大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达

目的:在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)基因。方法:采用RT-PCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增血红素加氧酶HO-1基因,将该基因克隆进pGEM-Teasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α提取质粒,鉴定HO-1基因。酶切后与pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用nisin诱导HO-1表达,SDS-PAGE、Westernblot鉴定表达产物,并采用分光光度法测定HO-1活性。结果:表达产物相对分子量约为32kU,表达量约为7.0mg/L,HO-1活性为2.386U/(mg·h)。结论:乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠HO-1。     

乳酸乳球菌介导的细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗的构建、鉴定及表达

目的 构建乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, LL)为载体的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)重组LL-Eg95(rLL-Eg95)疫苗,并研究其表达效率。方法 以pCD-Eg95为模板扩增Eg95基因,采用XbaⅠ和HindⅢ双酶切后插入pMG36e,构建重组质粒pMG36e-Eg95,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒进行双酶切鉴定;电穿孔转化乳酸乳球菌MG1363株,构建细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR鉴定。结果 重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小的片段,以具有罗红霉素抗性的重组LL中抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出471 bp的Eg95基因;SDS-PAGE显示重组LL可表达相对分子质量为16.5×10³的Eg95蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹表明表达蛋白可被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。结论 成功构建了细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗,表达的Eg95具有特异的抗原性。     

多重耐药甲型副伤寒沙门菌耐药基因的研究

目的提取贵阳地区1株甲型副伤寒沙门苗基因组,以确定其是否带有抗性基因。方法从30倒样本中筛选一例贵阳地区当前单簇耐药谱最广的菌株。选择一株含抗药性最多的甲型副伤寒沙门菌,提取其基因组,进行PCR扩增Ⅰ类整合子和相关耐药基因。结果通过对该菌Ⅰ类整合子和抗性基因的检测,发现Ⅰ类整合子并携带抗性基因sul2、tetA（G）、blaTEM1等,抗性基因应定位在染色体上。结论多药耐药的甲型副伤寒沙门菌为临床分离株,抗性基因定位在于染色体上,不在以往学者怀疑的3．6kb质粒上。结果显示,此株甲型副伤寒沙门菌的抗性基因应是以Ⅰ类整合子的形式存在染色体上。     

广东五地区养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析

目的了解广东省罗非鱼主要养殖区内感染罗非鱼的无乳链球菌感染状况。方法从广东省内5个罗非鱼主要养殖区内收集罗非鱼样本,分离可疑病原菌,生理生化鉴定分离菌株种类;特异性PCR鉴定;多重PCR鉴定分离菌株的血清型。结果从广东5个罗非鱼主要养殖区发生病害的养殖场采集成鱼206条,共分离到单菌落172个,分离阳性率介于75.29%~89.47%。经生化鉴定无乳链球菌145株、戊糖片球菌18株、血链球菌7株、粪肠球菌2株。特异PCR鉴定显示171株为无乳链球菌,1株生理生化鉴定为戊糖片球菌菌株(GDSA078),特异性PCR扩增结果阴性。血清型多重PCR鉴定显示170株为Ia血清型,两株扩增结果阴性(GDSA078,GDSA017)。结论广东省主要罗非鱼养殖区内感染链球菌为无乳链球菌,血清型高度一致,均为Ia型。     

分析16S rRNA基因部分序列鉴定一株乳酸菌

目的 利用聚类分析16S rRNA基因部分序列的方法对乳酸菌进行鉴定.方法 在表型鉴定的基础上,应用已发表的16S rRNA基因序列设计引物,扩增L.sp.L5菌株16S rRNA基因,并进行测序,将结果与同属及非同属的乳酸菌进行同源性比较.结果 L.sp.L5菌株与同属的乳酸乳球菌同源性为85.5%以上,尤其与乳酸乳球菌叶蝉亚种NCDO 2181T同源性为99.5%,与不同属的肉明串珠菌、漫游球菌、嗜盐四联球菌同源性分别为77.5%、82.8%、79.0%.结论 菌株L.sp.L5为乳酸乳球菌.     

