人表皮细胞的体外培养

目的：对表皮细胞在不同的培养方法、不同的培养液及不同底物中的生长情况进行３方面的探讨，以便选出较好的一种组合进行表皮细胞培养，为改善烧伤皮源不足的问题打下基础。方法：①采用人包皮或体皮制成皮块、皮粒、表皮细胞悬液进行液体培养，比较３种方法中表皮细胞生长情况；②应用纯表皮细胞悬液进行空气液体界面培养，平铺平皿培养及培养瓶液体培养，比较表皮细胞贴壁、生长情况；③另将表皮细胞悬液接种于３种不同的培养液，即ＲＰＭＩ１６４０，ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ及ＭＥＭ比较细胞生长差异。结果：①在适当的条件下，离体的皮肤皮块、皮粒及表皮细胞悬液经培养皆能生长和分化，而表皮细胞悬液生长速度较快，纤维母细胞污染机会最少；②以Ｂｉｏｆｉｌ为底物的空气液体界面法，细胞生长速度最快，培养出的单层表皮细胞膜片易取出，不收缩；③表皮细胞在ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０及ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ３种培养基中的生长情况基本一致。结论：以Ｂｉｏｆｉｌ为底物的空气液体界面培养法应得到推广应用，它不仅加快了表皮细胞的生长速度，减少了纤维母细胞的污染，易于移植，同时解决了以往各种人工敷料仅针对Ⅱ度烧伤创面的治疗及暂时覆盖Ⅲ度创面的局限     

表皮细胞培养与移植研究Ⅰ、人角化细胞在三种培养法中生长的观察

应用三种培养方法观察人角化细胞生长、增殖与形成膜片的过程,共111次。人表皮细胞单层细胞生长率3T3饲养层培养法最高达80.0％;皮块培养法为52.5％;细胞悬液培养法仅为11.8％。3T3饲养层培养法效果最佳,优点较多,值得选用。皮块培养法简便易行,效果也可,如能设法排除成纤维细胞混合生长,仍为可选用的培养方法。     

体外培养同种异体表皮细胞及其在烧伤创面的应用

大面积深度烧伤的救治，自体皮源不足是失败的主要原因之一，近年来用经体外培养的异体表皮细胞覆盖烧伤创面的研究，为不少学者所关注，但因经培养的表皮细胞抵抗力弱，在烧伤切削痴创面移植不易成活，因此目前仍处于试验阶段，未能普遍应用于临床，我们自1992年开展此项研究，并已成功地培养了人表皮细胞，1996年开始，我们应用经体外培养的异体表皮细胞皮片用于Ic例烧伤患者的创面，取得较好疗效，本文就表皮细胞培养。胶原基底膜制作及临床应用体会进行讨论，1材料与方法1.1同种异体表皮细胞培养方法[1]：我们采用单个细胞培养和组织块…     

简易犬皮肤表皮细胞的体外培养

目的　探索犬皮肤表皮细胞简易培养方法 ,以此了解复合组织经体外保存后组织细胞的存活状况。方法　组织块培养法。结果　培养至第 5 d,倒置相差显微镜下可见表皮细胞从组织块周围长出 ,并向四周扩展。第 7d,组织块间长出的表皮细胞已相互汇合 ,交为一体 ,形成单层表皮细胞片。至第 1 1 d,扩增的表皮细胞片直径达 1 mm以上 ,在组织块周边可见乳白色、半透明的表皮细胞生长物。结论　犬表皮细胞在 RPMI1 64 0培养基中生长良好 ,增殖旺盛。组织块培养法简便、易行 ,适合犬表皮细胞培养。     

冻存人体皮肤皮块培养与细胞悬液培养的比较

目的：细胞增殖能力是评价冻存皮肤整体活力的重要指标之一，本研究为了比较冻存的人体皮肤皮块培养与细胞悬液培养成功率的差异，为客观评价冻存皮肤质量提供较可靠的方法，方法：将液氮中保存1周－2月的人体皮复温后，分别取标本进行皮块培养与细胞悬液培养，观察其培养的成功率，以新鲜皮肤对照，结果：冻存皮肤皮块培养成功率显著高于细胞悬液培养的成功率，结论：用皮块培养方法来判断冻存皮肤的增殖能力比细胞悬液培养更可靠。     

