影响,以及抗CD14抗体对AM产生白细胞介素-6(IL-6)的调控作用。方法20%Ⅲ°烧伤大鼠检测早期外周血内毒素(LPS)浓度。体外分离培养AM,分成烧伤血清组、血清抗体组、内毒素组、内毒素抗体组。RT-PCR方法观察膜表面CD14 mRNA表达、免疫组织化学方法观察蛋白含量及ELISA方法观察分泌IL-6的变化。烧伤血清刺激体外培养的正常大鼠AM,观察培养上清中IL-6浓度变化及CD14抗体的抑制作用。结果烧伤后外周血LPS各时相点LPS浓度均明显高于对照组,与此相对应,烧伤组大鼠AM各时相点CD14 mRNA表达、蛋白含量均明显增高,AM培养上清中IL-6浓度亦显著增高(P<0.01)。以烧伤血清与AM培养1 h后,烧伤组培养上清中IL-6浓度增加值明显高于对照组(P<0.01),而在CD14抗体存在时,IL-6浓度增加值明显小于烧伤组(P<0.01)。结论严重烧伤后外周血LPS浓度增加,AM膜表面CD14受体亦显著增加,使LPS对免疫系统的激活作用显著增大,AM分泌IL-6明显增加。提示严重烧伤后可以通过调节CD14的作用而减少炎性介质的合成和分泌。     

成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究

目的本实验拟通过研究激活成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）信号通路时骨组织成骨细胞分化程度在内毒素血症中的变化,为进一步阐明骨组织在炎症反应中变化的机制奠定基础。方法8周龄雄性C57小鼠和FGFR3功能持续增强的软骨发育不全（Ach）小鼠各6只,分为脂多糖（LPS）组和生理盐水对照组,每组3只。LPS15mg／kg或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧胫骨提取RNA,定量聚合酶链式反应（PCR）检测白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、骨钙素（OC）的变化。LPS、碱性成纤维生长因子（bFGF）处理前成骨细胞系MC3T3E14小时后定量PCR检测IL-6、TNF-α、OC水平,成骨诱导7天后检测碱性磷酸酶（ALP）活性。结果LPS刺激后,骨组织和MC3T3E1的炎症递质基因IL-6、TNF-α的RNA水平显著增加（P〈0．01）,成骨标志性基因OC表达下调（P〈0．05）。且Ach小鼠相应基因变化幅度显著高于C57的变化幅度（P〈0．05）。MC3T3E1同时用LPS与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）处理组的IL6、TNF-α、OC水平表达水平位于单独用LPS或bFGF组之间。成骨诱导7天后LPS处理组细胞ALP活性显著低于未处理组（P〈0．05）,bFGF处理组显著增高（P〈0．01）。结论LPS刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。在整体动物水平持续性激活FGFR3信号通路加重上述反应,在细胞水平低剂量bFGF激活FGFR3减轻上述反应。     

内毒素作用下淋巴细胞中CD4＋CD25＋调节性T细胞变化及连翘对其的影响

目的探讨不同时间点内毒素（LPS）对CD4＋CD25＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋regulatory T cell,Treg）的影响及连翘（forsythia suspensa,FS）干预后CD4＋CD25＋调节性T细胞的变化。方法体外培养Wistar大鼠脾脏淋巴细胞,分为对照组、LPS（10ng/ml）组、LPS（10ng/ml）＋多黏菌素B组（10ng/ml）、LPS（10ng/ml）＋连翘（12．5、25、50mg／ml）组,分别于3、6、12h收集标本．流式细胞术检测CD4＋CD25＋调节性T细胞在淋巴细胞中的百分比,荧光定量RT—PCR法检测Foxp3mRNA表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测TNF—a、IL-10分泌水平。结果脾脏淋巴细胞中CD4＋CD25＋Treg的百分比和Foxp3mRNA的表达在12h较3、6h明显升高（P〈0．01）;TNF—a、IL-10的分泌随时间点的延长均显著升高（P〈0．01）;随连翘剂量增加,TNF-a、IL-10分泌水平,Foxp3mRNA表达和CD4＋CD25＋Treg百分比均明显降低（P〈0．05）。结论内毒素参与并诱导了CD4＋CD25＋Treg在淋巴细胞中的变化,其随内毒素作用时间延长呈上升趋势。连翘能显著降低CD4＋CD25＋Treg在淋巴细胞中的百分比。     

穿膜肽-人A20融合蛋白对单核细胞内毒素应答的影响

目的探讨穿膜肽-入 A20融合蛋白（CPP-hA20）对单核细胞内毒素（LPS）应答的影响，明确其对实验性细胞炎症反应的调节能力。方法 利用激光共聚焦技术观察CPP-hA20定位，用酶联免疫吸附分析（ELISA）法检测细胞内hA20水平的改变证实CPP-hA20的跨膜活性；以核因子（NF）-kB活性、肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-1水平为指标，观察CPP-hA20对单核细胞LPS应答的影响。结果CPP-hA20在40min内即可进入单核细胞内；实验组细胞NF-kB活性、TNF-α和IL-1水平较对照组在不同程度上都有所降低，且呈现剂量依赖性特点。结论CPP-hA20具有主动跨越单核细胞膜进入到细胞内的能力，能够明显抑制LPS对单核细胞NF-kB的激活，降低细胞TNF-α和IL-1的分泌水平，对单核细胞LPS炎症应答具有负向调节作用。     

脂多糖作用巨噬细胞表面TLR4/CD14/MD-2受体复合物表达的变化

目的探讨脂多糖作用小鼠RAW264.7巨噬细胞24 h内细胞表面TLR4/CD14/MD-2受体复合物表达的变化特点。方法分别用低剂量(100 ng/ml)和高剂量(1 000 ng/ml)脂多糖刺激RAW264.7,应用RT-PCR检测TLR4、CD14、MD-2m RNA水平的变化,ELISA检测细胞上清TNF-α含量的变化。结果低剂量脂多糖下调TLR4 m RNA表达,14 h降至最低,24 h维持在低水平表达;CD14和MD-2 m RNA表达增加。高剂量脂多糖上调TLR4 m RNA表达,1 h上升至高峰,此后维持在高水平表达;CD14和MD-2 m RNA表达也明显增强。高剂量脂多糖作用后TNF-α含量显著高于低剂量脂多糖(P<0.05)。结论高剂量脂多糖逆转低剂量脂多糖下调的TLR4表达,提高TLR4/CD14/MD-2受体复合物的表达水平,放大下游信号转导通路的炎症效应。