次乌头碱对心肌细胞钠通道SCN5A及钠钙交换蛋白 mRNA表达的影响

目的 观察次乌头碱(HA)对原代培养乳大鼠心肌细胞钠(Na)通道SCN5A亚基、钠钙交换蛋白(NCX)mRNA表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用RT-PCR法测定Na通道SCN5A及NCX mRNA表达.结果 HA作用15 min时,60和120 μmol/L HA均能增加心肌细胞膜Na通道SCN5A及NCX 的mRNA表达量(P<0.05);动态观察HA对心肌细胞上述基因表达的影响,60 μmol/L HA对心肌细胞作用15及60 min可引发Na通道SCN5A及NCX mRNA的表达量增多(P<0.05).结论 次乌头碱(≥60 μmol/L)可通过增加心肌细胞膜Na通道SCN5A、NCX mRNA表达,激活L-Ca通道,参与细胞内钙超载及心律失常的发生过程,在乌头碱类天然药物中毒时干预上述靶点基因改变可缓解中毒性心律失常的发生.     

次乌头碱对心肌细胞Ca2+调控蛋白mRNA表达的影响

目的 考察次乌头碱(HA)对原代培养乳大鼠心肌细胞L-钙通道、钙调蛋白(CaM)、肌质网雷诺定受体(RyR2)mRNA表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用RT-PCR法测定L-钙通道α1C亚基、CaM及RyR2 mRNA的表达.结果 HA作用15 min时,60、120 μΜ/L能提高心肌细胞膜L-钙α1C ...     

钠钙交换体与心脏疾病的研究进展

钠钙交换体（Na＋/Ca2＋exchanger,NCX）在哺乳动物心肌组织中高度表达,参与胞内钙的调节,在维持心脏正常功能活动中起重要作用。本文就心肌组织钠钙交换体及与心脏疾病的研究进展作一综述。 1钠钙交换体的生物学特性 钠钙交换体是多种细胞的阳离子转运蛋白,在维持细胞钙稳态起到非常重要的作用。1968年Reuter 和Seitz首次在心肌细胞发现了钠钙交换现象。随后,Philipson等人首次从狗的心肌组织中分离出由938个氨基酸组成的NCX蛋白,具有9个跨膜螺旋,其分子量为110 KDa。NCX不仅存在于心肌细胞、神经细胞和平滑肌细胞,还分布在细菌、酵母等微生物细胞。 NCX包括3个亚型：NCX 1、NCX 2和NCX 3,其中NCX 1主要在心脏表达和分布,也是研究最多的一种钠钙交换体[1]。NCX 1亚型含有多种剪接变体,由互相排斥的外显子A或B,以及小的盒式外显子C-F共同组成,其中ACDEF组成最长的剪接变体构成心脏的NCX 1亚型[2]。基于跨膜结构域中含有2个保守的α-重复序列,     

表达心脏SCN5A基因的人胚肾细胞钠电流特性及其对钠通道阻滞剂的反应性

目的 利用人胚肾293细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并研究其钠电流特性和对钠通道阻滞剂的反应性.方法 野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于人胚肾293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录给药(氟卡尼与利多卡因)前后的钠电流.结果 SCN5A基因转染效率约为60%;测试电压为-40 mV时记录到钠电流峰值大小约为-8 nA;100 μmol/L的氟卡尼轻度抑制钠电流,使钠电流峰值减少(21.1±4.6)%[(-435.8±30.5) pA/pF vs.(-343.9±27.1) pA/pF,P＜0.01];氟卡尼使钠通道激活曲线和失活曲线均呈负向移动,改变的幅值分别是-6.08 mV[(-51.88±1.20) mV vs.(-57.96±0.79) mV,P＜0.05]和-9.08 mV[(-94.12±0.13) mV vs.(-103.20±0.11) mV,P＜0.05];1 Hz和10 Hz频率刺激时,氟卡尼使钠电流分别减少(64.5±10.7)%和(83.5±12.2)%(P＜0.01);30 μmol/L利多卡因使钠通道失活后快恢复时间常数和慢恢复时间常数分别延长2倍和3倍.结论 表达心脏钠通道SCN5A基因的人胚肾293细胞模型可用于基因特异性的钠通道阻滞剂安全性与药效学筛查.     

