人乳头状瘤病毒DNA疫苗

人乳头瘤病毒 (HPV) ,尤其是HPV1 6型 ,是子宫颈癌的主要病原体。因此 ,通过引起病人适当的病毒特异性免疫反应可以预防或治疗HPV相关的子宫颈恶性肿瘤。在已经进行预防接种的个体中 ,包括L1和L2在内的HPV衣壳蛋白已经显示出能够产生对抗HPV颗粒抗体的抑制。此外 ,HPV致瘤性蛋白 ,例如E6蛋白和E7蛋白 ,在细胞转换的导入和维持方面是很重要的 ,在大多数包含HPV的癌症中它们也是共同表达的。它们为产生抗HPV感染和HPV相关肿瘤形成的治疗量的疫苗提供了理想的靶。针对这些蛋白的疫苗可能提供一个控制HPV相关恶性肿瘤的机会。拥有…     

人乳头状瘤病毒DNA疫苗

人乳头瘤病毒(HPV)，尤其是HPVl6型，是子宫颈癌的主要病原体。因此，通过引起病人适当的病毒特异性免疫反应可以预防或治疗HPV相关的子宫颈恶性肿瘤。在已经进行预防接种的个体中．包括L1和L2在内的HPV衣壳蛋白已经显示出能够产生对抗HPV颗粒抗体的抑制。此外，HPV致     

子宫颈癌人乳头状瘤病毒疫苗的研究进展

宫颈癌是全世界妇女第三大常见肿瘤 ,每年大约有 3 70 0 0 0新诊断的病例 [1]。尽管目前临床上应用手术或放疗治疗早期宫颈癌治愈率已达 90 %以上 ,但对中晚期病人的治疗仍比较困难 ,还有 3 5%病人没有有效地治疗的办法而发展为持续性或转移性疾病。故对宫颈癌的治疗和预防需要发展更有效的或辅助治疗。在所有宫颈癌细胞中几乎都有人乳头瘤病毒(HPV) DNA和病毒转化蛋白的表达 ,表明这一病毒在疾病的发病中起重要作用。高危 HPV的感染是宫颈癌的必然起因 ,这为发展治疗性疫苗来治疗早期和晚期宫颈癌提供了的机会。HPV预防性疫苗的发展也…     

表达HPV-16结构蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫效果研究

目的研究表达HPV—16结构蛋白L1和12的重组痘苗病毒（rVVL1L2）的免疫效果。方法以重组痘苗病毒rVVL1L2免疫C57BIJ6小鼠，用酶联免疫（ELISA）和酶联免疫斑点（ELISPOT）方法检测重组痘苗病毒诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平；利用C3肿瘤细胞在C57BIJ6小鼠中的成瘤模型，观察重组痘苗病毒在抗肿瘤移植实验和肿瘤生长抑制实验中对小鼠的免疫保护效果。结果重组痘苗病毒rVVL1L2免疫的小鼠，可以检测到针对L1和12特异的抗体、L1165-175肽特异性的、分泌IFN-的T细胞；同时可以观察到免疫后的C57BI/6小鼠，可以有效预防HPV．16相关肿瘤细胞（1．5×10^5C3细胞）的攻击；对已产生的肿瘤，可以延缓肿瘤细胞的生长速度。结论重组痘苗病毒rVVL1L2可以有效诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，为研究预防和治疗HPV-16感染的疫苗提供了实验资料。     

人乳头状瘤病毒16、18型变异及相关肿瘤

肿瘤的形成可由多种病毒引起[1],其一就是人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV).HPV是1949年从普通疣体浸出液中首次被观察到,1995年有研究证实HPV感染为宫颈癌的致病病原体.研究显示:HPV16、18能促使人类鳞状上皮的增生.目前HPV16、18变异体的致瘤性受到各国学者的广泛关注.     

人乳头瘤病毒16型结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒16型（HPV16）结构蛋白,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研究以及诊断试剂的研制遵基础。方法 将目的基因克隆至杆状病毒转移载体,该重组质粒DNA与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,通过同源重组获得重组杆状病毒,用SDS－PAGE凝胶电泳和Western blot法检测重组子在昆虫细胞中表达的目的蛋白。结果 获得了稳定高效表达HPV16结构蛋白的重组杆状病毒,L1和L2蛋白的相对分子质量分别为57000和97000,L1蛋白的表达产量约占昆虫细胞总体蛋白的25％－30％。结论 人乳头瘤病毒16型结构蛋白可在昆虫细胞内高效表达。     

