TaqDNA聚合酶一步法获得TGF-β_1基因片段的RT-PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性、退火、延伸共３０次循环后，可以得到以ｃＤＮＡ为模板的扩增产物。实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶链反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦβ１４６８ｂｐ扩增产物。     

人β—NGF基因的体外扩增,克隆及其序列的分析

目的 对人β－ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析，为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法 本实验设计并合成一对特异性引物，采用聚合酶链反应分别从人脑cＤＮＡ和人睾丸cＤＮＡ以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－神经生长因子（β－ＮＧＦ）基因，并和Ｔ４载体相连接，经筛选得到人β－ＮＧＦ克隆，并用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法进行序列分析。结果 凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论 阳性克     

人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的　对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法　本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因,并和Ｔ４ 载体相连接,经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆,并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果　凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论　阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确     

人转化生长因子基因重组克隆及高效表达

目的　克隆人转化生长因子（ＴＧＦβ１） 基因并且在大肠杆菌中表达。方法　从人的血小板中抽提总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 得到全长ＴＧＦβ１ ｃＤＮＡ,将其克隆于表达质粒ｐＢＬＭＶＬ２ 中,构建了在ＰＬ 启动子控制的含有ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ重组子,转化到大肠杆菌ＲＲ１ 菌株中,进行温敏诱导表达。结果　表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳染色后,显示其相对分子质量为１２ ．５ ×１０３ ,计算机灰度扫描分析,表达产物约占全菌蛋白的２０％ 左右,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 分析证实,表达产物为ＴＧＦβ１ ,细胞实验显示其具有一定的生物活性。结论　在大肠杆菌中表达出具有活性的人ＴＧＦβ１ 。这为我们下一步研究其功能和临床应用打下了基础。     

人bcl—2基因反义cDNA探针的制备和地高辛标记

目的：制备地高辛标记的ｂｃｌ－２基因的反义链ｃＤＮＡ探针。方法首先从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应得到ｂｃｌ－２特异的ｃＤＮＡ片段，然后以此模板利用ＤＩＧ－ｄＵＴＰ作另一轮非对称ＰＣＲ扩增。结果：合成了灵敏，特异的ＤＩＧ－标记的ｂｃｌ－２反义单链探针。结论：本文报道的方法是制备ＤＩＧ－标记的单链的ｃＤＮＡ探针的一个有效手段。     

IGF－I受体cDNA的克隆及序列分析

ＩＧＦ－Ｉ受体在心血管病及肿瘤的发病过程中具有重要作用。本文应用逆转录—聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，克隆了人胎肝组织中ＩＧＦ－Ｉ受体的β亚基ｃＤＮＡ，并对这一ｃＤＮＡ进行了亚克隆和序列分析。本工作为进一步探讨ＩＧＦ－Ｉ受体在动脉粥样硬化、心肌肥厚以及肝癌中的作用奠定了基础。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β－ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－βｃＤＮＡ５’端和３’端非编码区及完整的编码区。     

人bcl-2基因反义cDNA探针的制备和地高辛标记

制备地高辛标记的人ｂｃｌ－２基因的反义链ｃＤＮＡ探针。方法：首先从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应得到ｂｃｌ－２特异的ｃＤＮＡ片段，然后以此为模板利用ＤＩＧ－１１－ｄＵＴＰ作另一轮非对称ＰＣＲ扩增。结果：合成了灵敏、特异的ＤＩＧ－标记的ｂｃｌ－２反义单链ｃＤＮＡ探针。结论：本文报道的方法是制备ＤＩＧ－标记的单链反义ｃＤＮＡ探针的一个有效手段。     

RT—PCR法制备NGFcDNA

本研究直接以新生１８￣２１天龄的小鼠脑的全ＲＮＡ（含ＮＧＦｍＲＮＡ）为底物，进行逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），制备出了神经生长因子（ＮＧＦ）的ｃＤＮＡ片段。用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序分析表明，所制备的ＮＧＦ ｃＤＮＡ片断为３６３ｂｐ，与编码成熟ＮＧＦ的ｍＲＮＡ碱基顺序相对应。直接利用全ＲＮＡ进行ＲＴ与ＰＣＲ一步联合反应，不仅简化了实验步骤，而且最大程度地减少了样品的需要量，减小了样品     

血小板激活因子受体mRNA在小鼠附睾精子内的表达

目的 检测血小板激活因子受体（ＰＡＦＲ）ｍＲＮＡ在小鼠附睾精子内的表达,探讨ＰＡＦＲ对受精过程的影响。２方法 分离提高小鼠附睾精子ｍＲＮＡ,经逆转录（ＲＴ）合成ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列分析验证扩增产物的准确性。结果 小鼠附睾精子表达ＰＡＦＲ－ｍＲＮＡ;ＤＮＡ序列分析验证ＰＣＲ产物的小鼠ＰＡＦＲ－ｃＤＮＡ。④结论 小鼠附睾精子有ＰＡＦＲ－ｍＲＮ     