Brugada综合征SCN5A基因G1712C突变的功能分析

目的 探讨Brugada综合征SCN5A基因G1712C新突变的电生理机制.方法 采用体外定点诱变法构建携带有基因突变G1712C的pRc/CMV-hH1的表达载体,lipo3000脂质转染法建立稳定表达pGFP-IRES-hβ1质粒的HEK293细胞系,并用G418进行筛选鉴定.分别做野生型的pRe/CMV-hHl (hHl)和携带有基因突变G1712C的pRc/CMV-hHl (mhHl)瞬时转染表达.进行全细胞膜片钳实验记录钠通道电流.实验结果由PatchMaster以及IGOR Pro 6.0软件分析.结果 G1712C位于Na+通道蛋白α亚单位的DⅣ区S5与S6之间的P-loop上.在瞬时转染野生型的hH1的细胞系中,指令电位从-60 mV逐渐上升时,钠电流也渐变大,在-20 mV时完全激活;激活电压在-60 mV到-50 mV,反转电位在50 mV左右.在瞬时转染突变型G1712C的细胞系中,没有发现钠电流.结论 野生型hH1所表达的钠通道蛋白与正常心肌细胞钠通道电生理特性相似.SCN5A基因G1712C突变导致Nav1.5通道失去功能,可能是该家系Brugada综合征的病因.     

大鼠在体心肌缺血再灌注损伤组织间液钙离子动态与胞膜钠钙交换体表达

目的检测大鼠心肌在体缺血再灌注损伤(IR)组织间液钙离子浓度,比较IR前后心肌胞膜钠钙交换体(NCX)mRNA表达水平,探讨其对钙超载的意义。方法 12只SD大鼠随机分为IR组和对照组,以微透析技术连续收集心肌组织间液标本,原子吸收光谱法检测钙离子浓度。IR组通过结扎(20min)后松解(60min)冠状动脉前降支造成心肌缺血再灌注,结束时收取左心室缺血区和右心室心肌行NCX mRNA定量PCR检测,实验前后采血检测血钙和肌钙蛋白T(cTnT)。对照组免除结扎、松解前降支,其余操作与IR组一致。结果 IR组血浆cTnT浓度显著升高[对照组vs IR组,ng/mL:(1.62±0.60)vs.(4.29±2.22),P=0.031]。IR组心肌组织间液钙离子浓度在缺血期无明显变化,再灌注20min显著下降,心肌析出液钙离子浓度与对照组存在显著性差异[对照组vs.IR组,ng/mL:(224±31)vs.(136±39),P=0.002]。血浆Ca2+浓度实验前后无显著差异。心肌细胞膜NCX mRNA表达水平在组间和组内均无显著差异。结论大鼠在体心肌缺血20min再灌注60min,组织间液钙离子浓度在缺血期无明显变化,再灌注期迅速下降,这种变化趋势与胞膜NCX表达无关。     

钠通道重叠综合征相关基因SCN5A在H9C2细胞中的表达

目的构建表型重叠家系相关基因SCN5A del QKP1507-1509突变型真核表达载体,研究其在H9C2细胞中的表达。方法一步法定点诱变技术构建SCN5A基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体,电穿孔方法将野生型和突变型质粒转染至H9C2细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)及Western blot技术检测其mRNA及蛋白表达情况。结果琼脂糖凝胶电泳法及DNA直接测序法均表明定点突变成功,RFQ-PCR及Western blot结果显示,野生组、突变组和混合组SCN5A基因mRNA相对表达量分别为1.089±0.459、1.011±0.840和1.069±0.492,3组SCN5A基因mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。野生组、突变组和混合组SCN5A蛋白在H9C2细胞的相对表达量分别为3.781±0.221、3.466±0.176和3.714±0.198,3组SCN5A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建钠通道基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体并转染至H9C2细胞,该突变未引起钠通道在细胞膜的异常表达,为进一步功能研究提供了研究基础及方向。     

肝纤维化大鼠肝组织Na+/Ca2+泵mRNA表达

目的: 了解肝纤维化大鼠肝组织Na /Ca2 泵(Na /Ca2 exchanger,NCX) mRNA表达状况,探讨其与肝纤维化程度的关系及意义.方法: CCl4 sc法诱导大鼠肝纤维化,观察肝组织NCX及α1(Ⅰ) mRNA表达水平,检测血清HA,CⅣ,PCⅢ,血清肝纤维化相关酶 (β-NAG,MAO,ALD)、肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量及肝组织病理学变化,分析其相关性与临床意义.结果: 20只正常大鼠肝组织NCX mRNA表达除1只弱阳性外,其余均为阴性,半定量积分仅为(0.10±0.00);而30只模型组大鼠全部呈阳性,半定量积分显著增加(P<0.05).与正常组比较,模型组大鼠血清HA[(455.79±113.55) vs (112.41±45.62) μg/L],CⅣ,[(159.62±29.64) vs (35.69±9.68) μg/L],PCⅢ [(265.54±98.21) vs (89.99±10.85) μg/L]明显增高(均为P<0.01);β-NAG,MAO,ALD活性显著增加(分别增加2.20,2.14,1.57倍,P<0.01),模型组大鼠NCX mRNA表达与α1(Ⅰ) mRNA表达水平、肝组织Hyp含量、血清HA,CⅣ,PCⅢ水平、肝组织纤维化积分均呈正相关,相关系数r分别为 0.48, 0.64, 0.52, 0.49, 0.56, 0.60(均为P<0.05).结论: 肝纤维化大鼠肝组织NCX mRNA表达明显增强,与胶原代谢水平及肝脏组织病理学变化呈正相关,有望作为判断肝纤维化的有用指标,值得进一步研究.     

