单克隆抗体鉴定鼠伤寒沙门氏菌的实验研究

本文应用沙门氏菌单克隆抗体建立了ELISA检测鼠伤寒沙门氏菌(STM)的方法,并与协同凝集方法对临床分离的162株STM进行对比鉴定研究,结果表明ELISA其方法灵敏高度,可检出5×10~2菌/ml,特异性强,且结果准确客观,对鼠伤寒沙门氏菌0-4抗原的检出率为100％,抗原H-i的检出率为96.3％,同时结果表明所用沙门氏菌McAb特异性和敏感性都达到了目前所用的沙门氏菌诊断因子血清的标准,具有推广应用的前景。     

伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)与树突状细胞在免疫反应中关系的研究

研究伤寒沙门菌质粒pRST98在沙门菌致病中的作用机制。将伤寒沙门菌质粒pRST98导入鼠伤寒沙门菌低毒株RIA形成接合子pRST98/RIA,经腹腔感染小鼠,检测脾脏DC的数量及其表面分子CD80和CD86的表达,比较细菌刺激DC成熟的能力;将接合子的热灭活抗原与其致敏的DC共培养,检测IFN-γ和IL-10水平,评价spv活化DC分泌细胞因子的能力;将接合子致敏的DC分别与初始型CD4+和CD8+T细胞进行混合淋巴细胞反应,检测DC刺激初始型T细胞活化增殖的能力。实验结果表明,pRST98/RIA接合子感染组小鼠脾脏DC的数量及其表面分子的表达均高于对照组(P<0.05),DC分泌的细胞因子水平与对照组无显著性差异(P>0.05),但其刺激初始型T细胞增殖的能力则明显增强(P<0.05)。说明携带pRST98质粒的沙门菌感染能增强DC介导的特异性免疫应答。     

白细胞介素10与沙门菌接合性质粒介导细菌生物膜的形成

背景：既往研究发现接合性质粒pRST98可促进其宿主菌生物膜的形成,携带pRST98的菌株感染细胞和实验动物后,可促进白细胞介素10的分泌和表达。 目的：体外研究不同质量浓度白细胞介素10与接合性质粒pRST98对鼠伤寒沙门菌生物膜形成的相互影响。 方法：体外建立鼠伤寒沙门菌标准株χ3306、突变株χ3337及接合株χ3337/pRST98 3组生物膜模型,3组分别加入0(空白对照),1,10,100 µg/L白细胞介素10,通过结晶紫染色半定量法、共聚焦激光扫描显微镜分析和扫描电镜观察,比较不同质量浓度白细胞介素10对携带和不携带接合性质粒pRST98的鼠伤寒沙门菌生物膜形成的影响。 结果与结论：①3组组内比较：与空白对照组比较,1,10 µg/L白细胞介素10均能促进鼠伤寒沙门菌的聚集,提高生物膜形成能力,且10 µg/L质量浓度效果更明显;100 µg/L白细胞介素10抑制鼠伤寒沙门菌生物膜的形成。②3组组间比较：在同一白细胞介素10质量浓度下,接合株χ3337/pRST98组A570高于标准株χ3306组、突变株χ3337组。结果说明1,10 µg/L白细胞介素10可促进生物膜的形成,且在携带接合性质粒pRST98的情况下促进作用更明显。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

淋球菌重组与减毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗口服免疫的初步研究

在克隆淋球菌膜抗原CppB基因并在大肠杆菌和减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得高效表达的基础上,用表达CppB-LacZ融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌口服免疫Balb/c小鼠。ELISA检测表明被免疫小鼠血清中特异性抗体滴度可达1:160,并诱发了DTH反应,说明产生了特异的免疫反应。重组菌可在肠道中较持久地寄生,对小鼠未见有明显的毒副反应。     

利用IVIAT技术初步筛选伤寒沙门菌的体内诱导基因

目的 利用体内诱生抗原筛选技术初步筛选伤寒沙门菌的体内诱导基因.方法 首先将3个伤寒病人恢复期的血清等体积混合,用体外培养的伤寒沙门菌全菌体、超声裂解产物及加热变性裂解产物充分吸收处理.然后采用pET-30a/b/c表达载体系统构建伤寒沙门菌Ty2菌株的基因组表达文库,并以吸收后的血清为探针,筛选伤寒沙门菌基因组表达文库.结果 从5 000个克隆中获得5个阳性克隆,对阳性克隆测序和序列检索分析表明,涉及 6 个开放阅读框.结论 本实验利用IVIAT筛选体内诱导基因的各个程序是正确的,并初步筛选到伤寒沙门菌的体内诱导基因.     

