E-选择素突变体的构建和表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素（Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎＣＤ６２Ｅ）重组质粒，以ＰＣＲ的方法扩增得到Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ突变体ＣＤ６２Ｅ１和ＣＤ６２Ｅ２基因。将其分别插入痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的单一ＳｍａⅠ位点，在痘苗病毒真核系统中进行了表达。初步的细胞粘附功能试验结果表明，Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ分子不同结构域的缺失可削弱其粘附能力，为进一步研究Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ公子的结构与功能奠定了基础。     

CD4+CD25+调节性T细胞在川崎病免疫发病机制中的作用

目的探讨CD4 CD25 调节性T细胞在川崎病(KD)免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿25例,正常同年龄对照组25例,KD患儿分别于静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗前后直接取血备检,未加任何体外丝裂原刺激培养。采用流式细胞术分别检测外周血CD4 CD25 调节性T细胞比例及CD14 细胞表面共刺激分子的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR检测外周血CD4 T细胞中Foxp3、CTLA-4和GITR基因mRNA的表达。结果急性期KD患儿外周血CD4 CD25 调节性T细胞比例明显低于同年龄对照组(P<0.01),IVIG治疗后显著上升(P<0.01);急性期KD患儿外周血CD4 T细胞中Foxp3、CTLA-4和GITR基因mRNA表达水平均明显低于正常对照组(P<0.01),IVIG治疗后均有不同程度的恢复(P<0.01);急性期KD患儿CD14 细胞明显过度表达CD80及CD86等共刺激分子(P<0.01),IVIG治疗后CD80及CD86表达均显著下降。结论急性期KD患儿CD4 CD25 调节性T细胞数量减少可能与KD免疫调节功能紊乱有关。     

E-选择素基因第2外显子G98T单核苷酸多态性的调查

目的 :研究湖北地区汉族人群E 选择素 (E selectin)基因第 2外显子 98位点的单核苷酸多态性 (SNP) ,比较种族间单核苷酸的基因频率分布差异。方法 :应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性(PCR RFLP)的分析方法 ,检测了 2 40名健康者E selectin第 2外显子 98位点单核苷酸的基因型。结果 :E selectin各基因型频率GG型91.3 % ,GT型 8.7% ;G ,T各等位基因频率分别为 95 .6% ,4.4% ,这种基因多态性分布在男女间均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。与其它种族比较 ,发现不同种族间E selectin基因型分布及等位基因频率均存在显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :在湖北地区汉族人群中存在E se lectin基因第 2外显子 98位点的单核苷酸多态性 ,这种多态性在种族间可能存在着较大的差异     

CD40L、可溶性黏附分子及MMP9在川崎病中的表达及意义

目的：研究T细胞CD40配体（CD40L）、血浆中可溶性E选择素（sE-selectin）、可溶性细胞间黏附分子1（sICAM-1）和基质金属蛋白酶9（MMP9）在川崎病中的表达及意义。方法：用流式细胞双色荧光标记技术检测20例川崎病急性期及静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗后的患儿，19例正常对照，外周血T细胞表达CD40L阳性细胞率及平均荧光强度；用ELISA方法检测上述3组血浆中sE—selectin、sICAM-1和MMP9水平。结果：急性期川崎病组T细胞CD40L表达明显高于IVIG治疗后组（P〈0．05），川崎病患儿T细胞CD40L表达较正常对照持久；2例伴冠状动脉损害（CAL）的川崎病患儿急性期T细胞CD40L表达高于无CAL者。急性期川崎病组血浆sICAM-1、MMP9明显高于IVIG治疗后组，急性期川崎病患儿血浆sE—selectin、sICAM—1明显高于正常对照（P〈0.05）。川崎病急性期T细胞表达CD40L与血浆sE—selectin、sICAM-1、MMP9水平无明确相关性（P〉0．05）。结论：T细胞表达CD40L升高在川崎病血管炎及冠状动脉病变中可能起一定作用。血浆sE-selectin、sLCAM-1和MMP9水平可作为反映川崎病血管炎的指标。     

锌指蛋白基因抑制氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素的表达

目的：探讨外源性锌指蛋白基因A20对氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响。方法：DOTAP脂质体介导peDNA3．1EHA20质粒转染人脐静脉内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达,原位杂交、免疫组化分别检测过氧化氢诱导的内皮细胞E-选择素表达。结果：A20基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达,过氧化氢能诱导人内皮细胞E-选择素高表达,而A20基因能抑制80％以上过氧化氢诱导的内皮细胞E-选择素表达,两者间相差显著。结论：A20基因能够显著抑制过氧化氢诱导的内皮细胞活化,有助于氧损伤的治疗。     

