脱细胞气管基质及PGA膜细胞生物相容性比较研究

目的:采用体外细胞培养的方法,对自制的家兔、SD大鼠脱细胞气管基质材料、PGA膜的细胞生物相容性进行比较研究,探讨脱细胞基质用作组织工程化人工涎腺样组织体外构建研究所需支架材料的可能性。方法:取新生SD大鼠颌下腺细胞,经体外培养扩增后,将传代的颌下腺腺细胞接种在上述3种材料上进行体外培养,对材料上的细胞进行形态学、细胞增殖情况、材料/细胞培养上清液中α-淀粉酶含量进行观察或检测。结果:涎腺细胞均能在气管基质材料及PGA膜上黏附、生长。以天然气管衍生材料更佳。结论:脱细胞气管基质材料是一种细胞生物相容性良好的支架材料,可用于组织工程化涎腺样组织体外构建的实验研究。     

脱细胞气管基质制备及组织相容性初步研究

目的:制作脱细胞气管基质,为组织工程化人工涎腺样组织的体外构建研究提供天然衍生生物导管支架材料。方法:用改良的去污剂-酶联合多步法脱除家兔、SD大鼠气管组织中的细胞,并将处理后的气管行HE染色,观察脱细胞及组织结构情况;扫描电镜下观察气管壁表面结构。然后将脱细胞气管植入SD大鼠面颊部,并于1、4、12周后取出进行组织学观察。结果:处理后的气管组织中细胞脱落完全,管腔内壁纤维组织完整、能保持气管原有的中空状管形。扫描电镜见气管内壁为规则的粗糙沟槽状结构。植入体内12周后与周围组织相容较好,未见明显管腔塌陷及炎性反应。结论:制备的气管材料,细胞脱落完全,是进行组织工程化人工涎腺样组织体外构建研究较理想的细胞外基质材料。     

大鼠下颌下腺细胞与柞蚕丝素蛋白膜体外复合培养的实验研究

目的:通过大鼠下颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSMGs)与柞蚕丝素蛋白(antheraea pernyi silkfibroin,ApSF)膜的体外共培养,探讨RSMGs在支架上的形态特征、黏附、增殖及分泌功能。方法:将柞蚕丝素蛋白膜、桑蚕丝素蛋白(bombyx mori silk fibroin,BmSF)膜分别接种SD大鼠的RSMGs进行共培养,并以24孔培养板单独培养的RSMGs作为阴性对照组。免疫细胞化学抗角蛋白抗体(cytokratin 8,CK8)、淀粉酶抗体(amylase)染色鉴定细胞来源;扫描电镜、荧光显微镜观察细胞支架复合生长情况;检测细胞在支架上的黏附率;MTT比色法检测材料上细胞的增殖能力;Amano法测定上清液中淀粉酶含量,检测细胞支架共培养后下颌下腺细胞的功能。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫细胞化学染色观察共培养后的细胞,上皮细胞特异性抗体CK8染色阳性,腺泡上皮细胞特异性抗体Amylase染色阳性。扫描电镜可见,共培养后ApSF膜上细胞增殖活跃,表面呈现出微绒毛等超微结构,并向支架材料伸出伪足。荧光显微镜下可见,随着共培养时间的延长,支架上锚定的种子细胞数量增多,形态规则。2组支架接种细胞1 h后,RSMGs开始附着于支架上且黏附率差异不显著(P>0.05);4～12 h 2组黏附率逐渐增大,ApSF组较BmSF组更显著(P<0.05);24 h时,95%细胞黏附于2种材料上,2组差异不显著(P>0.05)。MTT提示,RSMGs与ApSF复合培养3、5 d后增殖迅速,第7天时达到峰值;ApSF组的细胞在第3、5和7天增殖速度与BmSF组差异显著(P<0.05),2组细胞增殖均与阴性对照组差异显著(P<0.05)。Amano法提示,随着接种后培养时间的延长,2组淀粉酶含量均有不同程度的增加;ApSF组在第3、5、7天时唾液淀粉酶浓度与BmSF组相比有显著差异(P<0.05),2组酶浓度均与阴性对照组差异显著(P<0.05)。结论:RSMGs与ApSF复合培养后,可保持细胞表型、增殖分化能力及分泌功能。ApSF对于RSMGs具有较好的细胞相容性。     