抗福氏痢疾杆菌单克隆抗体的制备及其特性研究

本文用福氏痢疾杆菌4a、4b煮沸致死菌体免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞在PEG介导下与Sp2/0细胞融合,经筛选、克隆化获得3株抗福氏痢疾杆菌McAb的杂交瘤细胞系。经连续传代6个月、液氮冷存6个月后,复苏仍能稳定分泌高效价的McAb。经鉴定,3株代号为401、420、421的McAb的Ig类型为IgG2b、IgG3和IgG3,轻链为λ、κ、κ;染色体数目为101～105条。交叉试验表明,3株McAb与志贺氏、宋内氏、鲍氏菌及常见肠道菌如大肠杆菌,变形杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、克雷伯氏菌、小肠结肠耶氏菌等及革兰氏阳性杆菌等均不发生交叉反应。McAb的表位分析表明,McAb真正识别的表位在福氏菌脂多糖的特异性多糖即O-侧链上,从而进一步证实了McAb的特异性。     

携带pcDNA3s与EGFPC3质粒的重组减毒沙门氏菌的免疫性与EGFP的表达

目的研究HBsAg DNA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的免疫性与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因EGFPC3在小鼠体内的表达。方法将质粒pcDNA3s与pEGFPC3分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3与SL8786/pcDNA3s。利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体的含量,以及重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用荧光显微镜观察EGFPC3表达。结果口服SL8786/p cDNA3s免疫小鼠后,可诱导产生较强的特异性CTL应答。口服免疫小鼠后第11周抗-HBs含量最高。用流式细胞术检测贴壁培养的2只小鼠的脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20%和17.36%,而SL8786/pcDNA3口服的2只小鼠脾细胞中的EGFP阳性率分别仅为1.95%和1.63%。给小鼠口服SL8786/EGFPC33周后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠及肌肉等组织中,均有EGFPC3的表达。结论口服SL8786/pcDNA3s在小鼠体内诱导了特异性细胞和体液免疫应答。携带EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3在小鼠的部分组织中产生绿色荧光表达,该重组菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体基因工程疫苗的研制提供了一个优良模型。     

武汉社区腹泻病人粪便中致病菌的构成与耐药性研究

目的了解夏秋季武汉社区引起腹泻病原菌的流行性及耐药状况。方法收集2004年7月1日至10月31日武汉社区4所大型医院4536份门诊腹泻病人粪便标本进行鉴定及药敏试验;REP-PCR对主要致病菌进行基因分型。结果4536份粪便标本中,分离出非伤寒沙门菌64株（1.4%）,志贺菌29株（0.6%）,致病性大肠杆菌33株（0.7%）。其中主要致病菌是鼠伤寒沙门菌33株（52%）,D群志贺菌16株（55%）。挑选13种抗菌药物进行体外敏感试验,并将分离的致病菌对这13种抗生素的耐药率﹑敏感率﹑中介率进行比较,其中非伤寒沙门菌对喹诺酮类的耐药率较其他两种要高,但对第三代头孢的敏感性较强。分离的3种致病菌在第三代头孢抗生素的作用中对头孢他啶的敏感性最强。32株鼠伤寒沙门菌基因分型为9种,16株D群志贺菌基因分型为7种。结论武汉社区内感染性腹泻的致病菌主要以非伤寒沙门菌﹑致病性大肠杆菌和志贺菌为主,其中非伤寒沙门菌占了51%,基因分型提示有社区流行趋势,而且这些致病菌对肠道杆菌常用抗生素的耐药性较为严重。本次调查结果对该社区临床用药起到一定的提示作用。     