小儿典型川崎病与不完全性川崎病的临床特征分析

目的 探讨小儿典型川崎病与不完全性川崎病的临床特征。方法 研究选取2012年1月~2017年1月宜宾市第二人民医院接收的76例小儿川崎病患儿为观察对象,按照入院顺序分为两组,每组38例,A组为典型川崎病患儿,B组为不完全性川崎病患儿,比较两组患儿的临床症状,实验室检查指标特征。结果 两组患儿的发热、指端脱屑、肛周脱屑等症状发生率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,两组患儿的血钠、Hb、ALB、ESR、ALT、PLT计数对比,差异无统计学意义（P＞0.05）,A、B组皮疹（71.1%vs28.9%）、手足水肿（78.95%vs39.47%）、卡巴红肿（13.16%vs34.21%）、球结膜充血（92.10%vs34.21%）、口腔黏膜充血（86.84%vs52.63%）、颈部淋巴结肿大发生率（73.68%vs50.00%）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。A组发热持续时间（9.4±0.3）d,高于B组（7.9±0.4）d;A、B两组的CRP、WBC指标则分别为[（34.3±21.4）mg/L vs（51.7±33.6）mg/L]和[（14.8±6.4）×109/L vs（19.6±5.7）×109/L],差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 相比于典型川崎病患儿,不完全性川崎病患儿发生皮疹、卡巴红肿、手足水肿、口腔黏膜充血等症状的几率更低,且其发热症状持续时间更短,CRP水平与WBC计数更高。     

E-选择素及其配体sLex对胚泡粘附和着床的影响

目的 :探讨E 选择素及其配体sLex 在胚胎粘附和着床中的作用。方法 :体外观察了E 选择素及其抗sLex 抗体对胚泡粘附的影响 ,并通过体内研究观察了抗sLex 抗体对胚泡着床的影响。结果 :体外培养胚泡时 ,培养皿上包被E 选择素浓度为 2 5ng ml、5 0ng ml时胚泡的粘附率为 88 0 %、87 2 % ,明显高于对照组 74 0 % (P <0 0 5 )。将不同浓度的sLex 抗体加入培养液 ,观察胚泡在包被 2 5 μg mlE 选择素培养皿上的粘附情况 ,发现当sLex 抗体浓度为 10 0、10 0 0ng ml时 ,胚胎的粘附率明显下降。给孕 2～ 4天的小鼠宫腔注射sLex 抗体 ,当抗sLex 抗体剂量为 10 μg 只时 ,胚胎着床数为 5 2± 2 7,明显低于对照组 11 3± 3 1(P <0 0 5 )。结论 :适当浓度的E 选择素可以促进胚胎的粘附 ,其作用可能是通过与配体sLex 介导的。阻断E 选择素与配体的sLex 的结合可以部分阻断胚胎的粘附和着床。     

E-选择素不同结构域缺失对其粘附功能的影响

目的研究Ｅ－选择素不同结构域缺失对其粘附功能的影响。方法从人胎脐静脉内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法获其全长ｃＤＮＡ，设计并合成三对缺失Ｅ－选择素分子的ＥＧＦ结构域及ＥＧＦ＋ＣＲ１＋ＣＲ２结构域引物，并将三者基因分别在痘苗病毒真核表达系统中表达。结果细胞粘附功能试验结果表明，Ｅ－选择素分子ＥＧＦ结构域或ＥＧＦ＋ＣＲ１＋ＣＲ２结构域的缺失削弱了Ｅ－选择素分子的粘附能力。此外，本研究尚克隆并在痘苗表达系统中表达了可溶性Ｅ－选择素分子。结论Ｅ－选择素分子不同结构域缺失对其粘附能力削弱现象的发现为临床某些疾病的发病机理揭示及治疗提供了线索。可溶性Ｅ－选择素分子在痘苗病毒表达系统中表达成功为与其介导的白细胞粘附、肿瘤转移等过程的调节奠定了物质基础     

E-选择素基因结构功能、表达调控和构效关系

E-选择素分子为粘附分子选择素家族成员之一,其基因全长约13kb,由14外显子和13内含子组成,定位于人1号染色体q12>qter区,基因及分子结构表现出多态性,表达受NF-κB等正调控因子和ATFaO等负调控因子的调控,分子内不同结构域对E-选择素粘附功能的影响有待进一步阐明。     

