刚地弓形虫多表位抗原基因在转基因番茄中的表达研究

目的 获得稳定表达弓形虫多表位抗原基因（Tg-MAG）的转基因番茄植株。 方法 用植物组成型启动子E35S、番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S-E81.1复合式启动子驱动弓形虫Tg?-MAG的植物表达载体pC35MG、pCE2MG与pC35E1MG，以农杆菌介导的T-DNA转化法转化番茄子叶和下胚轴；经芽诱导、伸长以及生根的连续性抗性筛选和培育，获得Tg-MAG转基因番茄植株，练苗后移栽花盆中培育至开花、结果。用PCR、RT-PCR、蛋白质印迹（Western blotting）分别对Tg-MAG转基因植株进行DNA、RNA、蛋白水平的鉴定。 结果 获得的Tg-MAG转基因番茄植株经PCR和RT-PCR鉴定，得到预期360 bp的Tg-MAG片段，经Western blotting筛选获得能正确表达预期相对分子质量（Mr）为11 900 的Tg-MAG重组蛋白，且８株具有免疫反应性，其中有２株于番茄果实中所表达的重组蛋白能与抗弓形虫速殖子主要表面抗原１（SAG1）单克隆抗体K7H3发生强免疫反应。 结论 获得Tg-MAG转基因番茄株系，在其果实中成功表达具有良好免疫反应性的Tg-MAG重组蛋白。     

弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

目的构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体。方法①将TGMG亚克隆人pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG。②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG。③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG。测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列。④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA404。结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确。结论成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG。并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌。     

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。     

弓形虫新基因表位疫苗质粒的构建及鉴定

目的构建两个弓形虫新基因2B9G1、7C3-C3的表位疫苗质粒,为阐明表位疫苗的保护性奠定基础。方法采用生物信息学方法对新基因2B9G1、7C3-C3进行表位预测,PCR扩增基因中编码3个表位的片段W2b、W2a和W4a,连接入pcDNA3,转入DH5α,挑阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定;同法将W2a、W4a分别克隆入pcDNA3-W2b载体中W2b片段下游,再将W4a克隆入pcDNA3-W2b2a载体中W2a片段下游。结果经PCR、酶切鉴定及序列测定,W2b、W2a和W4a 3个片段分别插入pcDNA3预期位置;W2a和W4a片段分别插入pcDNA3-W2b预期位置;W4a片段插入pcDNA3-W2b2a预期位置。结论成功构建单表位、双表位、多表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b4a、pcDNA3-W2a2b4a。     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表达及鉴定

目的探讨肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反应活性。方法对CARDS毒素蛋白的抗原表位进行分析,选取10个重要的表位进行拼接,反向翻译后合成并克隆,插入pET28a表达载体构建pET-CARDS表达质粒并转入受体菌。经IPTG诱导表达的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His单克隆抗体和人阳性血清进行了免疫印迹的检测。结果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表达载体构建成功,诱导后表达大小为30KDa的重组蛋白,Western blot测定其能与6×His单克隆抗体和人阳性血清发生反应。结论本研究选取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有较强的免疫活性,可为Mp感染的诊断提供新的候选抗原。     

弓形虫抗原表位研究进展

弓形虫是一种呈全球分布的专性细胞内寄生原虫,广泛寄生于人和动物的有核细胞内,能引起严重的人兽共患寄生虫病。因此,对弓形虫及弓形虫病的研究日趋得到学者们的重视。由于弓形虫生活史较复杂,抗原成分多,每种抗原在体内诱导的免疫效应不同,实验证明,单价亚单位疫苗免疫效果和单一抗原诊断试剂检测效果均不理想,研制多表位疫苗和诊断试剂必然是一个新的发展趋势。     

刚地弓形虫P30基因的克隆及编码蛋白结构与抗原表位的生物信息学分析

目的 克隆刚地弓形虫P30基因,从生物信息学角度分析P30基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法 提取刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株速殖子总RNA,进行RT-PCR扩增,扩增产物经NheI和AflⅡ双酶切后与真核表达载体PVAXI连接,转化后通过菌落PCR、双酶切和测序鉴定。使用Protparam、Protscal、SOSU、SWISS-MODEL、SOPMA、Bcepred和TMHMM等在线分析工具,分析P30蛋白的物理和化学性质、亲水性、疏水性、二级结构、表面可及性、柔韧性、细胞定位、跨膜结构域、信号肽、翻译后修饰位点、结构域、功能域、抗原表位和三级结构。结果 RT-PCR扩增大小为789 bp,菌落PCR显示,在约789 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符,阳性PVAXI-P30重组质粒经Nhel和AflⅡ双酶切获得大小为789 bp和3 000 bp的两条条带,大小与目的基因和载体片段相等,测序结果显示,P30基因大小为789 bp,与GenBank的P30基因(登录号为X14080.1)核苷酸序列一致性为100%。P30蛋白含有...     

