表观遗传抑制剂对人肝癌Hep-G2细胞p14基因表达及甲基化的影响

目的探讨表观遗传抑制剂对人肝癌Hep-G2细胞p14基因表达及甲基化的影响。方法人肝癌Hep-G2细胞经过不同浓度和不同时间的5-Aza-CdR和TSA处理,采用MSP法检测p14基因甲基化水平,其表达水平采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测。结果 5μmol/L 5-Aza-CdR和0.4 mg/L TSA对Hep-G2细胞的生长抑制作用最强;处理时间为3 d时,对细胞的影响最强;二者诱导Hep-G2细胞的凋亡效果也在同样的浓度和时间点表现最强。同时观察到,5-Aza-CdR和TSA能诱导p14基因去甲基化,增强mRNA表达水平。结论 p14甲基化在肝癌细胞生长过程中发挥重要作用,表观遗传抑制剂有助于p14表达上调,恢复其肿瘤抑制作用。     

5-脱氧氮杂胞苷逆转食管鳞癌细胞系p16基因转录表达研究

目的：探讨5种食管鳞癌细胞株中p16基因转录失活以及去甲基化药物对其作用的机制.方法：采用细胞培养、PCR、DHPLC、MSP、Northern印迹、MTT等方法,检测EC1,EC18,EC109,TE1,TE10食管鳞癌细胞株中p16基因的缺失、突变、甲基化状态和p16的转录表达,观察去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷对p16基因转录表达和细胞增殖能力的影响.结果：除了EC1,其余4种食管鳞癌细胞株均检测出p16基因的不同变化：纯合缺失（EC18）,纯合型甲基化（EC18,EC109）,杂合型甲基化（TE1,TE10）,且纯合缺失的发生率较低（20%）,甲基化的发生率较高（80%）,经过5-Aza-CdR处理,可见2株发生了杂合型甲基化的TE1和TE10细胞p16基因的转录表达得到了逆转.结论：不同食管鳞癌细胞株p16基因转录失活的原因是不同的,启动子区甲基化为主要原因,其中杂合型甲基化可以被去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷逆转,使p16的转录表达上调.     

12C6+重离子诱导可溶性TRAIL表达增强及其抗肿瘤作用的实验研究

目的构建可被辐射诱导激活的表达载体pEgr-sTRAIL,研究其体外瞬时转染联合不同剂量的^12C^6＋离子辐照对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖活性的影响。方法SOEing PCR法克隆可溶性TRAIL基因,测序正确后连入pcDNA3.1-Egr质粒,构建pEgr-sTRAIL表达载体;采用GeneCompanionTM聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞;接受不同剂量的^12C^6＋照射后,RT-PCR法检测目的基因 mRNA水平的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,克隆形成实验检测细胞增殖存活。结果成功构建了辐射诱导表达载体pEgr-sTRAIL;瞬时转染联合^12C^6＋离子照射可在mRNA水平上诱导sTRAIL表达增强;随照射剂量的增加,转染pEgr-sTRAIL的HeLa细胞凋亡率明显增加,克隆形成率明显下降。结论^12C^6＋离子可诱导重组质粒pEgr-sTRAIL在被转染的HeLa细胞中表达增高,体外基因-^12C^6＋离子联合治疗可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合曲古菌素A对人胃癌细胞株化疗敏感性的协同增强作用

