与人体肥胖相关的神经肽Y受体Y5基因的克隆及序列分析

目的 克隆与肥胖相关的人神经肽Y受体Y5(NPY5R)基因,并鉴定该克隆基因序列的正确性.方法 从人的脂肪组织中提取总RNA并进行反转录,以此为模板用PCR扩增NPY5R基因的cDNA,然后与pET28a+载体重组,筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定,测序后与CeneBank中NPY5R基因进行同源性比较和序列分析.结果 PCR扩增出-个1 300 bp左右的DNA片段,与载体重组和DNA序列分析鉴定,DNA序列分析显示克隆的DNA片段是人NPY5R基因,且所克隆的基因共编码445个氨基酸,分子量为50KD,与CeneBank中NPY5R基因序列同源性达100%.结论 克隆的人NPY5R基因与CeneBank中NPY5R序列完全一致,通过对其相关生物学信息的明确分析,为进一步应用分子生物学技术深入研究NPY5R与人体肥胖发生、发展及转化等相关作用机制及应用该基因进行其基因蛋白表达奠定了基础.     

与人体肥胖相关的神经肽Y受体Y1基因的克隆及序列分析

目的 克隆与肥胖相关的人神经肽Y受体Y1(NPYlR)基因,并鉴定该克隆基因序列的正确性.方法 从人的脂肪组织中提取总RNA并进行反转录,以此为模板用PCR扩增NPY1R基因的cDNA,然后与pET 28a+载体重组,筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定,测序后与GeneBank中NPY1R基因进行同源性比较和序列分析.结果 PER扩增出一个1100 bp左右的DNA片段,与载体重组后DNA序列分析鉴定,DNA序列分析显示克隆的DNA片段是人NPY1R基因,且所克隆的基因共编码384个氨基酸,分子量为44 KD,与GeneBank中NPY1R基因序列同源性达100%.结论 克隆的人NPY1R基因与GeneBank中NPY1R序列完全一致,为进一步应用分子生物学技术深入研究NPY1R与人体肥胖发生、发展及转化等相关作用机制及应用该基因进行其基因蛋白表达奠定了基础.     

人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建

本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制。方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829bp和784bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnI/EcoRI对获得的2个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3Basic荧光素酶报道重组子;经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400bp左右设计了5对3′端平齐、5′端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112bp、1 703bp、1 290bp、784bp和496bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT重组载体及pGL3Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定。结论:成功克隆了长度为2.5kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pGL3-Basic荧光素酶报道重组子。     

与人体肥胖相关的神经肽Y基因克隆及序列分析

目的 克隆与肥胖相关的人神经肽Y(NPY)基因,并鉴定该克隆基因序列的正确性.方法 根据GeneBank中收录的NPY基因序列,设计该基因上下游序列,经过PCR反应合成NPY的cDNA.然后与pET28a+载体重组,筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定,测序后与GeneBank中NPY基因进行同源性比较和序列分析.结果 PCR扩增出一个100 bp左右的DNA片段,与载体重组后和DNA序列分析鉴定,DNA序列分析显示克隆的DNA片段是人NPY基因.且所克隆的基因共编码36个氨基酸,分子量为4.2 kD,与GeneBank中NPY基因序列同源性达100%.结论 克隆的人NPY基因与Genebank中NPY序列完全一致,为进一步应用分子生物学技术深人研究NPY与人体肥胖发生、发展及转化等相关作用机制及应用该基因进行其基因蛋白表达奠定了基础.     

与人体肥胖相关的神经肽Y受体Y2基因的克隆及序列分析

目的 克隆与肥胖相关的人神经肽Y受体Y2(NPY2R)基因,并鉴定该克隆基因序列的正确性.方法 从人的脂肪组织中提取总RNA并进行反转录,以此为模板用PCR扩增NPY2R基因的eDNA,然后与pET 28a+载体重组,筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定,测序后与GeneBank中NPY2R基因进行同源性比较和序列分析.结果 PCR扩增出一个1100 bp左右的DNA片段,与载体重组和DNA序列分析鉴定,DNA序列分析显示克隆的DNA片段是人NPY2R基因,且所克隆的基因共编码381个氨基酸,分子量为4.2 kD,与GeneBank中NPY2R基因序列同源性达100%.结论 克隆的人NPY2R基因与GeneBank中NPY2R序列完全一致,为进一步应用分子生物学技术深入研究NPY2R与人体肥胖发生、发展及转化等相关作用机制及应用该基因进行其基因蛋白表达奠定了基础.     

