核酸疫苗Sj31BIN联合IL-12免疫抗日本血吸虫攻击感染的实验研究

目的：在证明日本血吸虫重组蛋白酶B核酸疫苗Sj31BIN具有抗生殖免疫作用的基础上,联合使用IL-12,观察IL-12是否具有佐剂效果。方法：分别用Sj31BIN IL-12和IL-12免疫Balb／C小鼠。攻击感染后6周计数成虫负荷和组织内虫卵数及肝脏表面虫卵结节数。结果：Sj31BIN IL-12免疫小鼠可降低成虫发育率。肝组织减卵率为59．74％;肠组织减卵率为59．60％;肝脏表面虫卵结节减少率为71．30％;单独使用IL-12有一定的免疫保护作用。结果：Sj31BIN IL-12能诱导小鼠产生较强的抗生殖免疫作用。     

核酸疫苗Sj31BIN联合IL-12免疫抗日本血吸虫攻击感染的实验研究

目的 :在证明日本血吸虫重组蛋白酶B核酸疫苗Sj31BIN具有抗生殖免疫作用的基础上 ,联合使用IL 12 ,观察IL 12是否具有佐剂效果。方法 :分别用Sj31BIN +IL 12和IL 12免疫Balb/C小鼠。攻击感染后 6周计数成虫负荷和组织内虫卵数及肝脏表面虫卵结节数。结果 :Sj31BIN +IL 12免疫小鼠可降低成虫发育率。肝组织减卵率为5 9 74% ;肠组织减卵率为 5 9 6 0 % ;肝脏表面虫卵结节减少率为 71 30 % ;单独使用IL 12有一定的免疫保护作用。结论 :Sj31BIN +IL 12能诱导小鼠产生较强的抗生殖免疫作用。     

东方田鼠的实验室饲养及其抗血吸虫感染特性

湖南洞庭湖滩上的东方田鼠,是已知啮齿动物中唯一对日本血吸虫感染有颉抗作用的野生鼠类。本研究对该鼠在实验室内饲养特性进行观察,说明可以用普通饲养仓鼠的方法饲养繁育成功。通过人工感染日本血吸虫尾蚴证明,不论是接触过疫水的野生田鼠,或实验室内繁殖的未接触过疫水的第二代田鼠,均有抗感染现象。     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

血水草生物碱杀灭日本血吸虫尾蚴预防感染的实验研究

目的 探讨血水草生物碱(ECA)实验室及现场杀灭尾蚴、预防日本血吸虫感染的保护性效果。方法 在实验室配置不同浓度的血水草生物碱溶液：玻片法灭蚴、实验室及现场防护动物血吸虫感染的试验。结果 尾蚴接触药物2.5mg/L，60min死亡率为97．71％，5mg/L死亡率为100％。10mg／L-100mg/L尾蚴100％死亡时间由45min缩短至3min。10mg／L组药物浸杀尾蚴后，对小鼠的防护率为100％；5mg／L ECA组的防护率为82．35％—94．53％。现场实验1．25mg/L能完全阻止血吸虫尾蚴感染。结论 血水草生物碱具有杀灭日本血吸虫尾蚴的效果。     

日本血吸虫感染对小鼠1型糖尿病保护作用的研究

目的探讨日本血吸虫感染对1型糖尿病小鼠的保护性作用及其机制。方法 32只雄性BALB/c小鼠随机分为4组：日本血吸虫感染＋糖尿病模型组（A组）、单纯糖尿病模型组（B组）、阴性对照组（C组）和正常对照组（D组）。A组小鼠感染日本血吸虫尾蚴8周后,与B组小鼠同时腹腔注射链脲佐菌素诱导1型糖尿病模型,C组小鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液,观察小鼠体重与血糖变化。4周后剖杀各组小鼠,用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）水平,并观察小鼠胰腺组织病理变化。结果 A组在造模后4周左右,体重明显高于B组（P〈0.01）,血糖明显低于B组（P〈0.01）,血清中IL-4水平明显高于B组（P〈0.01）,血清中IFN-γ水平明显低于B组（P〈0.01）。结论日本血吸虫感染对小鼠1型糖尿病具有一定的保护性作用。其作用机制可能是通过使IL-4升高和IFN-γ下降,调节Th1/Th2免疫偏移,导致Th1反应下调,Th2反应增强。     

旋毛虫与日本血吸虫感染间相互影响的实验研究

用小白鼠定量感染实验观察了旋毛虫与日本血吸虫感染间的相互影响，结果表明，旋毛虫的预先感染明降低日本血吸虫攻击感染的成虫发育率，反之，日本血吸虫的预先感染对旋虫肌肉幼虫产量无明显影响。     

日本血吸虫成虫HO-1编码基因片段的扩增及序列分析

目的 研究日本血吸虫成虫血红素加氧酶-1(HO-1)基因的表达并对部分编码区序列进行测序分析。方法 收集日本血吸虫成虫，提取总RNA；以成虫总RNA为模板，利用HO—1特异性引物一步法RT—PCR进行体外扩增，检测血吸虫成虫是否有HO-1基因的转录表达；纯化PCR扩增产物，DNA测序后进行序列分析。结果 提取较高纯度的血吸虫成虫总RNA后，RT—PCR扩增得到一特异性条带，测序结果显示该特异性片段长度为506bp。结论 本研究用RT-PCR的方法证实了HO—1基因在血吸虫体内的转录表达，为进一步研究血吸虫HO—1基因的全长和基因调控奠定了基础。     