33例儿童非伤寒沙门菌肠炎临床分析及耐药监测

目的:探讨儿童非伤寒沙门菌肠炎临床特征、血清型及耐药性。方法:对我院2012年11月至2015年11月经粪便培养确诊为非伤寒沙门菌肠炎的33例患儿进行回顾性分析,探讨其临床特征、血清分型、耐药性等。结果:本组病例发病以婴幼儿多见,发病季节多集中在5-10月,所有患儿均有腹泻,且大部分以腹泻起病,其中28例患者伴发热,血清型以肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌为主(39.39%;36.36%)。美洛培南、亚胺培南几乎无耐药发生,肠炎沙门菌及鼠伤寒沙门菌对三代头孢菌素产生不同程度耐药(分别为7.69%和16.67%)。部分感染患儿经头孢噻肟(13例),头孢曲松(11例)治疗效果良好。9例难治性患儿升级抗生素或联合用药治疗后疗效尚满意。结论:粪便培养是确诊非伤寒沙门菌性肠炎的重要方法,结合药敏试验选择敏感抗生素治疗,可取得良好效果。     

恶性疟原虫113肽抗原基因重组的减毒鼠伤寒沙门菌在家兔中免疫应答的研究

我们已经在减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１以融合蛋白的形式表达了人工合成的恶性疟原虫杂合１１３肽基因ＡＢ（ＧＺ－ＡＢ）。活菌以２×１０９ＣＦＵ经口服免疫新西兰家兔，用ＥＬＩＳＡ测定抗体水平，结果于首次免疫或加强免疫后都可检测到一定水平的特异性抗体。所免疫的家免可以诱发针对恶性疟原虫抗原及ＧＺ－ＡＢ的迟发性超敏反应（ＤＴＨ）。我们的研究表明，含有多个恶性疟原虫抗原表位的人工合成基因可以在减毒鼠伤寒沙门菌中表达，活菌可诱发家兔产生特异的体液免疫及细胞免疫，为恶性疟口服活菌苗的制备打下基础。     

广东省腹泻病例非伤寒沙门菌耐药谱和PFGE分型研究

目的 了解广东省腹泻病例非伤寒沙门菌的耐药状况,并对多重耐药菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型研究.方法 利用血清学方法对2009-2011年广东省腹泻病例分离的非伤寒沙门菌进行分型,并用CLSI( Clinical and Laboratory Standards Institute)推荐的纸片法对分离的沙门菌株进行抗生素敏感性检测,采用PFGE进行分型研究.结果 91.76％ (256/279)的鼠伤寒沙门菌对3种及以上抗生素耐药,40株鼠伤寒沙门菌同时对9种及以上抗生素耐药,其中有3株对全部12种抗生素耐药.96.91％ (94/97)的I4,5,12:i:-沙门菌对3种及以上抗生素耐药,9株14,5,12:i:-沙门菌同时对9种及以上抗生素耐药,其中有1株对全部12种抗生素耐药.47％(47/100)的肠炎沙门菌对3种及以上抗生素耐药,其中1株对9种及以土抗生素耐药.环内沙星的耐药率为4.27％( 27/632),其中,17株为鼠伤寒沙门菌,6株为14,5,12:i:-沙门菌.31.96％( 202/632)的沙门菌对环丙沙星显示为中介敏感性.这些多重耐药的菌株和具有相同耐药谱的菌株PFGE指纹图谱不完全一致,PFGE型别存在明显的遗传多样性.结论 广东省非伤寒沙门菌多重耐药现象严重.多重耐药菌株的PFGE型别多样,存在明显的遗传多样性.继续加强耐药监测和控制抗生素的合理使用刻不容缓.     