自体皮肤组织培养的实验研究

本研究应用不同来源皮肤组织进行表皮细胞培养获得成功，其结果证明：应用组织块培养成功率高，接种后２４小时后细胞开始生长，２－３周表皮细胞融合连片，表皮细胞层达５－６层，可用于临床，同时还发现，应用胶原做底层，表皮细胞生长快，融合连片快，在表皮细胞生长的同时成纤维细胞也生长，且生长速度快，阻碍表皮细胞的生长，用０．２５％胰蛋白酶与０．１％ＥＤＴＡ２：１混合液去除成纤维细胞效果较好，是细胞培养获得成功的     

人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立及三种方法比较

目的：建立胃癌裸鼠原位移植和转移模型，并比较三种不同方法的结果。方法：将胃癌肿瘤细胞悬液、胃癌裸鼠皮下移植瘤块和胃癌裸鼠原位移植瘤块种植于裸鼠胃壁，形成原位移植瘤，观察和比较三种方法所建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率。常规HE染色，观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移的病理切片。结果：细胞悬液种植的原位胃癌成瘤率为50％，淋巴结广泛转移率为37．5％，肝转移发生率为25％；皮下瘤块的原位成瘤率为100％，淋巴结广泛转移率为62．5％，肝转移发生率为50％，腹水形成率为6．25％；而胃癌裸鼠原位移植块再次原位移植的原位成瘤率达100％，淋巴结广泛转移率为87．5％，肝转移发生率为75％，腹水形成率为12．5％。细胞悬液成瘤时间较皮下肿瘤组织块和胃癌裸鼠原位移植块再次移植延迟2—3周，而后两者无差异。结论：三种原位移植和转移模型均具有人胃癌自然生长过程的特点，以胃癌裸鼠原位移植块再次移植为最优，且更具有人胃癌的生物学活性。     

经胰蛋白酶消化真皮皮浆培养成纤维细胞

采用手术切除的包皮或其它部位的正常断层皮，经胰蛋白酶消化揭去表皮，真皮成份在适量的细胞培养液中剪成皮浆，将此皮浆混悬液按点状法接种于培养瓶（皿）中，４～６ｈ可贴壁，然后再加入含胎牛血清的细胞培养液继续培养，结果２４ｈ便可观察到新细胞萌出，２周左右细胞增长成片，结果表明：与常用的胶原酶消化法和普通的组织贴块法相比，具有培养周期短等优点．     

两种建立人睑板腺癌动物模型的方法比较

目的 研究建立人睑板腺癌动物模型的方法,对比不同的方法对成瘤率的影响,为睑板腺癌的体内实验提供平台.方法 分别采用细胞悬液法和组织块移植法接种人睑板腺癌于BALB/C裸鼠体内,细胞悬液组和组织块组各接种裸鼠30只.观察两组移植瘤的成瘤率及生物学特性.结果 细胞悬液组成瘤率为20%,组织块组为46.7%.结论 组织块法较细胞悬液法成瘤率高,与原发肿瘤生物相似度接近,组织块移植法是建立人睑板腺癌动物模型的理想方法.     

人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立及两种方法比较

目的：建立人胃癌裸小鼠原位移植和转移模型，并比较两种不同方法的结果。方法：将肿瘤组织块和肿瘤细胞悬液种植于裸小鼠胃壁形成原位移植瘤，观察和比较了两种方法所建立模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率。结果：胃癌组织块种植的原位成瘤率达100％，淋巴结广泛转移率90％，肝转移发生率75％。细胞悬液种植的原位成瘤时间较组织块法延迟2周，成瘤率为67％，淋巴结广泛转移率为50％，肝转移发生率仅为30％。结论：两种原位移植和转移模型均具有人胃癌自然生长过程的特点，以肿瘤组织块原位模型为优，该模型的建立可为人胃癌转移机制和抗转移实验治疗的研究提供一种有价值的工具。     