益气活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌NCX与SERCA2a mRNA及蛋白表达水平的影响

目的 观察益气活血方（由丹参、黄芪、香加皮等组成）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌钠钙交换蛋白（Sodium-calcium exchanger,NCX）与肌浆网钙泵-2a（SR calcium ATPase-2a,SERCA2a）mRNA及蛋白表达水平的影响,初步探讨益气活血方改善慢性心衰大鼠心功能的作用机制。方法 采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法制备急性心肌梗死后慢性心力衰竭模型。实验分6组：假手术组,模型组,卡托普利组,益气活血方高、中、低3个剂量组,连续ig给药4周后取材,检测心肌组织NCX与SERCA2a mRNA及蛋白表达。结果 各给药组均可不同程度的下调NCX mRNA的表达,上调SERCA2a mRNA的表达,其中益气活血方高、低剂量组以及卡托普利组与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）;各给药组均能降低NCX/SERCA2a mRNA的比值,与模型组比较差异显著（P＜0.05）。各给药组均有下调NCX蛋白、上调SERCA蛋白表达的趋势,但与模型组相比无显著差异（P＞0.05）。结论 益气活血方能够降低CHF大鼠NCX mRNA的表达,升高SERCA mRNA的表达,降低NCX/SERCA mRNA的比值,调节心肌细胞内钙循环,从而改善心肌的舒缩功能,其可能为益气活血方改善心脏功能、抗心力衰竭的机制之一。     

哇巴因和乌头碱对豚鼠和大鼠心肌细胞钠电流的作用

目的 观察哇巴因和乌头碱对豚鼠和大鼠心肌细胞钠电流的作用,探讨二药诱发心律失常的机制.方法 用全细胞膜片钳技术分别记录豚鼠和大鼠单个心肌细胞钠电流.结果 在-40mV电压下,哇巴因5μmol/L使Ina从(-48.3±8.9)pA/pF减少到(-22.6±5.6)pA/pF(抑制60.1%,n=5,P＜0.01);乌头碱1μmol/L使Ina从(-21.8±5.8)pA/pF增加到(-67.3±7.8)pA/pF(增加208.7%,n=4,P＜0.01).结论 哇巴因抑制豚鼠心肌细胞钠电流而乌头碱增加大鼠心肌细胞钠电流.不论是抑制还是促进钠电流,二药均使离子通道失衡,这是其诱发心律失常的重要机制.     

心源性猝死者窦房结组织SCN5A和ANK2表达及其法医学意义

目的探讨心源性猝死者窦房结组织SCN5A和ANK2表达及其法医学意义。方法收集尸检心脏标本26例,其中心源性猝死者12例（猝死组）,排除心脏原因相关的异常死亡者14例（对照组）。应用免疫组化方法检测两组标本窦房结组织中SCN5A和ANK2编码的心肌钠离子通道（Nav1.5通道）和锚定蛋白B（ankyrin-B）的表达。结果猝死组窦房结组织中Nav1.5通道和ankyrin-B的表达均较对照组显著下降,差异有统计学意义（Z=-2.166、-2.505,P〈0.05）,但在猝死组中两者的表达无明显相关关系（r=-0.337,P〉0.05）。结论窦房结组织SCN5A和ANK2表达的改变与心源性猝死的发生相关。     

细辛含药血清对大鼠心肌细胞钠通道的影响

目的：研究中药细辛含药血清对大鼠心肌细胞钠通道的影响,从离子通道水平揭示细辛抗缓慢型心律失常作用的可能机制。方法：用原代培养方法获得单个心肌细胞,用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞加入含药血清前后钠通道电流的变化。结果：25%细辛含药血清对钠通道的激活曲线、I-V曲线均有影响。结论：细辛含药血清对心肌细胞钠通道电流有增强作用。     