下颌下腺脱细胞载体的制备及超微结构观察

目的：制备天然的下颌下腺脱细胞载体材料，观察脱细胞后的超微结构变化。方法：采用化学除垢剂法，对SD大鼠的下颌下腺进行脱细胞处理，通过透射电镜及扫描电镜对细胞载体进行观察。结果：透射电镜下见，下颌下腺细胞溶解破坏，只残留一空虚的陷窝。扫描电镜显示，正常的下颌下腺细胞呈球状，表面略凸凹不平。而脱细胞处理后，细胞形态消失，胶原纤维交叉排列，呈网状结构。结论：Triton X-100脱细胞处理的下颌下腺细胞成分完全消失，而胶原纤维为主的基质成分排列正常。     

脱细胞气管基质制备及其生物相容性研究

目的:比较研究家兔、SD大鼠脱细胞气管基质材料生物相容性,为组织工程化人工涎腺样组织的体外构建实验准备材料。方法:用改良去污剂-酶联合多步法对SD大鼠、家兔气管组织进行脱细胞处理,并分别对2种材料行组织学、内壁拓扑结构及生物相容性研究。结果:处理后的2种气管组织中细胞均脱落完全,生物相容性好。结论:自制的脱细胞气管基质材料可用于组织工程化涎腺样组织体外构建的实验研究。     

SD大鼠原代颌下腺细胞体外培养的生物学特征研究

目的：研究SD大鼠颌下腺细胞体外培养的生物学特征,为组织工程化涎腺样组织的体外构建提供有功能的种子细胞。方法：获取新生SD大鼠幼崽颌下腺组织,经酶消化后体外培养,倒置显微镜、电镜下行形态学及免疫细胞化学染色观察。绘制生长曲线,对涎腺细胞的生物特征进行评价。结果：体外培养的颌下腺细胞CK(anti-cytokeralin)及淀粉酶染色阳性,体外增殖活跃。结论：体外培养的颌下腺细胞增殖活跃,保持了腺细胞的生物特征,可作为体外构建组织工程化人工涎腺研究的种子细胞。     

体外培养大鼠颌下腺细胞的生物学特性研究

目的 :研究体外培养颌下腺细胞生物学特性。方法 :应用胰酶消化法进行颌下腺细胞的分离纯化 ,然后进行颌下腺细胞原代和传代培养。绘制培养细胞的生长曲线 ;MTT法检测培养细胞活力大小。透射电镜 (TEM )观察结合免疫组化检测鉴定细胞来源及性质。结果 :整个颌下腺细胞生长期间为呈多样性的上皮细胞 ,细胞可传 4～ 5代 ,成活 3 0～ 40d。随培养时间延长 ,各组细胞数量都有不同程度的增加 ,比较培养 72h原代、第 2代与第 4代细胞吸光度值 ,原代、第 2代与第 4代相比较有显著性差异 (P <0 .0 5 )。超微结构观察及免疫组化染色培养细胞表现为腺上皮细胞的特征。结论 :原代和传代培养第 1代、第 2代颌下腺细胞活性较强 ,可在进一步的实验得以应用     

SD大鼠损伤下颌下腺干/祖细胞免疫及流式细胞分析

目的：对损伤SD大鼠下颌下腺中分离获得的唾液腺干/祖细胞（Salivary Gland Progenitor cells--SGPs）进行分析。方法：在结扎主导管的SD大鼠下颌下腺损伤模型中分离、培养类上皮单克隆细胞,利用α6β1整合素（α6β1 integrin）、层粘蛋白（LN）、β1整合素（CD29）、角蛋白19（CK19）分别进行免疫荧光学鉴定;CD29,CD90.1,标记后流式细胞术分析。结果：SGPs的α6β1 integrin、LN、CD29、CK19抗体阳性。流式细胞分析α6β1 integrin,CD29,CD90.1表达率分别为（94.99±4.04）%、（97.41±3.15）%、（98.81±1.58）%,CD29/CD90.1双标后表达率为（97.15±3.43）%。结论：SD大鼠损伤下颌下腺中获得的单克隆细胞具有组织干细胞特征。     

