不同来源产志贺毒素大肠埃希菌分布特征

目的探讨不同标本中产志贺样毒素大肠埃希菌（STEC）的分布特征。方法采集动物粪便、肉类食品和排污口污泥样品，常规分离大肠埃希菌，血清学分型，PCR鉴定产志贺样毒素（stx1，stx2）菌株。结果293份标本中鉴定出8株STEC，1株为产志贺毒素O157：H7型，2株为不产志贺毒素O157：H7型，5株为产志贺毒素非O157：H7型。结论STEC存在于不同来源的标本中，菌株表型与毒力因子存在一定差异。     

自食品中检出肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希菌

肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希菌 (Entericshiga -“Like -toxin -producingandinvasiveE .coli,ESIEC)是 1993年中国预防医学科学院流研所徐建国等首次报道的一种新的腹泻病原菌。因其分离的大肠杆菌与侵袭性大肠杆菌特异探针(Inv)和志贺样毒素 (SLT1 、SLT2 )探针同时发生阳性反应 ,国际上未见有此菌株的报道 ,因此认为本菌为第六种致泻性大肠埃希氏菌 ,并将其命名为ESIEC。流研所检测的 172株不能鉴定的大肠杆菌中 ,ESIEC占 3 1.4% [1 ] 。我国已有粪便标本中检出本菌的报道[4 ] ,在食品中的分布情况尚不清楚。毒力岛(P…     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性.方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种.应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定.应用多重Real-timePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因.对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较.ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性.结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性.血清型为O157:H7.毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性.PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%.结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关.STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁.     

产志贺样毒素大肠埃希菌Ⅰ类整合子的鉴定和分析

目的阐明各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing E. coli,STEC)中I类耐药整合子的分布、特征、所含基因盒的状况以及所表达的耐药信息.方法常规分离出大肠埃希菌、血清学分型,PCR法鉴定产stx1-2毒素性菌株;纸片扩散法对17种抗菌药物进行耐药性监测和分析;PCR法鉴定I类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析.结果各种标本中共鉴定出46株产志贺样毒素大肠埃希菌,其中23株为O157:H7;全部STEC对复方新诺明耐药,对链霉素耐药率为28.3%,氨苄西林为30.4%,而且有5株对至少＞4种抗菌药物多重耐药,耐药谱为复方新诺明-链霉素-氨苄西林-庆大霉素;46株分离株中有11株(23.9%)鉴定出I类整合子,PCR产物测序得知9株携带aadA1基因盒,2株携带aadA2基因盒,均来自氨基糖苷类抗菌药物耐药菌株(39.3%),传递对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性.结论I类整合子存在于各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌中,并携带相应的基因盒,决定着对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性.     

应用高分辨率熔解曲线技术检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因变种stx2c

目的:探索高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析技术在检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因变种stx2c中的应用。方法:用HRM技术对20株O157:H7代表性菌株志贺毒素2基因进行分型,并与测序结果进行比较。结果:20份O157:H7样品中有3种类型熔解曲线。测序结果显示,12例A型熔解曲线中除1例为stx2a+stx2c杂合型外,其它均为原毒素基因型stx2a;1例B型熔解曲线测序结果为stx2a+stx2c杂合型,7例C型熔解曲线菌株测序结果均为stx2c纯合子。结论:HRM技术简便、快速,可作为志贺毒素2基因变种stx2c的检测方法。     

霍乱毒素B亚单位与志贺毒素2B亚单位融合表达及抗原性检测

目的 克隆表达出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7志贺毒素2B亚单位(Stx2B)与霍乱毒素B亚单位(CTB)的融合蛋白(CTB-Stx2B),并检测其抗原性和与神经节苷脂(GM1)结合能力.方法 设计引物扩增融合蛋白CTB-Stx2B的编码基因ctb-stx2b,T-A克隆测序验证后克隆入原核表达质粒pET30a(+)C,构建表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,获得目的蛋白CTB-Stx2B,SDS-PAGE和Western-blot检测其抗原性和形成五聚体的能力;GM1-ELISA法检测其与GM1结合能力.结果 扩增出约750 bp的目的片段,测序鉴定与设计序列一致;原核表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b转化E.coliBL21(DE3)后,经酶切和PCR扩增鉴定正确;IPTG诱导后SDS-PAGE初步测定CTB-Stx2B单体的相对分子质量(MR)约为20×103;Western-blot检测CTB-Stx2B能与CTB单克隆抗体结合,纯化产物经复性后大多以五聚体形式存在;ELISA检测CTB-Stx2B具有结合GM1活性.结论 成功克隆、表达了融合蛋白CTB-Stx2B;表达的蛋白具有良好的CTB抗原性和GM1结合能力.     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌0157：H7的分子生物学特性研究