广西壮族与汉族人群E-选择素基因的遗传多态性

目的研究E-选择素(E-selectin)基因第2外显子G98T和第4外显子S128R遗传多态性在广西壮、汉两民族中的分布。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性和DNA序列测定法检测162名壮族人和170名汉族人E-选择素基因第2外显子G98T和第4外显子S128R遗传多态性,比较两组E-选择素基因型和等位基因的分布频率。结果E-选择素基因第2外显子等位基因G、T频率在壮族与汉族正常人群中分别为94.8%、5.2%和95.3%、4.7%;第4外显子等位基因S、R频率分别为92.0%、8.0%和95.9%、4.1%(χ2=4.482,P=0.034)。结论E-选择素基因S128R多态性在广西壮、汉两民族中差异有显著性;E-选择素基因G98T多态性在广西壮、汉两民族中差异无显著性。     

RSV毛细支气管炎患儿血液CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与CD40/CD40L关系的研究

探讨CD40/CD40L信号通路对不同病原体毛细支气管炎(以下简称:毛支炎)患儿血液CD4~+CD25~+Foxp3~+ Treg的增殖分化及其分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10的影响。取呼吸道合胞病毒(RSV)及非RSV感染毛支炎患儿血液并检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的百分率;并将血液中分离的单个核细胞(PBMC)接种于24孔板内,加入CD40L McAb进行阻断,作用72h后采用流式细胞仪检测培养板内CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的百分率,激光共聚焦检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞表面Foxp3的平均密度,酶联免疫吸附法检测培养上清中TGF-β1、IL-10的含量。RSV毛支炎患儿血液中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分率显著低于非RSV毛支炎患儿及正常对照组(P<0.05);RSV毛支炎患儿体外培养PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分率均显著低于非RSV毛支炎患儿、正常对照组和抗CD40L McAb组(P<0.05)。毛支炎患儿PBMC经过体外培养72h后,抗CD40L McAb组培养的细胞中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg表面Foxp3的平均密度显著高于RSV毛支炎患儿组(P<0.05)。PBMC培养上清中IL-10和TGF-β1的水平抗CD40L McAb组明显高于非RSV毛支炎组,非RSV毛支炎组明显高于RSV毛支炎组,差异有统计学意义(P<0.05)。RSV毛支炎患儿体内存在严重的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg数量不足;体外用抗CD40L McAb阻断CD40/CD40L通路可促进RSV毛支炎PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的增殖。     

Analysis of CD154 and CD40 expression in native coronary atherosclerosis and transplant associated coronary artery disease

T cells have roles in the pathogenesis of native coronary atherosclerosis (CA) and transplant-associated coronary artery disease (TCAD). The mechanisms by which T cells interact with other cells in these lesions are not fully known. CD154 is an activation-induced CD4⁺ T cell surface molecule that interacts with CD40⁺ target cells, including macrophages and endothelial cells, and induces the production of pro-inflammatory molecules, including CD54 (ICAM-1) and CD106 (VCAM-1). To investigate whether CD154-CD40 interactions might be involved in the pathogenesis of CA or TCAD we performed immunohistochemical studies of CD154 and CD40 expression on frozen sections of coronary arteries obtained from cardiac allograft recipients with CA (n=10) or TCAD (n=9). Utilizing four different anti-CD154 mAb we found that CD154 expression was restricted to infiltrating lymphocytes in CA and TCAD. CD40 expression was markedly up-regulated on intimal endothelial cells, foam cells, macrophages and smooth muscle cells in both diseases. Dual immunolabeling demonstrated many CD40⁺ cells co-expressed CD54 and CD106. The extent of CD40, CD54 and CD106 expression showed statistical significant correlation with the severity of disease and the amount of intimal lymphocytes. Together these studies demonstrate the presence of activated CD154⁺ and CD40⁺ cells in both CA and TCAD lesions and suggest that CD154-mediated interactions with CD40⁺ macrophages, foam cells, smooth muscle cells and/or endothelial cells may contribute to the pathogenesis of these diseases. Received: 17 December 1999 / Accepted: 20 January 2000     

CD40/CD40L交联在CD4+T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的机制研究

目的探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4 T细胞(CD4 CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制.方法体外扩增CIK细胞并纯化CD4 T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4 CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4 CIK激活前后CD40L的表达变化;将转染质粒pIRES2-EGFP-sCD40L的CHO细胞(CHO-sCD40L)与乳腺癌细胞T47D共孵育,监测24小时后其表面分子Fas的表达变化及对Fas介导凋亡的敏感性.结果CD4 CIK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随孵育时间和效靶比的升高而增加,且肿瘤细胞表面分子Fas水平升高,可从1.98%±0.23%升高到31.62%±7.07%;CD4 CIK细胞被激活后,CD40L表达水平均较激活前明显增加;成功转染的CHO-sCD40L细胞与T47D共培养后,T47D表面分子Fas可被诱导升高,加入CH-11 24小时后可观察到明显T47D细胞的凋亡.结论CD4 CIK可能通过CD40/CD40L交联提升肿瘤细胞表面功能性Fas表达来诱导其凋亡.     