人表皮细胞分离培养的研究

作为屏障设施的管理人员,只有明确净化设施的工作原理,才能制定合理的管理制度,进行科学的管理。国家标准对屏障环境的运行参数给出一个区间,在实际操作中,如何在该区间内确定一个既达到净化要求又达到节能要求的运行参数?本文从几个典型参数着手进行了探讨。     

手术扩大切除联合全厚植皮治疗面部皮肤鳞状细胞癌的效果观察*

目的：探讨手术扩大切除联合全厚植皮治疗面部皮肤鳞状细胞癌的临床效果。方法：收集2013年1月—2017年12月在南通大学附属医院皮肤科诊断为面部皮肤鳞状细胞癌的患者68例,均采用手术扩大切除联合全厚植皮的方法进行治疗,术后观察皮片存活率、肿瘤复发率等指标。结果：68例患者均在术中完整切除肿瘤组织,病理结果示切缘及底部未见肿瘤组织残留。术后皮片坏死面积：<5.0% 63例(92.6%)、5.0%~10.0% 4例(5.9%)、>10.0%~20.0% 1例(1.5%)。术后随访1年,肿瘤局部复发5例(7.4%),未发现远处转移。结论：手术扩大切除联合全厚植皮治疗面部皮肤鳞状细胞癌,术后皮片存活率高,外观效果满意,且肿瘤复发率较低,具有良好的临床疗效。     

应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液获取高纯度基底细胞

目的　尝试应用DispaseⅡ分离酶获得含有完整基底细胞的表皮 ,再经淋巴细胞分层液收集活性强、生长快的基底细胞。探讨这样的细胞能否加快生长 ,缩短培养周期。方法　取植皮术后所剩中厚皮 ,经Dis paseⅡ处理后 ,用镊子分开表皮与真皮 ,表皮经胰酶进一步消化后 ,把细胞悬液通过淋巴细胞分层液将收集到的细胞作为实验组。以Tr法分离的表皮细胞作为对照组 ,两组间就细胞数、生长速度 ,克隆形成率与成膜时间进行比较。结果　所得数据经统计学处理显示 :实验组细胞的生长速度、克隆形成率与成膜时间比对照组明显加快。两组间有显著差异 (P <0 0 0 1)。结论　应用DispaseⅡ与淋巴细胞分层液能获得纯度高、活性强、增殖快的基底细胞。可以缩短培养周期 ,具有重要的临床意义。     

人皮肤真皮在增生性瘢痕形成中作用的实验研究

目的验证人皮肤真皮层在增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)形成中的决定作用,探讨HS的发病机制.方法在裸鼠背部体表分别移植人的全厚皮片、刃厚皮片和中厚皮片,以及大鼠的全厚皮片,观察皮片干痂脱落后局部瘢痕增生的大体情况及组织学变化.结果只有移植人的全厚皮片才会发生明显的瘢痕增生,而移植人的刃厚皮片以及大鼠的全厚皮片则根本不发生瘢痕增生,移植人中厚皮片虽然部分可以发生一定程度的瘢痕增生,但增生程度及发生率均明显不如移植人的全厚皮片.结论人皮肤内在的因素是HS发生的决定因素,这种决定因素存在于人皮肤的真皮层.     

组织工程皮肤种子细胞生物学特性的研究

目的建立一种分离培齐组织工程皮肤种子细胞的方法,并对细胞的生物学特性进行研究。方法分别通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法对表皮干细胞和成纤维细胞进行分离培养,利用倒置相差显微镜和扫描电镜等对其进行形态学观察,MTT比色法对细胞的增殖动态进行测定,免疫组化法对两种细胞进行鉴定。结果分离的表皮细胞和成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖,活力较好,免疫组织化学染色为阳性。结论通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法分别获得的表皮干细胞和成纤维细胞在体外能够快速扩增、培养,可为下一步组织工程皮肤的构建提供充足、可靠的细胞源。     