大鼠下颌下腺细胞培养及其生物学特性研究

目的:体外培养大鼠下颌下腺细胞,并对其生物学特性进行研究,为涎腺疾病的探索提供体外模型。方法:无菌条件下取7 d龄Wistar大鼠双侧下颌下腺,仔细分离脂肪、包膜、神经和血管,采用组织块培养法进行培养。运用酶消化法和差速贴壁法纯化细胞;免疫组化SP法检测Cytokeratin-8(CK-8)抗体和α-Amylase抗体的表达;PAS染色法检测细胞糖原分泌;扫描电镜(scanning electronic microscopy,SEM)观察细胞的形态学特征。结果:组织块培养法可成功获得下颌下腺细胞,免疫组化染色可见大部分细胞胞质为棕黄色,提示CK-8抗体表达阳性,α-Amylase抗体表达阳性;PAS染色可见胞质呈紫红色;SEM可见细胞伸出长短不一的伪足,胞核着色深,有些细胞可见分泌颗粒。结论:组织块培养法可以成功培养大鼠下颌下腺细胞,并且操作简便。     

异丙肾上腺素对SD大鼠原代颌下腺细胞增殖的影响

目的研究异丙肾上腺素对颌下腺细胞增殖的影响,为体外构建组织工程化涎腺提供充足的种子细胞。方法采用不同的方式加入异丙肾上腺素后,用Brdu标记阳性的细胞比率及绘制生长曲线的方法,检测颌下腺细胞的增殖能力。结果体外培养条件下,颌下腺细胞保持了对肾上腺素能受体刺激的反应,但与给药浓度及方式有关。结论异丙肾上腺素能在一定作用时间和浓度条件下促进颌下腺细胞的增殖,能为体外构建组织工程化涎腺提供种子细胞。     

颌下腺细胞与丝素-壳聚糖在体内复合培养的动物实验

目的 探讨在丝素-壳聚糖(silk fibroin-chitosan,SFCS)支架上接种颌下腺细胞后,在大鼠体内构建组织工程化颌下腺的可行性及生物学特性.方法 将36只8周龄SD大鼠分成实验组和对照组,每组各18只.取1～3d龄SD大鼠颌下腺原代细胞培养、传代、细胞来源鉴定后,将第二代细胞标记5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5′-BrdU),制备成5×109个/L的颌下腺细胞悬液,将其接种于5 mm×5 mm×5 mm的SFCS上,体外培养1周后将细胞-支架复合物植入实验组,将单纯SFCS支架植入对照组,分别于3、7、14 d处死大鼠后取材,进行大体、组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察.结果 大体观察:植入物表面被膜覆盖,周围组织反应较轻.组织学观察:随着培养时间延长细胞数逐渐增多,细胞黏附于材料表面或分散在支架内,聚集成集落、呈岛状排列,分泌粉染的细胞外基质.BrdU免疫组织化学观察:术后3个时间点均存在阳性细胞.细胞角蛋白8( cytokeratin 8,CK-8)免疫组织化学观察:术后3个时间点均存在阳性细胞,随时间延长数目逐渐增多.扫描电镜观察:SFCS呈网状结构,植入初期的颌下腺细胞呈圆形、表面光滑、散在的黏附于SFCS表面或网孔内;随时间延长,颌下腺细胞表面凹凸不平,细胞数目增多,黏附于材料表面并伸出突起,细胞间相互接触.结论 利用SFCS支架接种颌下腺细胞后,可在体内构建组织工程化涎腺样结构,为进一步进行组织工程化颌下腺的研究奠定理论基础.     