日本血吸虫小热休克蛋白Sjp40的RNA干扰效应

目的研究日本血吸虫小热休克蛋白(sHSP)Sjp40基因的RNA干扰效应及其干扰后日本血吸虫HSP60、HSP70、HSP90基因在mRNA水平出现的协同效应,观察各期虫体Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA表达水平。方法以双链RNA(dsRNA)实现RNA干扰。体外转录合成dsRNA,将Sjp40的dsRNA(dsSjp40)及阴性对照GFP的dsRNA(dsGFP)通过浸泡法转染到日本血吸虫成虫中,体外培养7 d后用TRIZOL法提取其总RNA及总蛋白,实时荧光定量PCR(qPCR)检测Sjp40基因及SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA的表达,Western blot检测Sjp40蛋白表达产物。提取各期虫体总RNA,qPCR检测Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的mRNA表达。结果转染后Sjp40 dsRNA转染组目的基因的转录水平较阴性对照GFP dsRNA转染组下降了80%左右;蛋白质水平较空白对照及阴性对照组(dsGFP)出现明显降低,qPCR结果显示在Sjp40基因RNA干扰后SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的mRNA表达水平未发现明显变化。此四种HSPs在日本血吸虫生活史不同时期mRNA表达存在明显差异,Sjp40基因在虫卵期mRAN水平表达相对其他HSPs基因高。结论 dsSjp40 RNAi可特异性抑制Sjp40的表达,但对SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA的表达没有明显的影响。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的体外扩增及克隆

为了构建日本血吸虫（中国大陆株)Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16。根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1;转化感受态BL21/DE3菌;用酶切,PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。结果表明,从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因。结果提示,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,为进一步研究Sj16基因功能打下基础。     

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及亚单位疫苗的构建和分析

目的 构建日本血吸虫大陆株Sj-Rho GTPase-like真核及原核表达重组质粒，并进行鉴定分析。方法 用PCR法将Sj-Rho GTPase-like基因从已剪切阳性克隆中扩增出来，亚克隆至pcDNA3.1和pGEX-5X-3中，分别经PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。结果 PCR和测序均证明Sj-Rho GTPase-like基因疫苗构建成功，重组蛋白经SDS-PAGE电泳可观察到与预期分子量相应的条带，转印后可被水牛感染血清识别。结论 成功构建了Sj-Rho GTPase-like基因的两种重组载体，为保护性免疫研究打下基础。     

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。     

重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫保护作用的研究

目的研究重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫对感染小鼠的免疫保护作用。方法大量制备重组日本血吸虫32kDa蛋白(rSjGST-Sj32)和铁蛋白(GMCSF-SjFer)。48只昆明小鼠随机分为A,B,C,D4组,每组12只。B组和C组分别为rSjGST-Sj32和GMCSF-SjFer免疫组,每鼠注射50μg重组蛋白加弗氏完全佐剂(FCA);D组为联合免疫组,每鼠注射50μg重组32kDa蛋白和50μg铁蛋白的混合物加FCA;A组为FCA对照组。分别于0、2、6w共免疫3次。第3次免疫后2w,每鼠经腹部皮肤攻击感染40±1条尾蚴,感染后第45天剖杀所有小鼠,比较各组间减虫率和鼠肝卵减少率。结果联合免疫组与FCA对照组相比,获得了36.53%的减虫率和68.44%的每条雌虫肝组织产卵减少率,而单独rSjGST-Sj32免疫组的减虫率及每条雌虫肝组织产卵减少率分别为22.80%和43.12%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001);单独GMCSF-SjFer免疫组分别为21.05%和41.91%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001)。结论rSjGST-Sj32蛋白和GMCSF-SjFer蛋白联合免疫可显著地提高这两种蛋白单独应用时的免疫保护作用。     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

日本血吸虫P14钙结合蛋白样蛋白基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出钙结合蛋白样蛋白SjP14编码基因,并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),制备重组分子疫苗.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录cDNA,设计引物常规PCR法扩增出SjP14编码基因,通过线性T克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),经转染...     

日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29 ku蛋白疫苗对小鼠免疫效果的研究

目的探讨日本血吸虫重组Tsp2/Sj29 ku表膜蛋白疫苗对小鼠的抗病免疫效果。方法 pet32a/SjTsp2/Sj29 ku重组菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG)诱导表达,制备纯化的重组蛋白。29只6周龄雌性昆明鼠随机分为蛋白疫苗组、硫氧还蛋白组和空白对照组,前两组各10只,空白对照组9只。蛋白疫苗组,第一次免疫每鼠经背部皮下多点注射用等体积弗氏完全佐剂乳化的50μg SjTsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白,第12、24天每鼠皮下多点再次注射用等体积弗氏不完全佐剂乳化的50μg该重组蛋白。硫氧还蛋白组的免疫方法同蛋白疫苗组。空白对照组用生理盐水代替蛋白,免疫方法同前。末次免疫后第10天,每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±2)条。于感染45 d后剖杀全部实验小鼠,计算减虫率和减卵率。眼眶取血,分离血清,间接性ELISA法检测IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体亚型,同时检测血清细胞因子γ干扰素( IFN-γ)、白介素4( IL-4)水平。结果 pet32a/SjTsp2/Sj29 ku菌经IPTG诱导可大量表达,经变性、复性获得纯化的日本血吸虫Tsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白。蛋白疫苗组与空白对照组比较,减虫率和减卵率显著升高( P<0.05)。硫氧还蛋白组与空白对照组之间比较,减虫率和减卵率差异均无统计学意义( P>0.05)。蛋白疫苗组小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b显著高于空白对照组(P<0.05),而IgG3和IgM较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白疫苗组小鼠血清IFN-γ、IL-4细胞因子显著高于空白对照组( P<0.01)。结论日本血吸虫 Tsp2/Sj29 ku重组表膜蛋白疫苗对小鼠抗感染有一定的保护性;该重组蛋白免疫引起的是 Th1/Th2混合型免疫反应。