宫颈癌与人乳头状瘤病毒16/18型的关系探讨

目的　应用荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)检测宫颈癌患者人乳头状瘤病毒 (HPV) 16 / 18型感染率 ,探讨HPV 16 / 18型与宫颈癌的关系。方法　应用荧光探针标记引物的荧光定量聚合酶链反应对 88例宫颈癌患者的宫颈分泌物进行了HPV 16 / 18型检测。结果　 88例宫颈癌患者宫颈分泌物FQ -PCR阳性率为 78% ,阳性样品定量对数平均值 (ml-1)为 5 .33× 10 6,定量测值范围 (ml-1)为 1.2 0× 10 3 ～ 2 .4 1× 10 7。对照组 85例全部阴性。结论人乳头状瘤病毒 (HPV) 16 / 18型感染与宫颈癌的发生发展关系密切。     

原核高效制备人乳头瘤病毒16型L1病毒样颗粒

目的通过原核表达系统高效制备人乳头瘤病毒(HPV)16晚期蛋白L1病毒样颗粒(VLPs)。方法构建HPV16L1基因序列优化前后的PET30aHPV16L1重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3);用IPTG诱导目的基因表达,两步层析方法纯化HPV16L1蛋白;电镜下观察纯化产物形成VLPs的情况。结果成功构建大肠杆菌工程菌,高效可溶表达(目的蛋白约占总蛋白的38%)并纯化HPV16L1蛋白,纯度达95%以上,电镜下观察,发现纯化后的目的蛋白为直径50 nm左右,形态与天然病毒颗粒高度相似。结论在大肠杆菌原核系统中高效、简易地制备了HPV16L1VLPs,为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。     

人乳头瘤病毒11型L1/E7嵌合DNA疫苗的构建及其诱导的免疫效应

目的 构建人乳头瘤病毒11型L1/E7嵌合DNA疫苗pcDNA3 L1-E7并研究其在小鼠中诱导的免疫效应.方法 用分子克隆技术构建重组真核表达质粒peDNA3 L1-E7.重组质粒DNA股四头肌注射免疫小鼠,用ELISA方法 检测L1、E7特异性抗体和脾细胞分泌的IL-2、γ-INF;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应.结果 成功构建pcDNA3 L1-E7.免疫小鼠后,重组质粒可诱导机体产生特异性脾淋巴细胞增殖及IL-2、γ-INF分泌增加,并诱导机体产生HPV 11-E7 IgG和HPV 11-L1 IgG抗体.结论 嵌合DNA疫苗pcDNA3 L1-E7能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应.     

实时荧光定量PCR法检测人乳头状瘤病毒的实验研究

目的 通过研究病变宫颈中人乳头状瘤病毒(HPV)16/18型的表达,探讨HPV16/18型病毒感染与宫颈病变发生发展之间的关系.方法 结合病理切片诊断,以免疫组化作对照.运用实时荧光定量PCR技术检测病变宫颈中HPV16/18型DNA拷贝数,以及HPV16/18型E7基因mRNA表达量.结果 慢性宫颈炎患者中HPV16/18型感染率低(7.4%).宫颈管上皮内瘤样变(CIN)组HPV16型感染率较高为69.6%,宫颈癌患者巾为72.7%.HPV16型DNA的拷贝数在宫颈上皮内瘤样变患者中与病理分级没有明显的相关性.但在宫颈癌患者中,病毒DNA的拷贝数明显升高,二者差异明显.CIN轻度(I)、中度(Ⅱ)、高度(Ⅲ)组和宫颈癌患者中,HPV16 E7基冈的表达率分别为0、37.5%、42.9%、63.6%.统计学分析表明,HPV16 E7 mRNA的拷贝数与病情呈明显的正相关性.结论 感染者中主要以HPV16型为主,HPV18型较少.宫颈癌患者中HPV16 DNA拷贝数明显高于CIN Ⅱ、Ⅲ组,HPV16型E7 mRNA在宫颈癌中表达率及表达量明显增加并与宫颈癌变呈正相关.实时荧光定量PCR适合临床宫颈病变病毒的筛查与检测.     