弓形虫新基因表位疫苗免疫效果的观察

目的观察弓形虫新基因WX、WX2的表位疫苗对小鼠的保护作用。方法将昆明小鼠分成5组,分别用pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b4a质粒及pcDNA3和NS,肌注3次,每次间隔2周。免疫完成后ELISA法检测血清抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测CD4 与CD8 淋巴细胞比值,PCR检测肌肉组织中重组质粒。免疫后第3周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察发病情况和存活时间。30d后仍存活的小鼠,取组织匀浆后进行小鼠盲传。结果免疫后第3周,pcDNA3-W2b组小鼠血清抗体水平显著高于pcDNA3和NS对照组(P<0.05);用PCR法从pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a和pcDNA3-W2b4a质粒组小鼠肌肉组织中成功检测到各表位疫苗质粒,且各组小鼠脾脏CD4 与CD8 T淋巴细胞比值显著低于pcDNA3组和NS组(P<0.05)。pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2b4a组小鼠存活时间与pcDNA3组及NS组比较明显延长(P<0.05)。结论弓形虫新基因WX、WX2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示DNA类表位疫苗的研制可作为弓形虫疫苗研究的策略之一。     

刚地弓形虫复合基因疫苗、混合疫苗及多表位疫苗研究进展

有效的疫苗免疫是预防弓形虫病的最理想方法.当前弓形虫疫苗的研制虽然取得了一些进展,但是单价疫苗的免疫效果并不理想.寻找更有效的候选抗原基因和合适的载体及研究多种抗原基因的优化组合将是今后弓形虫疫苗研究的主要方向.该文就弓形虫复合基因疫苗、混合疫苗及多表位疫苗的研究进展进行综述.     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

弓形虫表面抗原SAG3基因的克隆与表达

目的克隆表达弓形虫RH株SAG3基因,为深入研究其结构及功能奠定基础。方法从弓形虫RH株基因组DNA中特异性扩增出编码SAG3基因的片段,相应酶切后克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建pET-SAG3重组质粒。将pET30-SAG3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经EcoRⅠ、Hind III酶切及测序鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。结果体外扩增的SAG3基因片段与目的片段大小相符约1 155bp,成功构建了重组表达质粒pET30-SAG3,SDS-PAGE、Western blot显示SAG3-His融合蛋白的分子量大小约为50kd。结论弓形虫表面抗原SAG3基因在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究SAG3的结构和功能奠定基础。     

刚地弓形虫硫氧还蛋白基因的克隆 表达及鉴定

目的 目的 克隆刚地弓形虫硫氧还蛋白 （Thioredoxin,Trx） 基因, 构建原核表达载体, 通过诱导表达和纯化蛋白, 免 疫家兔制备多克隆抗体。方法 方法 采用PCR技术扩增刚地弓形虫Trx基因, 克隆至原核表达载体pET?28a （+） 中, 转化大肠 埃希菌 （E. coli） Rosetta, 用IPTG诱导目的蛋白表达, 采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体。利用 Western blotting技术鉴定多克隆抗体的特异性。结果 结果 成功从刚地弓形虫 cDNA 中扩增出 Trx 目的基因, 构建了 Trx/pET?28a （+） 重组质粒, 获得抗Trx重组蛋白的多克隆抗体。Western blotting技术检测出弓形虫Trx蛋白的特异性条 带。结论 结论 用制备的兔抗Trx多克隆抗体能检测弓形虫Trx在速殖子内的表达, 为进一步深入研究刚地弓形虫Trx功能 奠定了基础。     