一种简便快速的DNA序列分析法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）进行了ＤＮＡ序列分析。该分析法在进行ＰＣＲ产物和ＧＣ含量较高的ＤＮＡ模板测序时，能防止模板的ＤＮＡ片段迅速复性，消除ＰＣＲ产物中剩余的扩增引物和脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）的影响，促使ＴａｑＤＮＡ聚合酶有效地通过模板中ＧＣ富含区和二级结构区域。本法系一简便、快速、准确的ＤＮＡ序列分析法。     

大鼠β—防御素rBD—1cDNA克隆

为开展β－防御素基因表达调控分子机制及其转基因防治粘膜感染的研究,作者克隆了大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ。从大鼠肾脏组织提取ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ,并重组到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,经限制性内切酶谱分析和ＤＮＡ序列测定,评定所克隆的ｃＤＮＡ片段为大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ。     

透析对糖尿病肾衰竭病人外周血单个核细胞TGF—β1mRNA？…

①目的 探讨透析对糖尿病肾衰竭病人转化生长因子（ＴＧＦ－β）表达的影响。②方法 采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）半定量技术，对糖尿病肾衰竭不同治疗组病人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ的表达进行检测。③结果 糖尿病肾衰竭透析病人ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ的表达明显高于对照组（ｔ＝１２．５３０，Ｐ〈０．０１），且血液透析病人ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ的表达较腹膜透析病人高（ｔ＝２．１３４，     

人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子cDNA的克隆与表达

目的：克隆与表达人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子ｃＤＮＡ。方法和结果：用逆转录－聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了人及大鼠ＧＤＮＦ成熟序列的ｃＤＮＡ片段，并将人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ重组到表达质粒ｐＢＰＬ中，分别在大肠杆菌中获得了较高表达。结论：人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ的克隆与表达获得成功，为研究ＧＤＮＦ在神经损伤修复中的作用奠定了基础。     

大鼠β—防御素rBD—2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达

从大鼠皮肤提取总ＲＮＡ,以Ｐ１５′→３′ＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＣ和Ｐ２５′→３′ＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＣＴＡＣ引物,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增得到一ｃＤＮＡ片段,经核苷酸序列测定,并根据其推导的氨基酸序列与人β－防御素－２和大鼠β－防御素－１进行同源性比较,结果显示,该ｃＤＮＡ片段编码的氨基酸序列具高度同源性（其成熟肽与ｈＢＤ－２的同一性为５０％,相似性为３２％）,均含６个典型的半胱氨酸,这表明所克隆的ｃＤＮＡ为大鼠β－防御素－２亚类,因此命名为ｒＢＤ－２。大鼠β－防御素－２基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人ｈＢＤ－２的表达相似,能够被诱导表达。以上结果提示,β－防御素－２可能是皮肤组织对感染性损伤的防御反应所产生的重要免疫介质。     

小鼠Ehrlich实体瘤局部DNA直接转染TGF—β1基因的研究

研究Ｅｈｒｌｉｃｈ实体瘤局部ＤＮＡ直接转染ＴＧＦ－β１基因的治疗效果,将真核表达载体ｐＳＶＴＧＦ－β１直接瘤周转染Ｅｈｒｌｉｃｈ实体瘤,用原位杂交方法检测靶基因的表达,ＭＴＴ法检测脾脏细胞免疫功能,并观察小鼠生存期及肿瘤生长速度。治疗组肿瘤细胞及瘤周组织有靶基因ｍＲＮＡ表达,脾脏细胞免疫功能高于对照组,肝瘤生长受到抑制,治疗组小鼠生存期较对照组明显延长,ＴＧＦ－β１基因ＤＮＡ直接转染法可以明显抑制     

大鼠支持细胞ABP,SGP—2和FSH—RcDNA探针的制备

利用获得的含ＡＢＰ、Ｓ－ＧＰ－２和ＳＨ－ＲｃＤＮＡ的重组质粒进行体外扩增。破裂解后酶切鉴定表明，获得的特异６５０ｂｐ和７５０ｂｐ的ＡＢＰｃＤＮＡ片断、１８５７ｂｐ的ＳＧＰ－２ｃＤＮＡ片断和２１８２ｂｐ的ＦＳＨ－ＲｃＤＮＡ片断可进一步用于ＡＢＰ、ＳＧＰ－２和ＦＳＨ－Ｒ基因表达和调节的研究。     

用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。