重组沙门菌表达结核分枝杆菌ESAT-6及其特异性免疫应答分析

目的 分析重组沙门菌表达的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌性蛋白ESAT-6诱导的特异性免疫应答.方法 将ESAT-6蛋白编码基因导入原核表达载体pYA3333中,构建重组质粒pYA33-esat.通过电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,获得重组菌X4550(33-esat).以每只105CFU剂量的重组菌滴鼻免疫C57BL/6小鼠,间隔18 d,在第2次免疫后10 d取免疫小鼠脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)及派伊尔淋巴集结(Peyer's patch,PP)细胞,以ESAT-6多肽作为刺激原,检测特异性的IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞.同时,运用CFSE方法榆测了体内抗原特异性CTL效应.结果 经沙门菌表达并运送的Mtb抗原ESAT-6能诱导特异性的免疫应答.在肺脏及PP细胞巾,检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,免疫应答以Th1型为主.而在脾脏和MLN中,免疫应答呈现Th1/Th2混合应答.此外,体内CTL试验表明,重组菌能够诱导抗原特异的CTL效应,且特异性杀伤率为69.9%.结论 以滴鼻方式接种重组沙门菌,不仅能够诱导ESAT-6蛋白特异性的细胞免疫应答,还能激发特异的CTL效应,为结核病的防控提供了新的认识.     

杭州地区伤寒及甲型副伤寒沙门菌流行菌株分子特征的研究

目的 了解并确定2002-2008年杭州地区伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌优势菌株的分子特征.方法 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点串联重复序列分析(MLVA)或多位点序列分型(MLST)对2002-2008年杭州地区分离的31株伤寒沙门菌、404株甲型副伤寒沙门菌进行分型并分析.结果 404株甲型副伤寒沙门菌可分为6个PFGE型,P1型和P2型属于同一个克隆系,99.0％ (400/404)菌株属于该克隆系,其中P1型菌株占该克隆系菌株的93.3％ (373/400).31株伤寒沙门菌株存在高度多样性,可分为14个PFGE型、28个MLVA型(分辨率90.3％)、3个MIST型.根据MLVA各型靶位点多态性差异,本地区流行的伤寒沙门菌株与东南亚地区菌株相近,但与欧洲菌株差距较大,呈高度多态性的可变串联重复序列(VNTR)位点TR1、TR2、Sal02可作为本地区伤寒沙门菌株的检测标志.伤寒沙门菌株MLST型别包括了目前国际上发现的所有3个型别,但以ST2型为主(23/31,74.2％).结论 近年杭州地区甲型副伤寒疫情由同一亚系菌株感染所致,但本地区流行的伤寒沙门菌株呈现高度多样性.     

鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株的构建及生物学特性

目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的sip B缺失株。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipB构建成功。进一步生物学特性研究表明,缺失株SL1344ΔsipB保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失585 bp的sipB基因,生长速度没有发生明显改变;但是,与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变,缺失株SL1344ΔsipB口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为1.70×108CFU,毒力较亲本株SL1344降低至1.4%,免疫保护效力实验显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。在给小鼠免疫后第14天血清抗体IgG达到最高。结论:结果表明,SL1344ΔsipB基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与其致病力之间的关系提供了方法,并为研制安全有效的沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。     

从免疫学角度制定鼠伤寒沙门氏菌病的防治对策

鼠伤寒沙门氏菌病,是由鼠伤寒杆菌引起的一种传染病(以下简称鼠伤寒)。自1892年Leeffler发现该菌,至今已有近百年的历史。在国外,特别是在广泛使用抗生素的发达国家,于1958年首次出现了由鼠伤寒耐药菌株引起的在医院内流行。与我国现在的情况,大致相同。此菌易产生耐药性,观察表明,流行初起时的有效药物,在流行中、后期则疗效不佳;部分菌株第一次与第二次     

伤寒患者外周血中T和B细胞的变化——Ⅲ、伤寒患者外周血中稳定性Es花环形成细胞的动态变化和特异性问题

本文的目的是观察伤寒感染中Es-RFC％的动态变化及其特异性。病人共16例。检测项目包括血液与伤寒抗原共育7天前后观察Et-和Es-RFC％。4份血标本用于检查T细胞形态、存活力和Et与Es-RFC％的动态变动。另7份血液用于观察Es-RFC的特异性。结果如下:(1)伤寒感染中Es-RFC的增多具特异性,(2)在伤寒抗原刺激下Es-RFC升高的出现相当早,病愈后消失也较快,提示ES-RFC的增多与血流中存在高水平特异性抗原有关,和(3)在特异性抗原刺激下ES-RFC数量的增多是致敏淋巴细胞表面E-受体大量形成所致。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 株cya 基因缺失株生物学特性的检测