麻黄附子细辛汤中有效成分治疗缓慢性心律失常机制研究进展

麻黄附子细辛汤是中医治疗缓慢性心律失常的常用方剂,其作用机制有多种观点,众多研究认为这种抗心律失常药理作用是通过调节心肌细胞膜各离子通道完成的。目前研究表明麻黄主要有效成分麻黄碱可分别通过KCNQ1/KCNE1通道和cAMP/PKA途径刺激钾、钙通道激活;附子主要有效成分乌头碱及去甲乌头碱均可通过调节心肌细胞膜钠、钾、钙电流而影响心肌兴奋性和传导性;而细辛的有效成分β-细辛醚则可通过阻滞钙通道而扩张冠脉,并可激活心肌细胞膜钠通道而发挥强心作用。该文将针对这三种药物作用于心肌细胞膜离子通道调节机制、临床研究的不足等问题做一总结。     

遗传性心律失常治疗新视野

Brugada综合征Brugada综合征主要表现为右束支传导阻滞与右胸导联ST段抬高,常发生室性心动过速（VT）或心室颤动而导致晕厥与猝死.其心电图无QT延长,与尖端扭转性室速（TdP）发作前长-短序列不同,很少发作前有此现象.其与儿茶酚胺依赖性多形性VT不同,发作前无心率加速现象.2相折返被认为是Brugada综合征发生室性心律失常的机制.Brugada综合征发病主要与SCN5A突变有关.此外,还有钠通道β-亚基突变（SCN1B和SCN3B）,钾通道KCNE3突变,L-型钙通道的α-亚基和β-亚基（CACNA1C和CACNB2B）突变.另外,GPD1L突变产生异常转运蛋白,可抑制细胞膜上钠离子通道的正常表达.     

吡格列酮保护乳鼠心肌细胞与ATP敏感性钾通道表达的关系

目的探讨吡格列酮对缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡和心肌细胞ATP敏感性钾通道亚单位表达的影响。方法原代培养的sD乳鼠心肌细胞随机分为6组：溶媒组、缺氧复氧组、0．1μmol／L吡格列酮组、1．0μmol／L吡格列酮组、2．0μmol／L吡格列酮组、2．0μmol／L吡格列酮＋GW9662组（GW9662组）,药物预处理24h后建立缺氧复氧模型,利用膜联蛋白-v与溴化丙啶双染法检测心肌细胞凋亡,利用RT—PCR及Western—blot技术检测心肌细胞ATP敏感性钾通道亚单位的表达。结果0．1、1．0、2．0μmol／L吡格列酮组心肌细胞凋亡率与缺氧复氧组及GW9662组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;0．1、1．0、2．0μmol／L吡格列酮组心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）亚单位Kir6．1mRNA及蛋白的表达与缺氧复氧组及GW9662组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,各组细胞膜ATP敏感性钾通道（sarcKATP）亚单位Kir6．2mRNA表达间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论吡格列酮抑制缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,此保护作用可能与激活PPARγ及上调mitoKATP通道亚单位表达有关,sarcKATP未参与这种保护过程。     

高糖对培养乳鼠心肌细胞L型钙通道表达的影响

目的观察高糖对培养乳鼠心肌胞L型钙通道mRNA表达的影响.方法分别用正常糖培养液(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)和高糖培养液(葡萄糖浓度为25.5mmol/L)培养乳鼠心肌细胞,用RT-PCR方法检测心肌细胞mRNA水平的变化.结果与正常糖组相比,高糖组心肌细胞L型钙通道mRNA表达明显增加(P<0.05).结论单纯高糖培养可明显促进心肌细胞L型钙通道mRNA表达.     

乌头碱中毒及双黄连干预对心肌雷诺定受体表达的影响

目的：研究乌头碱中毒及双黄连注射液干预对心肌雷诺定受体(rynanodine receptor 2,RyR2)表达的影响,探讨双黄连对抗乌头碱致心律失常毒性的作用机制。方法：将52只SD大鼠随机分成3组：乌头碱组(A组,n=20),双黄连组(B组,n=20)和对照组(C组,n=12)。A,B两组先予乌头碱0.3 mg/kg灌胃,30min后A组予生理盐水腹腔注射,B组予双黄连100mg/kg腹腔注射;对照组两次均予生理盐水处理,连续给药10 d。于第1,3,6,10 天记录大鼠心电图变化并进行心律失常评分,采用免疫荧光染色及实时定量PCR技术检测大鼠心肌组织RyR2蛋白及基因的表达变化。结果：各时间点B组的心律失常评分均较A组低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);第1天A组心肌RyR2蛋白及RyR2 mRNA表达即较B,C两组增加,但差异无统计学意义(P>0.05);第3,6,10天A组RyR2蛋白及RyR2 mRNA表达较B,C两组均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：双黄连可有效治疗乌头碱中毒引起的心律失常,其机制可能与降低乌头碱引起的RyR2异常高表达有关。     