外源性指导序列体外转换临床大肠杆菌氯霉素抗性表型的实验研究

目的 研究外源性指导序列(EGS)体外逆转临床分离大肠杆菌氯霉素抗性的能力。方法 构建针对氯霉素(Cm)乙酰转移酶(cat)并含卡那霉素(Km)抗性基因筛选指标的：EGS重组质粒以及只含Km抗性基因但不含EGS的对照质粒。采用CaCl2方法将重组质粒导入临床分离的耐Cm大肠杆菌株中。通过质粒抽提、菌落PCR鉴定EGS阳性克隆子,分光光度计A600检测导入EGS质粒后耐Cm菌株在液体培养基中的生长率以及KB法检测在固体培养基中的药物敏感试验,探讨EGS分子逆转耐药菌的逆转效应。结果 以pEGFP-CI-EGS cat1 cat2重组质粒对16株临床分离的Cma大肠杆菌供试菌进行转化试验,EGS转化子在含Km的培养基上筛选。其中4株转化菌在Cm100～200μg／ml的液体培养基中生长受抑;在Cm 100～200μg／ml的固体培养基中药敏试验对Cm敏感;转化菌质粒抽提检测出特异EGS条带;菌落PCR扩增鉴定存在EGS。表明16株供试菌中4株临床分离株获得了耐药菌型的表型转换、耐Cm的大肠杆菌临床分离株恢复了对Cm的敏感性。结论 EGS分子具有逆转临床耐药菌为敏感菌的能力。     

hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响

目的 建立大肠埃希菌Red重组系统无痕敲除方法,探讨hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响.方法 以大肠埃希菌MG1655为研究对象,将pKD46质粒转化入MG1655感受态细胞.以质粒pKD3为模板扩增氯霉素抗性基因片段,并将其转化入MG1655/pKD46,氯霉素抗性平板筛选阳性克隆.利用pCP20质粒删除氯霉素抗性基因,构建MG1655 hns基因缺失菌株.96孔板结晶紫染色法分析MG1655 hns基因缺失株生物膜形成能力的变化.苯酚-硫酸法检测细菌胞外多糖含量.结果 氯霉素抗性基因消除后的hns基因缺失株PCR产物长度为434 bp,测序鉴定正确,成功构建MG1655 △hns基因缺失株.MG1655△hns菌株生物膜形成能力和胞外多糖产生显著低于MG1655(P＜0.01).结论 利用Red重组技术成功构建出MG1655△hns菌株,hns基因对细菌生物膜的形成具有重要的调控作用.     

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的 构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGKINVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础.方法 将invA基因克隆于pGKble24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGKINVA.质粒pGKINVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株.结论 从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGKble24构建重组穿梭质粒pGKINVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在Korthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株.结论 成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGKINVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析.     

青海部分牧区牦牛传统乳制品中优势乳酸菌的鉴定

目的本文旨在从青海牧区传统乳制品中分离牦牛乳优势乳酸菌,获得青海地区传统乳制品乳酸菌物种资源,构建青海地区乳酸菌种群系统发育树,鉴定其优势菌种属。方法从青海省玉树州、果洛州、黄南州等牧区采集传统乳制品,富聚培养、筛选分离乳酸菌,通过形态学特征和生理生化实验,并结合16S rRNA基因序列测定,进行系统进化分析。结果从12份样品中分离到乳酸菌纯菌种9株,发现来源于三种不同属菌株：嗜热乳酸链球菌属（5株）、粪肠球菌属（3株）、侧孢短芽孢杆菌属（1株）。结论玉树州、果洛州、黄南州等地区牦牛传统乳制品中嗜热乳酸链球菌（55.6%）为优势菌种,粪肠球菌属（33.3%）以及侧孢短芽孢杆菌属（11.1%）为次级菌种。     

