用间接ELISA检出葡葡球菌肠毒素B和C单克隆抗体的特异性、交叉反应性及竞争现象(文摘)

已发现七种血清学上不同的葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3SED、SEE)。它们的活性、结构和分子量均类似。在SEB和SEC间存在较多的交叉反应决定簇。该研究的目的在于建立具有仅对SEB或SEC1特异的McAbs。 采用“囊培养技术”产生毒素。SEA、SEB SEC1、SED和SEE是纯化的,SE-C2和SEC3是未经提纯的。抗血清为纯化的羊抗SEA、SED和SEE,兔抗SEB和SE-     

抗B型葡萄球菌肠毒素（SEB）单克隆抗体的研制及其初步鉴定（简报）

葡萄球菌肠毒素是一组分子量为24,000—34，000的单肽链蛋白质。已知有SEA、SEB、SECs(包括SEC1，SEC2及SEC8)，SED及SEE等血清型。都能引起食物中毒。并证实SEA和SEB还具有强烈的有丝分裂原效应。对机体可产生广泛地免疫调节作用。因此，建立抗SEB单抗的杂交癌细胞系具有重要的实际意义。     

合成多肽P72对葡萄球菌肠毒素超抗原抑制效应的研究

目的 观察合成多肽P72对葡萄球菌肠毒素超抗原(SEs)促人外周血单个核细胞(PBMC)增殖活性的抑制作用.方法 3H-TdR掺入法检测人 PBMC的增殖;ELISA检测IL-2、IFN-γ、TNF-β分泌情况.结果 P72对 SEA、SEB、SEC的促PBMC增殖及分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β具有抑制作用.结论 细胞试验显示合成多肽P72对超抗原SEA、SEB、SEC的活性具有抑制作用.     

超抗原SEA和SEB对正常人TCR V_β基因的限制性取用

金黄色葡萄球菌肠毒素 (SE )作为一种超抗原 ,以MHC非限制性及TCRVβ特异性的方式激活T细胞。本文用定量PCR方法 ,分析SEA和SEB刺激的正常人外周血淋巴细胞T细胞抗原受体Vβ的取用格局。揭示在不同HLA遗传背景下 ,SEA刺激的淋巴细胞均选择性地取用Vβ3和Vβ6两种基因片段 ,而SEB刺激的淋巴细胞则优势表达Vβ2、Vβ8和Vβ9。通过比较分析 ,Sigma产的SEB刺激淋巴细胞后则优势表达Vβ3、Vβ4、Vβ16和Vβ2 0 ,提示外周血淋巴细胞在超抗原作用下发生寡克隆扩增。     

金黄色葡萄球菌肠毒素对小鼠慢性哮喘模型的抗炎作用

目的：用金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）和肠毒素B（SEB）干预幼年小鼠,观察它们对小鼠慢性哮喘气道炎症的影响以及对气道内相关细胞因子水平的调节作用。方法：实验组中BALB/c小鼠在出生后1周开始腹腔注射0.1 mL SEA或SEB（浓度1 mg/L）,隔天注射,共7次。其它小组注射相同剂量生理盐水对照。BALB/c 小鼠出生后4周建立哮喘模型,实验组和模型组分别在0、7和14 d用卵白蛋白（OVA）腹腔注射致敏,在28 d开始隔天OVA雾化激发哮喘,共7次,末次激发后24-48 h内取支气管肺泡灌洗液（BALF）,进行嗜酸性粒细胞和总白细胞计数,其余BALF离心-70 ℃冻存检测细胞因子,固定肺组织做病理切片分析。结果:SEA组和SEB组小鼠肺组织炎症反应轻于模型组,BALF中嗜酸性粒细胞数量少于模型组 (P＜0.05);SEA、SEB组BALF中Th1细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）高于模型组(P＜0.05);而Th2细胞因子白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）和嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin）均低于模型组(P＜0.01)。结论:早期感染 SEA、SEB可以减少小鼠慢性哮喘支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量,可能通过调节Th1/Th2细胞因子比值减轻气道中的哮喘炎症反应。     

葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的设计及空间结构研究

目的:以SEs氨基酸高度保守序列作靶序列设计抑制性多肽,研究筛选出的多肽P72的空间结构。方法:用生物信息学软件"Vector NTI 10.3,Insight II 2000,Discovery Studio 1.7"等分析及预测多肽P72的空间结构。结果:P72在SEA、SEB和SEC的同源序列在空间结构具有高度的相似性,P72远离SEB的TCR和MHCⅡ结合位。结论:P72可能不是与MHCⅡ类分子及TCR结合而产生的抑制作用,其具体的抑制机制有待深入研究。     

抗B型葡葡球菌肠毒素(SEB)单克隆抗体的特性鉴定及其应用

SEB为金黄色葡萄球菌产生的一种分子量为28.5kD单肽链毒性蛋白质。其性质稳定,易于大量生产和制成气溶胶撒布,故被列为重要的生物性战剂。SEB除可引起食物中毒外,近年发现还是一种强有力的促分裂原,具有广泛地免疫调节作用。 为了深入评价SEB的有关特性,我们在以BALB/c小鼠制备出抗SEB McAb的基础上,对已获得的6株抗SEB McAb(S1、S2、D1、3D6、B4和F7)作了较系统的鉴定。通过McAb相加试验及ELISA竞争抑制试验表明,6株抗SEB McAb具有相同的表位特异性;它们在间接ELISA试     

葡萄球菌肠毒素超抗原广谱抑制性多肽的功能研究

目的在前期筛选出针对SEA、SEB、SEC具有广谱抑制性的多肽P72基础上,通过竞争结合实验和动物模型对多肽P72的抑制机制进行探讨。方法采用竞争结合实验检测多肽P72与MHCⅡ类分子的亲合力;利用"两次攻击(two-hit)法"建立的动物模型研究P72对SEs的体内抑制活性。结果 P72不能与FITC-SEs有效竞争结合Raji细胞上的MHCⅡ类分子,P72对SEA、SEB和SEC致Balb/c小鼠休克效应具有显著的保护作用。结论 P72可能不是与MHC II类分子结合而产生的抑制作用,P72能够在体内抑制SEs的超抗原活性,其具体的抑制机制有待深入研究。     

葡萄球菌肠毒素B突变体(K172E)的制备和抗肿瘤活性分析

目的 :制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB)突变体 ,观察其抗肿瘤活性变化。方法 :将诱导表达的SEB突变体重组蛋白包涵体进行变性复性和分离纯化 ,并对其肿瘤抑制活性与野生型SEB进行比较。观察突变体蛋白的抑瘤效果。结果 :建立了可行的包涵体复性条件和纯化方法 ,获得的突变体蛋白具有明显的抗肿瘤作用 ,其抑瘤活性比野生型SEB至少高 10倍。结论 :获得的突变体SEB K172E的抗肿瘤效果经体外实验证实优于野生型SEB ,有可能成为一种较具潜力的抗肿瘤药物     

超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节

目的研究超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节。方法以超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/B)活化PBMC为模型,应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察CD226分子在NK细胞上的变化;采用51Cr释放实验,观察NK细胞在超抗原作用下杀伤功能的改变;利用激光共聚焦显微镜,观察CD226分子在NK细胞杀伤相的分布。结果在静止PBMC中,CD56 NK细胞的百分率为12.3%,CD56 CD226 细胞仅为1.4%。当效靶比为5∶1时,NK细胞对K562细胞的杀伤率为(3.2±0.2)%。当0.1mg/LSEA或SEB刺激PBMC1d后,CD56 NK细胞的百分率分别为13.5%和14.1%,CD226在NK细胞上的表达水平明显升高,且主要表达在CD56dim细胞上。在刺激第2天,SEA组CD56 CD226 占CD56 细胞69.1%,SEB组CD56 CD226 占CD56 细胞64.3%。刺激第3天,CD226在NK细胞上的表达水平均较第2天明显下降。在超抗原0.1mg/L作用3d中,SEA组和SEB组NK细胞杀伤率均明显高于同期未刺激组NK细胞的杀伤率及新鲜分离NK细胞的杀伤率(P<0.05),在作用的第2天,SEA组和SEB组杀伤率均达到峰值分别为(82.3±6.9)%和(80.6±7.5)%。激光共聚焦结果显示,CD226分子与LFA-1分子共定位于NK细胞与K562细胞的接触部位。结论超抗原SEA和SEB可提高NK细胞杀伤活性,可能与其促进CD226分子在NK细胞上的表达相关,CD226分子可能参与NK细胞免疫突触的形成。     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEAj)的主要血清学抗原(MSA)的分离及电泳分析