目的探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)联合曲古菌素A(TSA)协同增强人胃癌细胞MKN-74化疗敏感性的作用及机制。方法以MTT法观察5-Aza-CdR和(或)TSA与氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(OXA)、伊立替康代谢产物SN38或吉西他滨(GEM)联合应用对MKN-74细胞生长的抑制;流式细胞术分析细胞凋亡情况;RT-PCR检测p21、caspase3、Rb和p16基因表达,经Bandscan4.3分析软件进行条带灰度分析,计算目的基因与GAPDH灰度比值。结果5-Aza-CdR联合TSA可进一步增强5-Aza-CdR对5-FU、PTX、OXA或GEM的化疗增敏作用,也可以增强TSA对OXA、GEM的化疗增敏作用。TSA OXA组、5-Aza-CdR OXA组与5-Aza-CdR TSA OXA组的细胞凋亡率分别为28.07%±2.37%、25.33%±2.84%及38.37%±3.23%;TSA GEM组、5-Aza-CdR GEM组与5-Aza-CdR TSA GEM组的细胞凋亡率分别为17.20%±2.07%、19.30%±2.95%、29.57%±3.10%(P<0.05),说明5-Aza-CdR联合TSA协同可以促进OXA或GEM诱导MKN-74细胞凋亡。5-Aza-CdR联合TSA还可以增强caspase3、p16、Rb和p21基因的表达,与对照组(以其灰度值为1.00)相比,4种基因的表达分别为2.67、2.28、2.39和2.75。结论5-Aza-CdR联合TSA可能通过协同调控基因表达、诱导细胞凋亡,提高胃癌细胞的化疗敏感性。     

TIG2基因在肺癌细胞中表达及启动子区甲基化的研究

 目的 探讨TIG2基因在原发性非小细胞肺癌中的表达及意义.方法 应用RT-PCR法检测TIG2基因在肺癌和正常肺细胞中表达变化,用CpG岛预测软件分析TIG2基因启动子和第一外显子区域CpG岛分布,用甲基化特异PCR法(MSP)检测TIG2基因甲基化.用RT-PCR法检测去甲基化试剂作用后TIG2基因的表达.结果 正常肺细胞和癌旁正常组织中TIG2mRNA呈高表达,而肺癌细胞系和组织中低表达或沉默.TIG2基因的启动子和(或)第一外显子区域存在典型的CpG岛.在肺癌细胞系均发生TIG2甲基化,肺癌组织中常发生甲基化,而肺癌旁组织中未见甲基化.去甲基化试剂作用后TIG2基因恢复表达.5-氮-2'-脱氧胞苷浓度越高,TIG2mRNA表达的强度越大.结论 甲基化是导致TIG2基因转录沉默的重要机制,TIG2可能是一种新的肺癌肿瘤抑制基因.     

胃癌中TIMP3基因的甲基化与表达间的相关性分析

目的探讨转移抑制基因TIMP3(金属组织蛋白酶抑制因子-3)在胃癌和胃癌细胞系中启动子甲基化及其蛋白和mRNA表达的特点,并分析两者之间的关联。方法应用MSP法检测TIMP3基因启动子区的甲基化状态;RT-PCR和免疫组织/细胞化学法检测TIMP3基因mRNA和蛋白的表达;观察DNA去甲基化剂(5-aza-2’-deoxycitydine)对人胃癌细胞系(MGC803和HGC-27)细胞系TIMP3基因表达的影响。结果TIMP3基因于胃癌组织中的甲基化频率为17/33(51.5%);四个胃癌细胞系均存在TIMP3基因的甲基化,而MGC803、BGC823和HGC-27仍有该基因的表达或低水平表达;在去甲基化剂的作用下TIMP3基因的表达水平明显上调。结论TIMP3的异常甲基化是其表达下调或沉默的主要原因并存在部分甲基化的倾向。该指标可作为胃癌的敏感性表观遗传学标记物在胃癌的筛查和诊断中应用。     