产esp和hyl基因肠球菌与尿路局部免疫关系探讨

目的 探讨产esp和hyl基因的肠球菌与尿液局部免疫的关系.方法 使用VITEK-2全自动细菌分析仪鉴定出粪肠球菌131株,屎肠球菌105株,绵子糖肠球菌2株,墩鸡肠球菌3株,铅黄肠球菌和浅黄肠球菌各1株.采用聚合酶链反应(PCR)扩增法检测是否含有esp和hyl基因;沉淀离心法检测尿液中白细胞含量;免疫比浊法测定免疫球蛋白A(IgA)含量.结果 (1)粪肠球菌检测出esp、hyl为73株和61株,同时检测出两种基因的菌株有33株;屎肠球菌测出esp、hyl为55株和51株,同时检测出两种基因的菌株有30株.(2)尿液中白细胞含量为中等量时肠球菌感染最为多见,在白细胞少于104/L时,肠球菌感染组与未感染组差异有统计学意义.(3)在IgA含量高时,esp、hyl基因与IgA含量差异有统计学意义.结论 肠球菌是否含有esp、hy1基因与尿路局部免疫功能具有重要关系.     

小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达

目的 在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因.方法 用Nsi Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-IL-12质粒后,与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A(nisA)启动子的pSEC-E7质粒连接,从而构建成pSEC-IL-12质粒;经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用乳链杆菌肽(nisin)诱导白细胞介素-12表达,SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物;用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-12的量.结果 建立了白细胞介素-12乳酸菌基因表达系统.在nisin的诱导下,NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80 ng/L.结论 乳酸乳球菌能够表达一定数量的小鼠白细胞介素-12.     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

Non-Fusion and Fusion Expression of β-Galactosidase from Lactobacillus bulgaricus in Lactococcus lactis

Objective To construct four recombinant Lactococcus lactis strains exhibiting high β-galactosidase activity in fusion or non-fusion ways, and to study the influence factors for their protein expression and secretion. Methods The gene fragments encoding β-galactosidase from two strains of Loctobacillus bulgaricus, wch9901 isolated from yogurt and 1.1480 purchased from the Chinese Academy of Sciences, were amplified and inserted into lactococcal expression vector pMG36e. For fusion expression, the open reading frame of the β-galactosidase gene was amplified, while for non-fusion expression, the open reading frame of the β-galactosidase gene was amplified with its native Shine-Dalgarno sequence upstream. The start codon of the β-galactosidase gene partially overlapped with the stop codon of vector origin open reading frame. Then, the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli DH5α and Lactococcus lactis subsp, lactis MG1363 and confirmed by determining β-galactosidase activities. Results The non-fusion expression plasmids showed a significantly higher β-galactosidase activity in transformed strains than the fusion expression plasmids. The highest enzyme activity was observed in Lactococcus lactis transformed with the non-fusion expression plasmids which were inserted into the β-galactosidase gene from Lactobacillus bulgaricus wch9901. The β-galactosidase activity was 2.75 times as high as that of the native counterpart. In addition, β-galactosidase expressed by recombinant plasmids in Lactococcus lactis could be secreted into the culture medium. The highest secretion rate （27.1%） was observed when the culture medium contained 20 g/L of lactose. Conclusion Different properties of the native bacteria may have some effects on the protein expression of recombinant plasmids. Non-fusion expression shows a higher enzyme activity in host bacteria. There may be a host-related weak secretion signal peptide gene within the structure gene of Lb. bulgaricus β-galactosidase, and its translation pr     

携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带角化细胞生长因子(Kemtinocyte growth factor,KGF)的腺病毒载体并观察其在细胞中的表达.方法:通过PCR从pcDNA3-KGFpIRES2-EGFP-KGF质粒中扩增出目的片段KGF,定向克隆至穿梭质粒载体pShuttle-CMV中,构建pShuttl-KGF.经酶切及测序鉴定后...     