<正> 经电泳分析证实,血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)系由蛋白质、糖蛋白以及多糖等组成的不均一混合物。Harrison等曾用二步亲和层析法,从曼氏血吸虫SEA(SEAm)中分离具有抗原活性的分部,并证明此抗原分部对刺激致敏动物淋巴细胞的转化较粗制的SEAm更有效,同时与SEAm一样能对致敏小鼠激发强的迟发型超敏反应。Carter等也曾采用Harrison等的方法从日本血吸虫SEA(SEAj)中分离具有抗原活性的分部,并应用此抗原分部证实感染日本血吸虫小鼠血清内的主要沉淀抗体是与糖蛋白或蛋     

双抗体夹心ELISA检测SEB方法的建立及在不同基质中检测的应用

目的:建立检测SEB的双单克隆抗体(mAb)夹心ELISA,并检测在多种基质中SEB的敏感性。方法:制备、纯化抗SEBmAbB4和D6。D6mAb标记辣根过氧化物酶(HRP)作为检测抗体,B4mAb作为包被抗体。结果:成功建立了敏感、特异检测SEB的ELISA方法,检测抗体稀释液和小牛血清中SEB,检测灵感度0.2μg/L,定量线性范围0.78～12.5μg/L,r2=0.992,批间变异系数(CV)<10%,回收率80%～110%。检测50g/L脱脂牛奶、尿液和自来水中的SEB,灵敏度0.39μg/L,定量线性范围0.78～25μg/L,r2=0.997。与SEA和SECl无交叉反应。结论:本方法测量准确,灵敏度高,特异性好,在食品工业和临床标本检测中有广阔的应用前景。     

金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是一组可溶性单链蛋白,是金黄色葡萄球菌分泌的细菌外毒素,在结构和功能上有一定的相似性.经典的SE分为SEA,SEB,SEC,SED,SEE 5型[1],其中SEC又可分为SEC1,SEC2和SEC3 3种亚型.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的 克隆葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrap^TM chelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。     

超抗原SEA(D227A)的构建及其免疫活性鉴定

目的 构建SEA(D227A)基因的原核表达载体，并进行表达、分离纯化与免疫活性鉴定。方法 采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使SEA基因第680位碱基由A突变为C，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由天冬氨酸(GAT)突变为丙氨酸(GCr)，构建pGEX-SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌DHSa中原核表达，再通过淋巴细胞增殖实验对其免疫活性进行测定。结果 构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致；成功地构建pGDX-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，通过IPTG诱导、GSTrap FF柱分离纯化及凝血酶切除CST后，得到Mr为27000的目的蛋白。淋巴细胞增殖实验显示，100ng/mL重组SEA(D227A)可明显刺激淋巴细胞增殖。结论 成功地构建了SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，所得重组SEA(D227A)能够刺激淋巴细胞增殖，但作用与野生型SEA相比较温和。该结果为寻找有效、毒副作用低的超抗原提供了线索。     

酶联免疫发光法检测金葡菌肠毒素(SE)B和SEC1方法的建立

目的：比较酶联免疫测定法（ELISA）和酶联免疫化学发光法（CLIA）在检测SEB、SECl中的敏感性及稳定性。方法：常规法制备、纯化抗SEB和SEC1单克隆抗体（mAb），以碱性磷酸酶（AP）标记的FMMU-SEB．D6和FMMU-SEC1．C4mAb为检测抗体，FMMU-SEB．B4和FMMU-SEC1．G8mAb为包被抗体，以单磷酸酚酞（PMP）为显色底物，以LumigenAPS-5为发光底物。结果：成功地建立了敏感、特异检测SEB、SEC1的ELISA和CLIA方法，CLIA较传统ELISA具有灵敏度高、线性范围宽和省时等优点。结论：CLIA法是一种比传统ELISA更优越的免疫学检测方法，在可疑SE污染标本检测、流行病学调查等领域具有良好的应用前景。     