双启动子杆状病毒介导131I肿瘤靶向治疗的实验研究

目的构建由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的N1S基因以及由早期生长应答因子1（Egr1）启动子调控的人纤溶酶原Kringle5（K5）基因的双启动子重组杆状病毒载体,探讨同时靶向肿瘤细胞与血管内皮细胞的基因治疗模式的可行性。方法将hTERT启动子和N1S基因片段以及Egr1启动子和麟基因片段分别亚克隆至杆状病毒载体,经草地贪夜蛾卵巢细胞（Sf9）包装并扩增得到重组杆状病毒（Bac—hTERT-N1S—Egr1-K5）,同时将CMV启动子调控的重组杆状病毒（Bac—CMV-NIS—Egr1-K5）以及不含NIS基因或不含硒基因的重组杆状病毒（Bac—hTERT-O—Egrl-K5、Bac-hTERT-NIS—Egr1-0）作为对照组。采用荧光定量PCR及Westernblot分析NISmRNA和蛋白在人宫颈癌细胞HeLa中的靶向表达,以及131I辐射对K5mRNA和蛋白的表达调控。通过摄碘实验、NaClO4抑制实验以及细胞增殖抑制实验验证NIS蛋白的功能及由其介导的131I抑瘤作用。通过细胞凋亡实验评估K5蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的促凋亡作用。统计学检验采用方差分析。结果成功构建重组杆状病毒Bac—hTERT-NIS—Egr1-K5。荧光定量PCR及Westernblot显示肿瘤特异性启动子hTERT介导的NIS基因仅在HeLa细胞中有表达,而在正常肺纤维细胞MRC5中无表达。131I可以调控辐射敏感启动子Egr1下游您基因的转录和翻译。细胞摄碘实验显示Bac-hTERT-NIS—Egr1-K5感染的HeLa细胞摄碘增加了5．6倍,与未加NaClO4组比,其摄碘能被NaClO4显著抑制（F=199．296,P〈0．05）。131I对Bac—hTERT-NIS—Egr1-K5感染的HeLa细胞的抑制效果明显,细胞存活率仅为38．3％。Bac—hTERT-NIS—Egrl一K5感染的HUVEC细胞在131I照射下的凋亡率（30．8％）显著高于Bac．hTERT-NIS—Egr1-0组和未加病毒组（11．2％和10．9％,F=19．926、45．409,均P〈0．05）。结论重组杆状病毒Bac-hTERT-NIS—Egrl．K5可使NIS基因在肿瘤细胞?     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导HeLa细胞p21WAF1/CIP1表达的分子机制研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDIs）诱导肿瘤细胞产生周期阻滞以及诱导p21^WAF1／CIP1表达的分子机制。方法：以人宫颈癌HeLa细胞为模型，用曲古抑茵素A（TSA）处理HeLa细胞，通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡，通过Western印迹及RT-PCR检测周期相关分子的蛋白及mRNA的表达；并构建TSA靶分子启动子区的荧光素酶报告质粒，进一步检测TSA的主要作用位点，寻找相关作用途径。结果与结论：TSA可诱导HeLa细胞发生周期阻滞，并呈现明显的剂量和时间依赖关系，加大用药剂量及延长用药时间可诱导凋亡。TSA可显著诱导p21^WAF1／CIP1的表达，表现为转录水平的调节，其变化可以指示周期阻滞的程度。p21^WAF1／CIP1启动子区3′端是TSA作用的主要位点，同样被TSA诱导表达增加的p53很可能通过与其效应元件的结合而使TSA诱导p21^WAF1／CIP1表达的总效果增强。     

HPV E6蛋白调控miRNA-145表达的分子机制及其在宫颈癌侵袭转移中的意义

目的研究宫颈癌细胞中HPV E6蛋白调控miRNA-145表达的分子机制及其在宫颈癌侵袭转移中的意义。方法 Northern-blot方法检测宫颈癌细胞中过表达p53对miR-145表达的影响;检测宫颈癌细胞中敲低HPV E6表达对miR-145表达的影响。Western-blot方法检测过表达HPV E6对内源性及外源性p53表达的影响;检测宫颈癌细胞中敲低HPV E6对外源性p53的表达的影响。应用划痕愈合实验,检测过表达miR-145的HeLa细胞与母本HeLa在细胞迁徙能力上的差异;Trans-well试验观察过表达miR-145的HeLa细胞与母本HeLa在细胞侵袭能力上的差异。结果宫颈癌细胞中过表达p53可显著上调miR-145的表达;过表达HPV E6可降低p53的表达;宫颈癌细胞中敲低HPV E6表达可增强p53的表达,并且可增强双氧水诱导的miR-145表达;过表达miR-145抑制细胞的迁徙、侵袭能力。结论 HPV E6通过抑制p53下调miR-145表达,从而促进宫颈癌细胞侵袭。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合曲古菌素A对人胃癌细胞株化疗敏感性的协同增强作用