弓形虫Rhomboid-1蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）Rhomboid-1（TgROMl）蛋白。方法收集、纯化弓形虫速殖子,用Trizol法提取总RNA,应用RTPCR技术扩增TgROMl基因,回收的PCR产物与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-TgROMl。将重组克隆质粒亚克隆至原核表达载体pGEX一4T—l中,构建重组表达质粒pGEX-4Tl-TgR（）M1并转化至Rosetta感受态,用IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了643bp的TgROMl基因,双酶切鉴定重组表达质粒pGEX-4T-1-TgROMl构建正确。SDS-PAGE检测重组表达质粒表达的TgROMl蛋白分子质量约为48ku,Westernblot检测表明该蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论成功克隆了弓形虫ROMl基因并原核表达了具有反应原性的重组TgROMl蛋白,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

弓形虫ROP2-P30重组真核表达质粒的构建及其免疫效应的初步分析

目的构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合的重组真核表达质粒,观察融合抗原ROP2-P30以DNA免疫方式在体内的免疫学效应。方法以重组质粒pET28b/ROP2-P30为模板,利用分子克隆技术构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30,经PCR和酶切鉴定正确后,体外转染COS-7细胞,Westernblot检测ROP2-P30表达。重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30以每鼠100μg混合透明质酸酶10U的剂量肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,以弓形虫虫体裂解抗原作包被抗原,ELISA法测定免疫小鼠血清IgG抗体,免疫结束2周后,以约100个弓形虫速殖子攻击感染小鼠,观察小鼠生存状况。结果PCR和酶切鉴定表明重组质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建正确;Westernblot显示该重组质粒在COS-7细胞中瞬时表达的产物可被重组ROP2-P30免疫兔血清识别;ELISA检测重组质粒免疫小鼠血清特异性IgG抗体水平升高;重组质粒免疫小鼠感染弓形虫后的存活时间较对照组有所延长。结论重组真核表达质粒pcDNA3.1/ROP2-P30构建成功,用该重组质粒DNA直接免疫小鼠,能够诱导产生特异的体液免疫反应,具有一定的免疫保护性;该重组质粒表达的融合抗原分子ROP2-P30具有免疫原性,可作为疫苗候选抗原深入研究。     

弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAC而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况。结果PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达。结论成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8。     

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒，并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术，构建pVAC-GRA4重组质粒；利用脂质体介导转染法，将该重组质粒导入HEK-293细胞，用RT—PCR法及Westem-blot法检测其表达情况；利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB／c小鼠体内细胞，测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4含量，并观察攻毒试验后小鼠存活情况，以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段，成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4；转染GRA4的HEK-293细胞，RT—PCR检测可见一条约987bp的目的条带，表达产物经Western—blot鉴定，其分子量约为41kD，能被特异性免疫血清所识别；经pVAC-GRA4免疫后的小鼠，其CD4^＋T细胞百分率无明显变化（P〉0．05），CD8^＋T细胞百分率明显增加（与pVAC对照组比较P〈0．05，与空白对照组比较P〈0．01）。CD4^＋／CD8^＋比值也较空白对照组明显降低（P〈0．01）；pVAC-GRA4免疫鼠IFN-γ的A值比对照组略高，但差异无显著性（P〉0．05）。IL-4A值各组间无明显变化（P〉0．05）；pVAC-GRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组，死亡小鼠的平均存活时间延长（与空白对照组比较P〈0．05）。结论构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中和小鼠体内细胞中轰基．为弓形出癌苗的进一步研究打下基础．     

弓形虫表面抗原SAG2基因片段的克隆与原核表达

目的　扩增弓形虫主要表面抗原 (SAG2 )编码基因片段并进行重组表达。方法　设计合成 1对引物 ,从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列 ,以低熔点琼脂糖回收纯化 ,并以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切、纯化后 ,再插入表达载体 pGEX - 4T - 2 ,经PCR和双酶切筛选 ,测序验证后 ,在大肠杆菌中进行表达 ,并用SDS -PAGE和Westernblot鉴定。结果　从弓形虫核酸提取物中扩增出约 477bp的SAG2基因 ,构建成功了重组质粒 pGEX - 4T - 2 -SAG2 ;SAG2基因在大肠杆菌中得到高效表达。SDS -PAGE电泳 pGEX - 4T - 2 -SAG2的融合蛋白条带的分子量约为 42kD ,Westen -blot显示融合蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。结论　GST融合表达载体的构建和SAG2基因片段成功表达 ,为进一步为SAG2重组疫苗及重组诊断抗原的研制奠定了基础。