组织工程皮肤用真皮支架细胞相容性的比较研究

目的研究几种真皮支架的细胞相容性，为构建组织工程皮肤提供资料。方法取胶原海绵、明胶海绵、PEGA和PHBV共4种真皮支架，与小鼠成纤维细胞和ES源表皮样干细胞体外培养，观察前者对后者粘附率的影响，及对成纤维细胞增殖的影响，评价真皮支架的细胞相容性。结果成纤维细胞和ES源表皮样干细胞在4种支架材料上均能粘附存活，成纤维细胞能增殖，但在胶原海绵、PHBV和PLGA支架上的增殖率明显高于明胶海绵。结论几种真皮支架的细胞相容性较好，可用于新型组织工程皮肤的构建。     

Growth activity of epidermal cells from different parts of human body

Background  Most epidermal cells used in skin tissue engineering are obtained from the skins of fetuses or prepuces, which can not be widely used in culturing and transplanting autologous epidermis for patients with extensive burn wounds. To solve the problem, in this study, we cultured epidermal cells from different parts of human body in vitro, and detected their growth activity.
Methods  Normal epidermal cells obtained from the prepuce, scalp, and axilla of male patients, were cultured and passaged. Their growth characteristics including adherent rate and growth activity were compared. Data were analyzed by homogeneity test of variance.
Results  In primary culture, the growth of epidermal cells from the prepuce was significantly faster than that of the epidermal cells from the scalp and axilla. In the cells obtained from the prepuce, 80% confluence was achieved on day 12, while on day 16 and day 20 in the cells from the scalp and axilla, respectively. However, no significant difference was detected in their growth and proliferation in the second passage.
Conclusions  Although the growth of epidermal cells obtained from the scalp and axilla is slower than that from the prepuce in primary culture, stable cell line can be established and used in preparation of auto-epidermal grafts for patients with extensive burn wounds. Therefore, the scalp and axillary skin should be considered as important sources of epidermal cells other than the prepuce.

     

源于人躯干皮肤真皮的成纤维样细胞的间充质干细胞分化潜能

目的: 研究从人皮肤真皮组织中分离培养的成纤维样细胞向中胚层细胞分化的潜能,初步探讨其替代自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)用于组织损伤和缺损修复的可行性。方法: 将一定大小的成人腹部全层皮肤组织分别用分散酶和Ⅰ型胶原酶消化,分离获得真皮来源总细胞。单层培养扩增的细胞在含有一定浓度N2、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养液中进行悬浮培养,并收集培养液中悬浮存在的球状细胞聚集体(SDDSs),用含胎牛血清的培养液进一步单层扩增细胞。以免疫细胞荧光法分析细胞和鉴定细胞的分化特性。结果: 真皮中分离的一些单个细胞在无血清培养液中分裂增殖形成SDDSs;在含血清的单层培养条件下,从SDDSs分离培养的细胞增殖活跃,细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD105和波形蛋白;分别向骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞诱导分化后,呈现类似于BMSCs分化特点,分化的细胞呈茜素红、番红O和油红O特殊染色阳性反应,但真皮细胞分化形成的软骨细胞番红O染色弱于骨髓干细胞来源的软骨细胞。结论: 结合无血清培养和有血清培养法,可从人真皮组织中分离培养具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化潜能的细胞,此细胞将有望替代BMSCs用于临床组织损伤修复的再生治疗。     

MG-63骨肉瘤原位模型的建立

目的 建立裸鼠股骨骨肉瘤原位模型.方法 体内连续传代筛选MG-63细胞系获得高成瘤率的细胞,MG-63细胞悬液或MG-63细胞皮下成瘤瘤组织块接种于裸鼠股骨下端.观察MG-63细胞在股骨骨肉瘤原位模型的成瘤特性,并比较两种成瘤方法的成瘤率,常规影像学检查以及肿瘤组织病理检查.结果 两周内可见局部肿瘤形成.术后4周X线片可见股骨下段溶骨及成骨改变、肿瘤样骨形成.光镜下可见典型的骨肉瘤病理特征,成骨作用明显.细胞悬液法成瘤率70%,组织块法成瘤率100%,两种方法成瘤率的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功建立了裸鼠股骨下段原位肿瘤移植模型,为骨肉瘤的研究提供了更接近人体内环境的研究基础.