点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定

目的：进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建，并进行表达、分离纯化与鉴定。方法：采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为c，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(DAT)突变为A(GCF)，构建pRSET：SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达，再通过Western blot进行鉴定。结果：构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白，Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合，最后采用Ni^2 -NTA柱进行分离纯化。结论：成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白可溶性微针制备及免疫效果研究

目的建立重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白的可溶性微针体外检测方法及体内免疫效果评价。方法通过动态光散射(DLS)检测蛋白粒径、BCA法检测单片微针的蛋白浓度、活体成像实验检测微针皮内注射后蛋白在体内的停留时间,通过DRIZE评分评价微针注射后的皮肤情况,通过动物实验评价重组SEB蛋白可溶性微针的免疫原性及免疫保护效果。结果DLS分析显示SEB蛋白可溶性微针负载的重组SEB蛋白粒径与重组SEB蛋白溶液中的SEB蛋白粒径无明显差别,单片微针中重组SEB蛋白含量为(13.2±1.4)μg,活体成像实验显示相对于肌肉注射,重组SEB蛋白可溶性微针皮内给药后荧光蛋白在体内的停留时间延长,动物实验显示13.0μg的重组SEB蛋白可溶性微针即能引发免疫反应,并且在2LD50SEB攻毒剂量下能够产生很好保护效果。结论重组SEB蛋白可溶性微针能够刺激小鼠机体产生较好的免疫原性及免疫保护效果,为发展疫苗新型免疫途径提供了新策略。     

葡萄球菌肠毒素B突变体基因表达和功能的初步研究

目的 应用PCR致突变基因克隆技术,获得抗原性保留,但超原毒性明显下降的葡萄球菌毒素B（SEB）突变体,用作新型淋巴细胞激活分子和超抗原疫苗的研究。方法 用PCR和PCR致变技术,从SEB标准株扩增SEB（SEB－N）和SEB突变基因（SEB－M）,分别与原核表达质粒pTrc99A重组,转化大肠杆菌JM109,经筛选获得重组质粒pTrcNb和pTrcMb,用双脱氧链终止法作序列分析。表达的SEB－N和SEB－M蛋白,经双向免疫扩散试验作抗的性鉴定后,刺激小鼠脾细胞并由ELISA法检测培养上清中IL－2的水平。结果 SEB－N150位苏氨酸（密码子ACT）非定向突变为丙氨酸（密码GCT）,SEB－M23位天冬酰胺（密码子AAT）定向突变为丝氨酸（密码子AGT）。两种突变基因表达的蛋白均与抗SEB形成明显沉淀线,与天然SEB刺激小鼠脾细胞产生IL－2水平相比,SEB-N格SEB－M突变体蛋白分别下降12．5倍和40倍。结论 获得了能表达SEB－N和SEB－M突变体蛋白的2株工程菌。表达的突变体蛋白具有良好的免疫反应性,但刺激小鼠脾细胞产生白细胞介素2的超抗原生物学活性明显下降。     

细胞融合技术有关因素的进一步探讨

单克隆抗体(McAb)研制中,细胞融合技术为一随机过程,难免受到操作者主观因素和某些客观因素的影响。我们在制备抗4种血清型的葡萄球菌肠毒素(SEA.SEB,SEC1和SED)McAb过程中,有目的地对促融剂、溶液pH值、融台过程的温度及时间控制等环节进行了对比观察和进一步探讨。 1 促融剂及溶液pH值的比较 促融剂为聚乙二醇(PEG),进口的两家产品(FLAKE,MW 1500:MERCK,MW4000)。试验中,在固定45％PEG溶液于pH 8.2和细胞