bcl-2转基因表达载体的构建对脑缺血再灌注损伤保护机制的意义

目的:构建人Bcl-2基因的转基因表达载体用于转基因动物模型的建立,以便深入探讨脑缺血再灌注损伤中的基因机制。方法:利用RT-PCR技术,用包含bcl-2cDNA的引物从慢性淋巴细胞白血病患者的血液扩增得到一约为708bp的DNA片段,克隆后测序和同源性分析。结果:经RT-PCR扩增获得的产物大小与预计的目的片段大小一致,目的基因测序与国外报道的参考序列相比,序列同源性为99%。结论:以pEGFP-C1载体作为真核表达载体,形成以绿色荧光蛋白作为报告基因的融合基因,可以用于转基因的研究。     

bcl-2转基因表达载体的构建对脑缺血再灌注损伤保护机制的意义

目的：构建人Bcl-2基因的转基因表达载体用于转基因动物模型的建立，以便深入探讨脑缺血再灌注损伤中的基因机制。方法：利用RT-PCR技术，用包含bcl-2 cDNA的引物从慢性淋巴细胞白血病患的血液扩增得到一约为708bp的DNA片段，克隆后测序和同源性分析。结果：经RT-PCR扩增获得的产物大小与预计的目的片段大小一致，目的基因测序与国外报道的参考序列相比，序列同源性为99％。结论：以pEGF-C1载体作为真核表达载体，形成以绿色荧光蛋白作为报告基因的融合基因，可以用于转基因的研究。     

尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析

为了获得蛇毒类凝血酶基因，本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA5’和3’保守性序列设计了引物；通过RT—PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段，将该cDNA重组到pMD18-T载体中，利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析。结果表明：该特异性片段中有一个783bp的开放阅读框架．其编码蛋白质序列与蛇的类凝血酶序列有98．5％的同源性，也具有蛇毒类凝血酶的典型特征。结论：本实验获得了一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶基因。     

调控毛囊生长CCDC72基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体的构建

目的对新发现的调控毛囊生长相关的CCDC72基因启动子序列进行分析,克隆并构建不同长度启动子萤光素酶报告基因载体。方法运用在线软件Cister对CCDC72基因5’端2000bp进行启动子特征分析;以人毛乳头细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增目并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板PCR得到不同长度的启动子片段,并测序,将获得启动子片段插入pGL3-Basic载体。结果序列分析发现起始密码子ATG上游的-1--200bp及-600--1000bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功获得1924bp扩增片段,并构建了4个不同长度的CCDC72启动子报告基因载体。结论上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究CCDC72基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。     

实时荧光定量PCR测定TRAIL mRNA质粒标准品的构建

目的 构建pGEM-T-TRAIL重组质粒标准品为临床检测TRAIL mRNA水平奠定基础.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,提取血清HBV DNA阳性乙肝患者的外周血单个核细胞总RNA,逆转录合成cDNA,扩增目的 片断,纯化PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,转化感受态菌DH - 5α,经蓝白斑筛选,PCR鉴定阳性克隆,并进一步测序分析.提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立TRAIL质粒标准品.结果 扩增目的 片段长度为110 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库TRAIL序列性一致.结论 成功构建了实时荧光定量PCR 测定TRAIL mRNA质粒标准品.     

新的白血病复发相关候选基因LRP15全长cDNA的克隆

为了克隆与白血病复发相关的新基因(LRP15)的全长cDNA序列，应用分子生物学及生物信息学技术对一段已知仅在白血病复发标本中被甲基化的1.8kb长的DNA片段进行研究分析，通过美国生物信息中心（NCBI）提供的hEST数据库进行电子杂交，并对获得的相互重叠的EST片段进行组装，设计引物进行cDNA末端快速扩增（RACE）。以高通量基因组序列（HTGS）数据库及SAGE库为基础，将获得的cDNA片段进行染色体定位及组织表达分析。结果表明，LRP15基因的cDNA序列全长1718bp，含1个780bp的开放读码框架，编码259个氨基酸。该基因定位于染色体3p24，在多种组织中表达。结论：RACE技术是克隆新基因的有效方法，LRP15可能是一个与细胞恶变及白血病复发相关的候选基因。     

Molecular cloning and expression in Escherichia coli of an aquaporin-like gene from adult buffalo fly (Haematobia irritans exigua)