共刺激分子B7-2与HPV16L1联合基因免疫小鼠的免疫应答

目的：研究共刺激分子B7-2和HPV16L1重组质粒免疫小鼠的体液免疫反应。方法：用pcDNA-L1和PLXDmB7-2质粒共同肌注免疫C57BL/6小鼠，ELISA方法检测其血清抗体，红细胞凝集抑制实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验检测其抗体中和活性。结论：HPV16L1和B7-2基因联合免疫小鼠的血清抗体滴度增高。结论：共刺激分子B7-2联合免疫可以增加目的抗原的抗体产生，可能是HPV16有效防治性疫苗研制更有希望的策略。     

一种直接评价HPV16L1抗体活性的新方法

目的 :以pcDNAL1质粒免疫啮齿类动物 (C5 7BL/ 6 )为模型 ,观察HPV16L1VLP细胞结合抑制实验是否可以用于检测免疫抗体的中和保护作用。方法 :实验组包括Ⅰ组pcDNAL1、Ⅱ组HPV16L1VLP ;Ⅲ组pcDNA3.1。每组动物均为 6只C5 7BL/ 6鼠。每组动物均肌肉注射免疫 3次 ,间隔 3w。末次免疫后 14d眼球后取血并拉颈处死动物 ,进行HPV16L1VLP结合抑制试验 :免疫血清中和HPV16L1VLP ;制备Hela ,EJ和RLC310细胞爬片 ,CS12 13细胞涂片 ;细胞免疫组化染色。结果 :实验组血清中和后Hela细胞呈染色阴性 ,而对照组、不共育组则细胞呈棕黄色。结论 :这说明实验组血清具有抑制VLP与Hela细胞粘附的活性效应。这一方法可能比HAI更能直接反映中和抗体的活性和保护作用。     

HPV病毒16型感染的影响因素研究

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV) 16型感染的相关影响因素.方法 采用调查问卷的方式对1500例自愿进行宫颈脱落细胞HPV检测的筛查者进行调查,收集筛查者的基本信息、婚育史、月经情况、性行为情况、饮酒史、吸烟史、妇科手术史、卫生情况等,采用x2检验与多因素Logistic回归分析HPV病毒16型感染的相关影响因素.结果 1500例筛查者中,HPV阳性率为12.8％(192/1500),主要类型包含HPV16型40.1％(77/192),HPV58型16.7％(32/192),HPV18型10.4％(20/192).单因素分析结果显示,HPV16型感染的相关影响因素是吸烟史、很少进行妇科检查、首次性交年龄＜25、怀孕次数≥2、流产次数≥3、妇科手术史、性伴侣数目≥2.多因素Logistic回归分析结果显示,HPV16型感染的危险因素是吸烟史、首次性交年龄＜25、妇科手术史.结论 HPV16型感染的危险因素是吸烟史、首次性交年龄＜25、妇科手术史,应尽量避免.     

Everything you always wanted to know about HPV (but could not ask your doctor)

Objective To investigate specific information needs of people who search for information about the human papillomavirus (HPV) on the Internet.Methods We performed a qualitative analysis of the e-mail questions asked by the visitors of a website with evidence-based information about HPV. The website, hosted by Antwerp University, provided basic information on epidemiology and natural history of HPV in women and men, diagnostic and treatment options, screening, and vaccination. If visitors did not find an answer to their questions, they could mail their question to an e-mail address associated with the website.Results We received 713 questions posed by 527 e-mail correspondents. The following themes emerged as most important: transmission of HPV, the HPV vaccine, the natural history of the virus, the vicious circle (re-infection between partners), HPV detection in men and women, treatment of men and women, incubation time, pregnancy/fertility, genital warts (in)fidelity, and symptoms of HPV infection.Conclusion Both men and women are seeking health information on HPV on the Internet, often after being counseled by a health care provider.Practice implications Practitioners should be prepared for questions on the themes that concern people most. Practitioners may play a role in guidance towards reliable sources of information.     

人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒,为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板,PCR扩增L1的片段,L1片段经EcoRI和SalⅠ双酶切后,插入载体pGEX4T-1,转化JM109感受态细胞,平板筛选获得pGEX4T-1／HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T-1／HPV16L1,并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T-1／HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础,为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。     

广州东部妇女宫颈人乳头瘤病毒16型感染及基因分析

目的 研究广州东部妇女中人乳头瘤病毒16型(HPV-16)宫颈感染分布,分析其早基因E6/E7的多态性,分析L1和E6基因定量与病程的关系.方法 通过导流杂交基因芯片技术检测宫颈脱落细胞的HPV-16感染;通过特异性扩增获取病毒早基因E6/E7序列,克隆测序并进行多态性分析;荧光定量PCR技术对E6基因和L1基因进行定量分析.结果 806例宫颈脱落细胞样本中HPV-16感染阳性36例(4.5%),其中18例(50.0%)宫颈细胞发生高度以上病变;7例(4例低度或以下病变,3例高度以上病变或浸润癌)阳性标本得到E6/g7序列有15个位点分别出现变异;高度病变组(A组,11例)与低度或以下病变组(B组,14例)的L1基因和E6基因定量数据对数值均有显著差异(P<0.05),但L1/E6比值差异无统计学意义(P=0.19).结论 本地区在17～62岁妇女中HPV-16感染阳性发生率约4.5%,50.0%发生高度以上宫颈病变,本研究显示病毒基因拷贝数与宫颈病变程度可能有关,L1/E6比值未能提示病毒整合的发生.     