CD40/CD40L expression in leukocytes from chronic granulomatous disease patients

Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder caused by defects in the NADPH oxidase complex, which generates superoxide, the precursor of hydrogen peroxide (H(2)O(2)) and other reactive oxygen derivatives with microbicidal activity. Because CGD patients are at risk of chronic inflammatory manifestations, including inflammatory bowel disease and autoimmune diseases, and it is not clear whether these pathologies are exclusively secondary to altered superoxide production, or whether distinct immunologic defects are involved, we explored cell proliferation, lymphocyte cell counts, immunoglobulin levels, presence of autoimmune antibodies and expression of costimulatory molecules in leukocytes from CGD patients. We found that CGD patients have a diminished phytohemagglutinin-induced proliferation of blood mononuclear cells. Following stimulation with PMA plus ionomycin, a reduced percentage of CD40L expression in T lymphocytes and a diminished expression of CD40 molecules in neutrophils were observed on leukocytes from these patients. Our results suggest an altered interplay between elements of innate and adaptive immunity in CGD patients, which may be reflected in an increased susceptibility to opportunistic infections.     

The role of CD40 and CD154/CD40L in dendritic cells

In this review, we focus on the function of CD40–CD40L (CD154) interactions in the regulation of dendritic cell (DC)–T cell and DC–B cell crosstalk. In addition, we examine differences and similarities between the CD40 signaling pathway in DCs and other innate immune cell receptors, and how these pathways integrate DC functions. As research into DC vaccines and immunotherapies progresses, further understanding of CD40 and DC function will advance the applicability of DCs in immunotherapy for human diseases.     

霉酚酸酯对血管内皮细胞与淋巴细胞粘附及其表达CD40L的影响

目的：观察霉酚酸酯（MMF）对细胞因子刺激下人脐静脉内皮细胞（mWEC）CD40L的影响。方法：正常分娩人脐带经胶原酶消化后，分离出内皮细胞，培养至3～5代，用于细胞粘附和CIMOL表达试验。以TNF-α和／或霉酚酸（船A）处理HUVEC 20小时后，用虎红法研究对淋巴细胞与内皮细胞粘附作用。以TNF-α、rIFN-γ、LPS分别和MPA同时作用HUVEC 24小时。加不同浓度的MPA与LPS诱导HUVEC 24小时，用Cell-ELISA检测CIMOL的表达。结果：（1）MMF能抑制静息及TNF-α激活的内皮细胞与淋巴细胞间的粘附作用。（2）三种细胞因子均可明显诱导内皮细胞表达CD40L分子。（3）MMF不能抑制静息状态下内皮细胞CD40L的表达，但抑制TNF-α、rIFN-γ和LPS诱导CIMOL的表达作用，且MMF抑制LPS诱导的内皮细胞CD40L表达呈剂量依赖效应。结论：MMF通过抑制内皮细胞表达CIMOL而影响淋巴细胞与内皮细胞的相互作用，这可能是MMF抗排斥反应机制之一。     

慢性乙型肝炎患者外周血细胞CD40+、CD40L+及CD8+/CD28+表达的研究

目的检测慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)患者外周血淋巴、单核细胞表面CD40+、CD40L+及淋巴细胞表面CD8+/CD28+、CD8+/CD28-的表达,评价患者的细胞免疫状态,为临床治疗提供指导.方法流式细胞仪测定慢乙肝患者单核细胞、淋巴细胞表面CD40+、CD40L+表达的百分率及淋巴细胞表面CD8+/CD28+、CD8+/CD28-表达的百分率.结果慢乙肝组外周血淋巴、单核细胞表面CD40+、CD40L+及淋巴细胞表面CD8+/CD28+的表达明显低于正常对照组(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01),乙肝肝硬化组(简称肝硬化)均明显低于正常对照组(均P＜0.01),而慢乙肝组、肝硬化组CD8+/CD28-的表达高于正常对照组(P＜0.05,P＜0.01).慢乙肝组与肝硬化组均无显著差异(均P＞0.05).慢乙肝轻、中、重度和肝硬化三组间均无显著差异(均P＞0.05).相关性分析结果显示,慢乙肝患者淋巴、单核细胞表面CD40+和CD40L+的表达之间存在正相关,淋巴细胞CD40+、CD40L+表达与CD8+/CD28+表达存在正相关,而与CD8+/CD28-表达相关性不明显.结论慢乙肝患者外周血淋巴、单核细胞CD40+、CD40L+及淋巴细胞CD8+/CD28+表达低下,而CD8+/CD28-的表达增加.检测外周血CD40+、CD40L+及CD8+/CD28+的表达可评估患者的细胞免疫状态,对临床的抗病毒治疗提供新思路.     