TNF-SP-EGFP融合蛋白的构建表达及亚细胞定位

目的探讨肿瘤坏死因子信号肽（TNF-SP）在哺乳动物细胞的表达和亚细胞定位。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术，以TNF-SP-pcDNA3.0质粒为模板扩增TNF-SP基因，采用PCR产物的粘端克隆法，将TNF-SP定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点，构建TNF-SP-EGFP重组质粒，酶切，PCR检测，序列分析鉴定，采用脂质体转染法，将TNF-SP-EGFP融合基因转染COS-7细胞进行表达，经碘化丙啶（PI）染色后以激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果PCR检测，酶切鉴定及测序证实目的基因TNF-SP正确连接到pEGFP-N1的多克隆位点。TNF-SP-EGFP重组体转染COS-7后，激光共聚焦显微镜显示TNF-SP-EGFP在细胞质表达。结论成功地构建了TNF-SP-EGFP融合蛋白真核表达质粒，在COS-7细胞中获得表达，并证实其定位于细胞质。     

构建及鉴定表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌

目的:构建食品级表达胃泌酸调节素(oxyntomodulin,OXM)的乳酸乳球菌,鉴定其在体外?体内的表达水平?方法:构建重组质粒pNZ8149-OXM电转至乳酸乳球菌中,用Western blot检测重组乳酸乳球菌OXM表达水平?给小鼠喂食表达OXM的乳酸乳球菌后,用液质联用质谱检测小鼠血清OXM的含量?结果:重组质粒经测序鉴定正确,制备的重组乳酸乳球菌在nisin诱导5 h后OXM表达量最高,食用后小鼠血清OXM含量是对照组的2.5倍左右?结论:成功构建了表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌,为进一步探讨其减肥降脂效应提供了基础?     

破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

目的：构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法: 将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以Sal I、Hind Ⅲ切下,分别定向连接到以Xho I、 Hind Ⅲ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况。结果：构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8kDa,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kDa的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%,膜蛋白的17.9%; Western-blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论：成功构建了TETC乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了TETC,并初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定了基础。     

肠球菌庆大霉素高耐性传递

目的 对临床分离的肠球菌进行药敏分析,研究其庆大霉素高耐性的遗传学基础。方法 通过电击转化和质粒丢失试验确定庆大霉素高耐性质粒,PCR扩增和末端双脱氧法测序分析庆大霉素高耐基因。结果 确定一庆大霉素高耐性质粒（pG301)及其重组质粒（pG401),PCR扩增出－1.6kb扩增片段,测序结果与6‘-O-氨基糖苷乙酰转移酶－2“－N－氨基糖苷酸转移酶[aac(6‘)-aph(2“)]双功能酶基因基本一致。结论 在所分离的肠球菌中,耐药性相当普遍。庆大霉素高耐基因可位于不可自主接合转移的较小质粒上,在电击转化过程中可发生重组,在此质粒中介导庆大霉素高耐性的基因是aac(6‘)-aph(2“)双功能酶基因。     

Construction and Secretory Expression of β-Galactosidase Gene from Lactobacillus Bulgaricus in Lactococcus Lactis

Objective This study is to examine the secretion effects of β-galactosidase in Lactococcus lactis.Methods The usp45 and β-galactosidase genes were cloned and inserted into plasmid pMG36e to obtain the recombinant plasmid pMG36e-usp-lacZ.This recombinant plasmid was transformed into both Escherichia coli DH5α and L.lactis MG1363.The enzyme activity,gene sequencing,SDS-PAGE and hereditary stability were assessed and studied.Results The lacZ gene inserted into plasmids pMG36e-usp-lacZ was 99.37％ similar to the GenBank sequence,and SDS-PAGE revealed an evident idio-strap at 116 KDa between L.lactis MG1363/pMG36eusp-lacZ in both supernatant and cell samples.β-Galactosidase activity measured 0.225 U/mL in L.lactis pMG36e-usp-lacZ transformants,and its secretion rate was 10％.The plasmid pMG36e-usp-lacZ appeared more stable in MG1363.Conclusion The authors concluded that these new recombinant bacteria well expressed and secreted β-galactosidase,indicating that the β-galactosidase expression system was successfully constructed,and this might provide a new solution for management of lactose intolerance specifically and promote the use of gene-modified organisms as part of the food-grade plasmid in general.