目的：了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157：H7（HZI-11株）的分子生物学特性。方法：应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种。应用0157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因，进行菌株血清型的鉴定。应用多重Real-time PCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因。对菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型，并与国内代表菌株进行比较。ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性。结果：细菌生化鉴定为大肠埃希菌，山梨醇阴性。血清型为O157：H7。毒力基因stx2、hly和eae均阳性，stx1阴性。PFGE谱带同江苏分离O157：H7菌株几乎完全相同，带型的相似度为97％。结论：该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）O157：H7。与国内近年在江苏等地流行的STEC O157：H7菌株密切相关。STEC O157：H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁。     

霍乱毒素B亚单位与志贺毒素2B亚单位融合表达及抗原性检测

目的 克隆表达出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7志贺毒素2B亚单位(Stx2B)与霍乱毒素B亚单位(CTB)的融合蛋白(CTB-Stx2B),并检测其抗原性和与神经节苷脂(GM1)结合能力.方法 设计引物扩增融合蛋白CTB-Stx2B的编码基因ctb-stx2b,T-A克隆测序验证后克隆入原核表达质粒pET30a(+)C,构建表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,获得目的蛋白CTB-Stx2B,SDS-PAGE和Western-blot检测其抗原性和形成五聚体的能力;GM1-ELISA法检测其与GM1结合能力.结果 扩增出约750 bp的目的片段,测序鉴定与设计序列一致;原核表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b转化E.coliBL21(DE3)后,经酶切和PCR扩增鉴定正确;IPTG诱导后SDS-PAGE初步测定CTB-Stx2B单体的相对分子质量(MR)约为20×103;Western-blot检测CTB-Stx2B能与CTB单克隆抗体结合,纯化产物经复性后大多以五聚体形式存在;ELISA检测CTB-Stx2B具有结合GM1活性.结论 成功克隆、表达了融合蛋白CTB-Stx2B;表达的蛋白具有良好的CTB抗原性和GM1结合能力.     

3株大肠埃希菌的实验研究

肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希菌 ( Entero- Sl TS- Producing and invasive E.coli,ESIEC)是由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所实验室于 1993年在国际上率先发现和命名的一种新的腹泻病原。我们于 1999年从腹泻病人粪便培养物中查到 3株 ESIEC,现将实验结果报告如下。1　材料与方法1.1　菌株来源　腹泻病人粪便。1.2　材料　生化培养基由徐州市卫生防疫站实验室配制。ES-IEC血清购自中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所。O13 9诊断血清和药敏纸片购自中国药品生物制品检定所。1.3　方法　从平皿培养物中挑…     

2株不同产志贺毒素大肠埃希菌O157感染症一例

患儿 ,男 ,2 0 0 1年 2月 2 0日出生 ,发育正常 ,于 12月 6日开始出现灰白色水样腹泻 (6～ 8次 2 4h ,未见血性腹泻 )、肠鸣、呕吐、厌食等症状 ,无溶血性尿毒综合征 ,体温正常 ,病前有食用牛奶和水果史。采用血清学和生物化学方法 ,12月8日采集患儿粪便标本 (1ml)增菌培养。增菌培养物经大肠埃希菌 (E .coli)O15 7免疫色层技术 (E .coliO15 7快检金卡 ,郑州博赛生物技术研究所和美国BINAX公司产品 )检测 ,中国和美国的两种检测卡均显强阳性 ,增菌培养液浸至检测线区域即呈现出比照线粗且颜色更深的阳性线 ,随后取增菌培养物和免疫磁珠…     

大肠埃希菌O157:H7嵌合荧光RAM检测分析

目的建立大肠埃希菌O157：H7的嵌合荧光法（SYBR Green I）实时网状分枝扩增（RAM）检测技术.方法将产志贺样毒素大肠埃希菌O157：H7靶基因递比稀释确定SYBR Green I实时RAM的灵敏度,并进一步检测临床分离的菌株.结果SYBR Green I实时网状分枝扩增技术最低能检测10个产志贺样毒素大肠埃希菌O157：H7,检测信号出现的时间与靶基因的浓度成正比,临床分离3株产志贺样毒素大肠埃希菌O157为阳性,而非致病性大肠埃希菌为阴性.结论SYBR Green I实时RAM是一种快速、灵敏、准确、实时、环保的检测大肠埃希菌O157：H7的新核酸扩增技术.     