大鼠心脏移植排斥反应过程中外周血CD28、CD40通路相关分子的变化

目的探讨CD28、CD40共刺激通路与排斥反应的关系,同时也为排斥反应的诊断寻找一种新的检测指标。方法采用大鼠异位心脏移植模型,用免疫组化方法动态检测外周血单核细胞（PBMC）CD28、CTLA4、CD40及CD40L分子的表达。结果在0～4级排斥反应中,外周血细胞CD28分子阳性表达率在各组间的差异无统计学意义。外周血细胞表达CTLA4分子的阳性率随排斥反应增强而升高（P〈0.01）。CD40及CD40L在PBMC中的表达强度也随排斥反应的分级逐渐增强（P〈0.01）。结论外周血CTLA4、CD40及CD40L分子的表达与排斥反应有密切关系,动态检测这些分子有助于对排斥反应状态的评价。     

CD40L/CD40轴的生物学功能及其与疾病的关系研究进展

CD40L／CD40为体内免疫反应系统中一对重要的共刺激分子,参与机体的体液和细胞免疫反应。CD40L主要表达在CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞和B细胞,CD40主要表达于B细胞、活化的单核／巨噬细胞、树突状细胞（DC）、上皮细胞等。CD40L／CD40轴对B细胞的活化、增殖、细胞因子的分泌及免疫球蛋白的类别转换起到了非常重要的作用。CD40L／CIMO相互作用也对细胞毒性T细胞前体的活化,维持调节性T细胞的动态平衡及诱导辅助性T细胞的分化等方面起重要作用。CIMOL／CIMO轴还参与多种免疫相关疾病的致病过程,如自身免疫性疾病、肝炎等,且在抗肿瘤免疫中起到重要作用。多种动物模型的建立为探究疾病病因、研究CIMOL／CIMO轴在疾病发生过程中的作用提供了重要的平台。     

CD40L在CD4^＋CIK诱导Fas抵抗乳腺癌细胞凋亡中的机制研究

目的:探讨CD40/CD40L交联在诱导Fas抵抗乳腺癌细胞凋亡中的免疫学机制.方法:体外大规模扩增自体CIKs细胞,利用磁珠分选系统纯化其中CD4+T细胞亚群(CD4+OK).用抗Fas激活性抗体CHll诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞凋亡,比较有无CD4+CIK培养上清预处理对MDA-MB-231细胞凋亡率的影响.MDA-MB-231细胞与CD4+CIK在不同效靶比下共孵育6小时和24小时,分别用流式细胞仪检测凋亡率和膜Fas表达,定量RT-PCR法检测胞浆内Bax、Bcl-2、FADD 和c-FLIP)的mRNA含量.在共培养系统中加入抗FasL、抗CD40L和抗IFN-γ中和抗体,分别比较MDA-MB-231细胞凋亡率、膜Fas表达和四种凋亡相关基因的mRNA含量.结果:MDA.MB-231细胞对CHIl诱导的凋亡有抵抗,但经过CD4+CIK培养上清预处理后,敏感性显著提高.MDA-MB-231细胞与CD4+CIK共孵育24小时后,细胞凋亡率明显升高,并与膜Fas表达量呈正相关(r=0.618,P<0.01).在共培养体系中添加抗FasL和抗CD40L中和抗体可完全清除增加的细胞凋亡,而抗IFN-γ中和抗体只能部分清除,凋亡率分别从(33.70±2.77)%降至(7.57±1.15)%、(7.80±0.26)%和(14.21±1.70)%.但MDA-MB-231细胞膜Fas表达可以等效地被抗CD40L和抗IFN-γ中和抗体封闭,分别从(25.90±2.45)%降至(6.93±1.56)%和(8.73±4.70)%.定量RT-PCR结果显示MDA.MB-231细胞与CD4+CIK共孵育6小时时胞浆中c-FLIP表达下降与凋亡率显著相关(r=0.898,P<0.05),而抗CD40L中和抗体可诱导c-FLIP表达升高.结论:CD40/CD40L交联和IFN-γ刺激均参与了CIM+CIK诱导的MDA-MB-231细胞凋亡,但其Fas抵抗性的逆转主要是通过CD40/CIMOL交联抑制c-FLIP的mRNA合成而实现的.