A gene fragment encoding a putative member of the aquaporin gene family was amplified using cDNA prepared from unfed adult buffalo fly poly(A)⁺ RNA and degenerate PCR primers designed from highly conserved regions of amino acids found in all members of the aquaporin gene family. This PCR product was labelled with digoxigenin-dUTP and used as a probe to screen a λgt-11 cDNA library constructed from unfed adult buffalo fly. One positively hybridizing clone (AqpBF1), contained an insert of 1878 bp, and DNA sequence analysis revealed an open reading frame of 753 bp encoding a polypeptide of predicted M _r = 26 163 Da. Comparison of the AqpBF1 deduced protein sequence with the GenBank database revealed significant homology to many aquaporin genes, including 72% identity with a partial DNA sequence encoding a member (drip) of the MIP protein family isolated from Drosophila melanogaster. The most closely related, full-length, GenBank sequence was an aquaporin gene isolated from the digestive tract of the sap-sucking insect Cicadella viridis , which was 53% identical to the buffalo fly AqpBF1 protein sequence. The full-length coding sequence of AqpBF1 was cloned into the (His)₆-fusion vector, pQE10, and the recombinant protein was expressed in Escherichia coli following induction by IPTG. The recombinant (His)₆-fusion protein was localized predominantly in the membrane fraction of E. coli . The protein was solubilized from E. coli membranes with n -octyl β-d-glucopyranoside and purified by affinity chromatography on a Ni⁺⁺–sepharose column in the presence of detergent.     

Characterization of BGTG-1, a tergal gland-secreted alpha-amylase, from the German cockroach, Blattella germanica (L.)

The protein fraction of the German cockroach, Blattella germanica (L.), tergal gland secretion was examined. SDS-PAGE separation of proteins present in B. germanica tergal gland secretion revealed a tergal gland-secreted protein, BGTG-1, at approximately 63 kDa. BGTG-1 first appeared in tergal gland secretion at 2 days postimaginal moult and the amount of protein observed increased through day 5. A 2051 bp cDNA sequence, bgtg-1, was obtained by RACE polymerase chain reaction and contains a 1494 bp ORF encoding a predicted protein of 498 amino acids. In a Northern hybridization experiment using total RNA from B. germanica tergal gland tissue, a (32)P-labelled bgtg-1 probe hybridized to an RNA approximately 2000 bp and confirmed the 2051 bp cDNA size obtained by RACE PCR. Using the BLASTx sequence similarity search tool, the top match to the bgtg-1 ORF was found to be an alpha-amylase from Drosophila kikkawai (e-value = 1 x 10(-178)). Alignment of the bgtg-1 deduced protein sequence with alpha-amylases from fruit fly, Drosophila melanogaster, honey bee, Apis mellifera (L.) and yellow mealworm, Tenebrio molitor (L.), revealed conserved residues throughout the ORF and sequence identities ranging from 58.4 to 58.2%. Using a gel-based assay, degradation of starch by native BGTG-1 was demonstrated in vitro and we propose that BGTG-1 may be involved in processing phagostimulatory sugars present in B. germanica tergal gland secretion.     

人髓性白血病细胞系U937定向克隆cDNA表达文库的构建及其意义

本研究的目的是构建髓性白血病U937细胞系表达型cDNA文库 ,为肿瘤抗原的筛选奠定工作基础。提取U937细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5′端 ;XhoⅠ酶切后 ,丙烯葡聚糖凝胶 S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与λZAP表达载体连接 ,包装蛋白包装后建成cDNA文库 ;取出 1μl倍比稀释感染大肠杆菌XL1 Blue MRF′ ,测定文库大小、重组率 ;随机挑取 10个噬斑 ,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下 ,释放出PBK CMV噬菌粒 ;感染大肠杆菌XLOLR ,铺于卡那霉素抗性的LB平板 ;挑取克隆 ,37℃震摇过夜 ;抽提质粒 ,经EcoRI和XhoI酶切后 ,初步确定片段的大小及多样性。结果 :构建成含 2 .87× 10 6重组子的U937细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.7kb。结论 :所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

一个具有诊断价值的弓形虫基因的发现

目的用弓形虫成囊株感染的小鼠血清筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库,以寻找诊断弓形虫病的抗原基因。方法收集成囊株(Prugniaud株)慢性感染的小鼠血清,经滤膜吸附法去除大肠杆菌抗体,筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库。对3次复筛得到的阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列测定,结果送GenBank进行同源性分析。根据序列测定结果,选取其中1个具有完整开放阅读框架的基因进行分析。结果获得4个持续阳性反应克隆。测序和同源性分析显示,WT1为弓形虫P30基因;WT4为弓形虫N-乙酰磷酸丙糖转移酶基因;WT9与已知的基因无同源性。WT12克隆基因与一未知的弓形虫基因有很高的同源性,且具有1个513bp大小的完整开放阅读框架,其蛋白质结构和功能预测可能是1个跨膜信号蛋白。结论筛选得到的1个阳性克隆有望成为早期诊断抗原基因,值得进一步研究。     