Characterization of the nuclear localization signal of high risk HPV16 E2 protein

The E2 protein of high risk human papillomavirus type 16 (HPV16) contains an amino-terminal (N) domain, a hinge (H) region and a carboxyl-terminal (C) DNA-binding domain. Using enhanced green fluorescent protein (EGFP) fusions with full length E2 and E2 domains in transfection assays in HeLa cells, we found that the C domain is responsible for the nuclear localization of E2 in vivo, whereas the N and H domains do not contain additional nuclear localization signals (NLSs). Deletion analysis of EGFP-E2 and EGFP-cE2 determined that the C domain contains an alpha helix cNLS that overlaps with the DNA-binding region. Mutational analysis revealed that the arginine and lysine residues in this cNLS are essential for nuclear localization of HPV16 E2. Interestingly, these basic amino acid residues are well conserved among the E2 proteins of BPV-1 and some high risk HPV types but not in the low risk HPV types, suggesting that there are differences between the NLSs and corresponding nuclear import pathways between these E2 proteins.     

人乳头瘤病毒多肽与人免疫球蛋白G融合表达

目的 将人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16，HPV-16)的晚期表达蛋白E7上的抗原24肽(从第38位氨基酸到第61位氨基6病毒感染防治酸)与人免疫球蛋白G的重链恒定区融合表达，并以此融合蛋白作为抗原，可能为HPV-1提供免疫治疗方法。方法 利用PCR方法分别扩增HPV-16 E7(38-61)24肽的DNA片段和人免疫球蛋白G的重链恒定区DNA片段，并构建到pEV21a表达载体上，转化入E．coli中表达，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western-blotting)的方法对表达结果进行鉴定。结果 构建的表达载体HPV16E7e／hIgGHCCR-pET21a经酶切鉴定和测序显示序列正确；通过SDS-PAGE和Western-blotting的鉴定，重组融合蛋白Mr约40000，表达量可占菌体蛋白的20％左右。结论 成功构建HPV16-E7的抗原多肽片段和人免疫球蛋白G的重链恒定区的融合蛋白，并可在E．coli中高效表达。     

HPV16E7基因疫苗诱导小鼠细胞免疫功能的实验研究

目的：探讨重组HPV16E7质粒免疫小鼠后诱导的细胞免疫反应。方法：将BALB／c实验小鼠随机分为三组，实验组小鼠免疫peDNA3．1-HPV16E7，对照组Ⅰ小鼠免疫peDNA3．1，对照组Ⅱ小鼠注射生理盐水。每周免疫一次，共免疫三次。末次免疫后一周，眼眶取血后处死小鼠。体外进行脾淋巴细胞增殖反应；流式细胞仪检测脾细胞亚群比率和外周血CD^4 、CD^8 淋巴细胞亚群数量；ELISA法检测脾细胞培养上清和血清中IFN-γ的含量。结果：peDNA3．1-HPV16E7免疫小鼠的脾细胞增殖反应明显高于对照组。CD^4 细胞数、CD^4 ／CD^8 比值及脾细胞培养上清和血清中的IFN-γ含量均高于对照组。结论：peDNA3．1-HPV16E7重组质粒可诱导BALB／c小鼠产生特异性细胞免疫反应。     

特异siRNA抑制宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒16型E6表达的研究

目的 优化HPV-16 E6癌基因特异的U6质粒表达的siRNA，抑制HPV癌基因表达及其对子宫颈癌细胞生长繁殖的影响。方法 选择4个分别针对HPV-16 E6 mRNA外显子和内含子序列为靶序列，合成DNA链，构建表达HPV-16 E6短发卡样dsRNA的重组pSilencer1．0-U6载体，导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞中HPV-16 E6、E7基因表达水平及其蛋白含量的变化，并观察细胞生长被抑制的情况。结果 4种HPV-16 E6 siRNA均能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率。通过细胞生长曲线观察到HPV-16 E6 shRNA表达质粒导入细胞0-96h内，可降低细胞生长速度。荧光定量RT-PCR检测HPV-16 E6 siRNA可使宫颈癌细胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因转录的mRNA水平降低，其中针对E6 mRNA内含子的重组shRNA只抑制E6基因的表达水平。Western blot分析表明，4个HPV-16 E6 siRNA作用72h后，未能检测到宫颈癌细胞中HPV-16 E6蛋白。结论 HPV-16 E6 siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。