目的 探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CAR)联合曲古菌素A(TSA)协同增强人胃癌细胞MKN-74化疗敏感性的作用及机制.方法 以MTT法观察5-Aza-CAR和(或)TSA与氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(OXA)、伊立替康代谢产物SN38或吉西他滨(GEM)联合应用对MKN-74细胞生长的抑制;流式细胞术分析细胞凋亡情况;RT-PCR检测p21、caspase3、Rb和p16基因表达,经Bandsean 4.3分析软件进行条带灰度分析,计算目的 基因与GAPDH灰度比值.结果 5-Aza-CdR联合TSA可进一步增强5-Aza-CdR对5-FU、PTX、OXA或GEM的化疗增敏作用,也可以增强TSA对OXA、GEM的化疗增敏作用.TSA OXA组、5-Aza-CdR OXA组与5-Aza-CAR TSA OXA组的细胞凋亡率分别为28.07%±2.37%、25.33%±2.84%及38.37%±3.23%;TSA GEM组、5-Aza-CdR GEM组与5-Aza-CAR TSA GEM组的细胞凋亡率分别为17.20%±2.07%、19.30%±2.95%、29.57%±3.10%(P＜0.05),说明5-Aza-CdR联合TSA协同可以促进OXA或GEM诱导MKN-74细胞凋亡.5-Aza-CAR联合TSA还可以增强caspase3、p16、Rb和p21基因的表达,与对照组(以其灰度值为1.00)相比,4种基因的表达分别为2.67、2.28、2.39和2.75.结论 5-Aza-CAR联合TSA可能通过协同调控基因表达、诱导细胞凋亡,提高胃癌细胞的化疗敏感性.     

高同型半胱氨酸血症致血管平滑肌细胞增殖的机制初探

 目的 探讨高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖在动脉粥样硬化发病中的机制.方法 整体水平实验:82例研究对象分为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)组54例,对照组28例.荧光生化法检测血浆总同型半胱氨酸(total homocysteine, tHcy)水平,甲基化特异的 PCR(Methy-specific PCR,MSP)法检测雌激素受体α(estrogen receptor-α ,ER-α)启动子区CpG岛的甲基化状态.细胞水平实验:体外培养的人脐动脉VSMC,用不同浓度同型半胱氨酸(homocy steioe, Hcy)处理,MTT法观察Hcy对平滑肌细胞生长的影响,MS-PCR法和Rt-PCR法检测ER-α基因启动子区甲基化程度及mRNA的表达.结果 整体水平实验中,AS患者中甲基化率为70.4%,对照组甲基化率为28.6%,差异具有统计学意义(P<0.05).细胞水平实验中,MTT结果显示Hcy对VSMC具有明显促增殖效应.Hcy显著增加ER-α基因启动区的甲基化修饰,并使ER-αmRNA的表达进行性减少.结论 Hcy通过干扰DNA的甲基化修饰,使ER-а基因高甲基化可能是高同型半胱氨酸血症促使VSMC增殖,并引起动脉粥样硬化的重要机制.     

Smac基因过表达对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的影响

目的探讨转染Smac基因过表达对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响,寻求改善宫颈癌放疗疗效的新途径。方法将Smac基因转染入宫颈癌HeLa细胞株,G418筛选获得亚克隆细胞,RTPCR、Westernblot法检测癌细胞Smac基因表达。X射线照射后,采用MTT比色法检测癌细胞体外生长活性;透射电镜、AnnexinV-FITC和碘化丙啶双染色流式细胞仪法检测癌细胞凋亡及比率;Westernblot、比色法检测细胞内Caspase-3蛋白表达和活性水平。结果RTPCR和Westernblot证实所获宫颈癌亚克隆细胞HeLaSmac的SmacmRNA、蛋白表达水平均显著高于HeLa(P<0.01)。8GyX射线照射后,HeLaSmac细胞生长活性较HeLa细胞减弱10.19%(P<0.01),透射电镜下可见部分HeLaSmac细胞发生典型凋亡形态学改变,凋亡率为16.4%,显著高于对照组HeLa细胞(凋亡率为6.2%,P<0.01)。与HeLa细胞比较,HeLaSmac细胞内Caspase3表达显著增加(P<0.01),活性水平提高3.42倍(P<0.01)。结论稳定转染外源性Smac基因使其在宫颈癌细胞株中过表达,能提高癌细胞中Caspase3的表达和活性,增强放疗对癌细胞的诱导凋亡作用,有望成为改善宫颈癌放疗效果的新途径。     