PCR法分子克隆及序列分析广西产眼镜王蛇蛇毒α-神经毒素基因

目的 为了获得眼镜王蛇(ophiophagus hannah，Oh)蛇毒a-神经毒素(a-Neurotoxin．a-NT)的基因序列。方法 我们通过比较了基因库中已知眼镜蛇科不同种类毒蛇来源的a-NT基因，发现它们有较高的同源性，特别是5’和3’非翻译区及引导肽部分高度保守，据此设计了包括翻译起始点的上游引物，以及为了得到3’端较完整非编码部分而设计了基本上属于d(T)的反意链下游RACE-PCR引物。为了克服引物所带来的模糊扩增，还在蛋白编码部分再设计一对上下游引物，由此组成P1、P2、P3和P4四对引物。采用Nacleospin RNA Kit法分别从3条活Oh蛇毒腺中提取mRNA，以3’端引物合成eDNA的第一链，并以此作为模板，分别用四对引物进行PCR扩增反应，得到了目的基因不同长度的PCR产物，产物经精制后进行测序，对比分析其结果。结果 获得了全长474bp的Oh．eDNA的基因核苷酸序列，包括5’端60bp，信号肽伴启动子ATG63bp，蛋白质密码部分216bp和3’端186bp并含有TGA终止码。经基因库信息计算机分析其信号肽与眼镜蛇树属(Pseudonnaja textilis，Pt．)海蛇(Laticauda semufasciata，Ls)100％同源，96.8％与眼镜蛇南洋亚种(Naja sputatrix，Ns)和银环蛇(Bungarus multicinctus，Bm)同源．蛋白密码部分83.3％与Ns，79.2％与Pt，76.4％与Ls和74.1％与Bm同源．氨基酸顺序分析信号肽后紧接着的72个氨基酸90.3％与已发现的眼镜王蛇毒长链a—NT’toxina同源，大约73．6％Toxinb、69．7％Oh-4、66.7％Oh-5、56.9％Oh-6A和6B同源，并与a-银环蛇毒素54.2％同源。结论 新发现的Oh-eDNA属于长链a-NT的基因。     

人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞中差异表达的基因，以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”，以源自意外而致流产的孕4—5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”，建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选，并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明：在所构建的AGM抑制消减杂交文库中，经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200—700bp的克隆有211个，阳性率高达76.4％。经过基因芯片筛选，挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示，在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中，4个为未知基因，14个为已知基因，其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论 筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了重要的理论基础。     

Class B scavenger receptor, Croquemort from kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus: Molecular cloning and characterization

The scavenger receptor, Croquemort is a member of the CD36 superfamily comprising transmembrane proteins involved in the recognition of polyanionic ligands. Various researchers have proved that members of the CD36 superfamily are involved in immunity and developmental processes. In the present study, we report a cDNA encoding the kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus Croquemort scavenger receptor (MjSCRBQ) obtained from a cDNA library of lymphoid organ by RACE amplification. The full-length cDNA of 2098 bp consists an open reading frame of 1596 nucleotides that translates into a 532-amino acid putative protein, with a 5′ untranslated region of 323 bp and 3′ UTR of 153 bp. The MjSCRBQ is constitutively expressed in gills, heart, hemolymph, hepatopancreas, intestine, lymphoid organ, muscle, nerve, and stomach and at high levels in the brain. Expression analysis in lymphoid organs of shrimp infected with white spot syndrome virus (WSSV) revealed high levels of MjSCRBQ 72 and 120 h post-infection. The MjSCRBQ contains putative functional domains including transmembrane domains and a CD36 domain. Multiple alignments of MjSCRBQ amino acid sequences showed significant identity with Drosophila melanogaster SCRBQ (31%), Salmo salar SCRBQ (29%), Homo sapiens SCRBQ (28%) and Rattus norvegicus SCRBQ (30%). In a phylogenetic analysis, MjSCRBQ was identified in the invertebrate scavenger receptor cluster. This is the first report in crustaceans of the identification and characterization of a Croquemort scavenging receptor.     

某地区东方立克次体基因型和遗传特征研究

目的探讨某地区东方立克次体流行株的基因型和遗传特征。方法采用荧光定量PCR技术对该地区东方立克次体感染患者和鼠类标本Sta56蛋白编码基因片段检测,对阳性标本进行基因分型和测序,并与巢式PCR分型结果相比较;对测序结果与GenBank东方立克次体参考序列进行同源性分析。结果东方立克次体感染患者和鼠类标本中可扩增出Gilliam型523bp目的基因片段,与Kawasaki型相似,同源性为96.3%;鼠类标本中还可扩增出318bp目的基因片段,与TA686型相似,同源性为78.5%。东方立克次体感染患者外周血中东方立克次体核苷酸序列与鼠标本的同源性为100.0%。结论粤北山区东方立克次体至少存在Gilliam型和Kawasaki型相似株,鼠类中存在TA686型相似株。粤北山区人、鼠均存在东方立克次体自然感染,已成为恙虫病自然疫源地。