人胚颌下腺细胞原代及传代培养

目的 :研究人胚颌下腺细胞原代及传代培养的方法 ,为进一步研究颌下腺细胞的功能、起源、发生及发展奠定基础。方法 :在DMEM培养基中加入FBS、表皮生长因子 (EGF)及氢化可地松 (HC) ,观察细胞的生长特点。结果 :在含有 φ =2 ?S、10ng/mlEGF、5 μg/ml胰岛素 (INS)及 5 μg/mlHC的DMEM培养基中上皮细胞生长最好 ,其它组上皮样细胞生长状态不佳。培养的细胞为圆形、三角形、多边形 ,细胞伸展良好。细胞传代后生长良好 ,形态并未发生改变。HE染色可见细胞为圆形 ,三角形 ,多边形 ,核蓝染 ,胞浆粉染。大多数细胞cytokeratin染色阳性 ,说明为上皮细胞 ,少数细胞CK18染色阳性 ,说明培养的细胞中含有一部分导管上皮细胞。结论 :含有 φ =2 ?S、10ng/mlEGF、5 μg/mlINS及 5 μg/mlHC的DMEM培养基最适合体外原代及传代培养人胚颌下腺细胞     

层粘连蛋白对体外培养颌下腺细胞影响的研究

目的：研究层粘连蛋白（laminin，LN）对鼠颌下腺细胞（rat submandibular gland cells，RSGCs）生长及分泌功能的影响。方法：取对数生长期的第2代大鼠颌下腺细胞用于实验，按加入不同浓度LN分4组（0、5．0、25．0和50．0mg／L）进行培养，相差显微镜的观察，绘制生长曲线，MTT比色法、自动生化分析仪检测LN对细胞增殖及淀粉酶分泌功能的影响。结果：培养的RSGCs免疫组化鉴定CK8．13、S-100蛋白染色呈阳性，波形丝蛋白染色呈阴性。培养72h后MTT法检测5．0-50．0mg／LLN组细胞吸光度A值与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。培养96h后检测培养液中淀粉酶的含量，各浓度组与对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：LN能促进RSGCs的黏附和增殖并保持RSGCs的正常分泌功能。     

下颌下腺脱细胞基质的制备及其胶原成分观察

目的:制备天然的下颌下腺脱细胞基质材料,观察脱细胞后下颌下腺的组织结构,并对其成分进行分析。方法:采用化学除垢剂法对SD大鼠的下颌下腺进行脱细胞处理,通过组织学及免疫组织化学对脱细胞基质材料进行观察及检测。结果:光镜下见下颌下腺细胞消失,基质成分呈筛网状。免疫组织化学证实,在SD大鼠下颌下腺脱细胞前后的组织中,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原均呈强阳性表达,而Ⅳ、Ⅴ型胶原呈弱阳性或阴性表达。结论:TritonX-100脱细胞处理的大鼠下颌下腺基质中,主要成分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白。     

小鼠颌下腺器官体外培养研究

目的建立小鼠颌下腺器官半固态体外培养系统，观察培养效果，初步研究小鼠颌下腺器官体外培养和体内生长差异。方法利用DMEM-F12和明胶建立半固态体外培养系统，选用出生后1天的C57小鼠颌下腺在该培养系统中进行培养，分别于培养后1、2．3天取出颌下腺，进行形态学观察，通过HE染色和AB-PAS染色观察组织学以及进行细胞培养，与体内生长的同期小鼠颌下腺进行比较。结果体外培养的小鼠颌下腺体积逐渐增大，组织进一步成熟，培养后的细胞能够正常生长，形态正常。与体内生长的同期小鼠颌下腺进行比较，其体积增大稍慢，在组织成熟，细胞形态上无明显差异。结论首次应用该半固态培养系统进行出生后小鼠颌下腺器官培养，与体内生长的同期小鼠颌下腺相比，形态学、组织学和细胞形态上无明显差异，但体积增长速度稍慢，可用于模拟体内环境进行相关研究。