大鼠胚胎期心脏Na+通道基因SCN5A的表达

目的 研究大鼠胚胎发育过程中,编码心肌组织电压门控Na 通道α亚单位SCN5A基因mRNA的表达和蛋白定位.方法 大鼠胚胎期分7个时间点(E12.5-P1),提取心脏总RNA,RT-PCR和免疫组化方法分别检测SCN5A基因mRNA表达和蛋白定位.结果 大鼠胚胎发育期SCN5A基因mRNA表达呈动态模式,E12.5d(0.425±0.012)表达最少,E13.5d(0.532±0.012)和E14.5d(0.665±0.119)相对增加,E15.5d达到高峰(1.08±0.01),E17.5d(0.870±0.035)与E19.5d(0.855±0.057)相比略有降低,无显著性差别,提示胚胎发育后期表达量趋于平衡.出生后一天(P1)表达量(0.751±0.041)较胚胎期表达显著降低.除E17.5d与E19.5d比较无统计学意义外(P＞0.05),其余组间比较均有统计学意义(P＜0.001).免疫组化结果显示,SCN5A蛋白表达高峰及在左、右心室肌及室间隔中表达持续时间各不相同,胚胎早期SCN5A蛋白在不同心腔表达相对均匀,后期在心外膜和心室左、右束支位置表达增强.结论 SCN5A基因与大鼠胚胎心脏传导系统发生及其功能相关,Na 电流是形成胚胎发育中期心肌动作电位的主要成分.     

冠心康对大鼠缺血心肌细胞ATP敏感钾通道亚基Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B表达的影响

目的：通过观察中药复方冠心康对大鼠缺血心肌细胞ATP敏感钾（ATP-sensitive potassium,K_（ATP））通道亚基的影响,探讨冠心康保护心血管、抗心肌缺血的可能作用机制。方法：48只SPF级Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、格列本脲组、吡那地尔组、冠心康组、冠心康加格列本脲组。采用酶解法分离大鼠心室肌细胞,用无钙台式液灌流10 min、停灌30 min、再灌注45 min模拟心肌缺血再灌注损伤。将药物直接加入细胞液中（格列本脲10μmol/L、吡那地尔50μmol/L、冠心康注射液1 ml/L）充分作用后,4℃放置24 h。采用实时荧光定量多聚酶链式反应法及蛋白质印迹法检测各组心肌细胞K_（ATP）亚基Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B的mRNA表达及蛋白含量。结果：正常大鼠心肌细胞可见SUR2A、Kir6.1和Kir6.2蛋白及mRNA的表达,而SUR2B蛋白几乎不表达。模型组K_（ATP）各个亚基蛋白及mRNA的表达均较正常组有一定程度的增加。与模型组比较,吡那地尔可显著增加K_（ATP）各亚基mRNA及蛋白的表达,格列本脲可阻断这一作用;冠心康可明显增加K_（ATP）通道各亚基mRNA及蛋白的表达。结论：复方冠心康具有明显的促进K_（ATP）开放的作用,从而起到心血管保护作用。     

右美托咪定预处理对大鼠缺血再灌注心律失常的影响及机制研究

目的观察右美托咪定预处理对大鼠缺血再灌注心律失常的影响及机制。方法 2015年3-6月于武汉大学基础医学院选择30只雄性SD大鼠,随机分为假手术组(SO组)、缺血再灌注组(I/R组)、右美托咪定预处理组(DEX组)各10只。I/R组、DEX大鼠先结扎冠状动脉30 min引起心肌缺血,再松开结扎线给予心肌再灌注120min。SO组只带线不结扎,DEX组在缺血前2 h给予右美托咪定100μg/kg腹腔注射,I/R组给予等体积生理盐水。监测记录各组缺血再灌注心律失常的发生情况,以实时定量PCR法检测心肌组织L型钙通道(Cav1.2)、钠钙交换体(NCX)mRNA的水平。结果 SO组心律无明显变化,心律失常评分为0分。DEX组心律失常发生率低于I/R组,缺血30 min和再灌注120 min心律失常评分均低于I/R组(4.5±0.6 vs.2.1±0.4,3.7±0.5 vs.1.1±0.3,P均<0.05)。与SO组比较,I/R组、DEX组心肌组织Cav1.2和NCX的mRNA水平均升高,而DEX组较I/R组明显降低(P均<0.05)。结论右美托咪定预处理可减少缺血再灌注心律失常发生,与减少Cav1.2和NCX的mRNA水平,抑制钙超载有关。