正常涎腺组织中E-cadherin，p16，RASSF1 A，DAPK和MGMT基因甲基化检测

目的：检测组织学正常的涎腺组织中5个抑癌基因的甲基化情况,为进行涎腺肿瘤的甲基化研究提供参照。方法甲基化特异性PCR （ methylation-specific polymerase chain reaction , MSP）法分析60例组织学正常的涎腺组织中E-钙黏蛋白（cadherin）, p16, RASSF1A,DAPK和MGMT基因启动子区的甲基化水平,并与前期研究中涎腺腺样囊性癌中的甲基化水平相比较,同时分析正常涎腺组织中E-cadherin（E-cad）, p16, RASSF1A,DAPK和MGMT基因的甲基化与患者的性别、年龄及吸烟之间的关系。结果13％（8/60）涎腺组织中发现存在甲基化,包括7％（4/60）E-cad,4％（2/60）p16,4％（2/60）RASSF1A,4％（2/60）DAPK,2％（1/60）MGMT。与之前腺样囊性癌中的结果比较,E-cad（P＜0．01）, p16（P＜0．01）, RASSF1A（P＜0．01）,DAPK（P＜0．01）基因的甲基化在肿瘤组织及腺体组织中有明显差异。但涎腺组织中E-cad, p16, RASSF1A,DAPK和MGMT基因的甲基化与患者的性别、年龄及吸烟均无明显的相关性。结论正常的涎腺组织中E-cad, p16, RASSF1A,DAPK 和 MGMT基因的甲基化均为少发事件。     

肺癌患者CDH13基因启动子甲基化状态研究

目的应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测非小细胞肺癌（NSCLC）CDH13基因启动子甲基化情况。方法留取44例非小细胞肺癌患者手术标本及12例非肺癌患者正常肺组织,MSP分析CDH13基因启动子甲基化情况。结果 44例非小细胞肺癌中CDH13基因启动子甲基化阳性率为54.5%（24/44）,12例正常肺组织中未检测到此基因的甲基化（0/12）。CDH13基因甲基化与患者性别及吸烟与否无关;肿瘤分期越晚甲基化的发生率越高。结论原发性非小细胞肺癌中存在着较高比例的CDH13启动子甲基化,提示CDH13在非小细胞肺癌的发生中起着重要作用。     

6-溴异香兰素对HeLa细胞的增殖抑制及放射增敏作用

目的研究香兰素衍生物中的6-溴异香兰素（6-溴-5-羟基-4-甲氧基苯甲醛,BVAN08）对HeLa细胞增殖和放射敏感性的影响,为开发新的抗癌和放射增敏药物提供理论依据。方法利用MTT法检测细胞增殖,单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤,流式细胞术检测细胞周期,克隆形成率法检测细胞放射敏感性,AnnexinⅤ/PI染色法检测细胞凋亡。结果研究表明BVAN08在10～20μmol/L以上浓度就显示出对HeLa细胞增殖的抑制作用,抑制程度具有剂量依赖性,抑制细胞存活的IC50值为19.07μmol/L。BVAN08能诱发细胞DNA双链断裂损伤,作用4h就开始诱发细胞周期G2/M阻滞,随时间延长阻滞更加明显。BVAN08明显降低DNA修复蛋白DNA-PKcs的表达水平,20μmol/LBVAN08与2Gyγ射线复合作用可以显著增加细胞对射线的敏感性,增加细胞凋亡率。结论 BVAN08抑制HeLa细胞增殖,提高细胞的放射敏感性,其放射增敏作用与降低DNA-PKcs蛋白表达水平和G2/M阻滞有关。