目的:探索鼠伤寒沙门菌cya(adenylate cyclase,cya)基因的功能及其缺失株减毒的初步机制。方法:对鼠伤寒沙门菌SL1344 株cya 基因缺失株的耐酸碱能力、耐盐性、运动性、生物被膜成分、对上皮细胞黏附、侵袭以及细胞毒性等生物学特性进行检测。结果:cya 缺失株的耐酸碱性、耐盐性以及运动能力较亲本菌株有明显降低;生物被膜成分测定结果显示cya 缺失株不表达纤维素和菌毛;同时与亲本菌株相比cya 缺失株对上皮细胞的黏附和侵袭能力发生了显著的降低,且对细胞毒性的影响弱于亲本菌株。结论:上述结果表明cya 基因功能与细菌的运动能力、细胞膜的渗透能力、生物被膜的形成及毒力密切相关,从而为鼠伤寒沙门菌cya 基因功能及其缺失株减毒机制的进一步研究提供了理论参考,这也必将有助于研发以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗。     

BACT／Alert120血培养联合白细胞计数快速诊断伤寒

目的　为准确和快速诊断伤寒 ,以便尽快获得病原菌和控制伤寒流行 .方法　通过BACT/Alert12 0进行血培养和肠道拭子培养 ,同时用Sysmex -K - 4 5 0 0血细胞分析仪进行白细胞计数 ,并利用伤寒沙门菌某些固有特点项目进行快速诊断 .结果　儿童伤寒组白细胞计数与正常对照儿童组比较无显著差异 (p >0 .0 5 ) ;成人伤寒组白细胞计数低于成人对照组 (p <0 .0 1) ;伤寒患者早期血培养阳性率 88.9% ,而肠道拭子阳性率仅为 5 .3% .结论　成人伤寒白细胞明显下降 ,而儿童则变化不大 ,利用早期第 1周血培养高阳性率和伤寒沙门氏菌诊断特点可以在 2 4～ 4 8小时内快速做出诊断     

伤寒沙门菌DNA旋转酶gyrA及拓扑异构酶Ⅳ parC基因与耐喹诺酮类关系研究

目的 研究DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ在伤寒沙门菌耐喹诺酮类药物的作用.方法 对临床分离喹诺酮类敏感伤寒沙门菌275及其自发耐药变异菌RG1的gyrA、parC基因喹诺酮类耐性决定区进行PCR DNA直接测序分析.结果 表明伤寒沙门菌275 gyrA、parC与大肠埃希菌相应DNA序列分别有92.51%与97.01%同源性,推定氨基酸序列仅有3与6个的差异.伤寒沙门菌gyrA及parC也有较好同源性,相应区段氨基酸有60.92 %相同.伤寒沙门菌RG1与275相比,gyrA第247位T→G变异,致Ser 83 Ala氨基酸替换,两者parC完全相同.喹诺酮类药物对RG1 MIC较对伤寒沙门菌275上升32倍或以上.结论 DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ为喹诺酮类药物作用靶位,但以DNA旋转酶为主,该酶变异为伤寒沙门菌耐药的主要原因.     

实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌的研究

目的 建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具.方法 在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化,实现对嗜肺军团菌的快速检测;用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性.结果 当用热裂解法提取DNA,25μl的反应体系中包括上、下游引物(20μmol/L)各0.6μl,探针(20μmol/L)0.4μl,模板DNA 6.0μl,反应条件为预变95℃20 S,变性95℃10 s,退火50℃ 40 s,40个循环时,TaqMan-MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0.71拷贝/μl,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有极好的对应关系(r=0.999);1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13.23～16.04之间,而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30;整个检测过程仅需1.5 h.结论 TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点,可用于嗜肺军团菌检测.