PCR快速检测肠毒素大肠杆菌方法的研究

目的利用PCR技术,尝试建立特异性引物PCR快速检测肠毒素大肠杆菌的方法。方法设计肠毒素大肠杆菌LT基因的特异性引物,优化PCR反应条件,对16种样品进行细菌通用引物和特异性引物的PCR扩增,从而鉴定肠毒素大肠杆菌。结果所有样品都出现细菌通用引物的扩增条带,而只有肠毒素大肠杆菌有特异性引物的PCR扩增产物,结果与实际完全一致。结论该方法具有简单、迅速、准确的特点,可应用于对肠毒素大肠杆菌的鉴定。     

特异血清吸附模板聚合酶链反应检测肠侵袭性大肠杆菌的研究

目的：建立检测与鉴定肠侵袭性大肠杆菌的新方法。方法：应用特异血清吸附模板聚合酶链反应（SSST．PCR）检测肠侵袭性大肠杆菌。结果：与经典的分离培养法比较，此方法大大缩短了时间，由原来的7天左右缩短到了6－8小时，与单纯的PCR法比较，简化了DNA提纯的过程，并能进行分型。结论：SSST．PCR法是一种简单，快速，特异和敏感的新方法。     

利用反转录环介导等温扩增技术检测麻疹病毒

目的　建立一种快速检测麻疹病毒的方法。方法　以分离到的麻疹病毒RNA为模板,利用环介导等温扩增技术（LAMP）原理,设计合成3套引物,特异型识别病毒基因的8个位点,在反转录酶作用下,63℃扩增60min,80 ℃2min终止反应,最终产物分别经凝胶电泳和荧光目视观察。通过real-time仪实时监测反应过程,同时将该方法的灵敏度、特异度与常规RT-PCR、real-timeRT-PCR进行比较。结果　RT-LAMP反应约1 h即可完成,最终产物经电泳观察可见大小片段不等的呈梯度的扩增条带,目视显示反应液颜色由黄色变为绿色。灵敏性是常规RT-PCR和real-timeRT-PCR的100倍。结论　RT-LAMP方法具有灵敏、特异、快速、简便、成本低等特点,适用于基层和现场使用。     

产志贺毒素大肠杆菌毒力基因检测

目的 分析河南省2000～2002年分离的351株与产志贺毒素大肠菌(STEC)感染有关的菌株，了解不同来源标本各种毒素基因携带模式。方法 应用多重PCR技术，检测所有菌株志贺毒素(stx1和stx2、hlyA、eaeA、rfbO111和rfbO157基因。结果 351株待检菌株分为枸橼酸杆菌、O157：H7大肠杆菌、rfbO157基因阳性不携带志贺毒素基因的大肠杆菌和rfbO157基因阴性携带志贺毒素基因的大肠杆菌4种不同类型。4种类型菌株具有6种rebO157、stx2、stx1基因模式。携带志贺毒素基因的菌株主要源自波尔山羊、普通本地羊和病人，其它家畜家禽中有不同程度感染STEC。结论 河南省存在STEC的感染．主要以O157：H7大肠杆菌为主，但也存在其它非O157的STEC。     

多重PCR检测霍乱弧菌RTX毒力基因

目的：探索建立一种快速、敏感的诊断方法，用于检测霍乱弧菌RTX毒力基因。方法：针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）、RTX毒素家族的细胞毒素基因（rtxA）和毒素激活子基因（rtxC）分别设计3对引物，建立多重PCR方法；用Hep-2细胞测毒方法检测rtxA、rtxC阳性菌株毒素的表达。结果：所有183株临床和环境中分离的霍乱弧菌中，PCR和Hep-2细胞测毒法RTX毒素均为阳性，而古典生物型标准株（569B）二者均为阴性。结论：该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

大肠杆菌O157特异基因的PCR检测方法

目的：建立一种灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157的PCR方法。方法：针对大肠杆菌O157特异性基因rfbO157设计引物，扩增-497bp的O157标识序列。结果：应用该PCR反应体系，对4株O157菌株和14株非O157菌株扩增结果表明，O157菌株均扩增出预期的497bp片段，14株非O157菌株则为阴性。纯菌液检测灵敏度为60cfu／PCR反应，模拟混合菌液检测灵敏度为400cfu／PCR反应。结论：该方法用于肠出血性大肠杆菌O157的检测鉴定简便、快捷，具有很高的特异性和灵敏度，为O157的临床辅助诊断提供了有力手段。     

环介导等温扩增法应用于肠出血性大肠埃希菌O157:H7的检测

的仪器,非常适合基层检验部门及小型实验室与流行病学人员现场监测使用,具有较为广泛地应用前景.     

逆转录酶——聚合酶链反应检测肠道病毒

建立一种特异、敏感的检测肠道病毒的逆转录酶—聚合酶链(RT—PCR)方法。在肠道病毒RNA高度保守的5’端非编码区设计、选择、合成三对引物,采用RT—PCR对175株已知肠遭病毒和23份粪便标本进行检测。三对引物RT—PCR均显示高度特异性、敏感性。对23份粪便标本检测,E_1E_2引物有9份阳性,C_1C_2引物为7份阳性,P_1P_2均为阴性,与常规检测结果基本一致。这一检测方法具有较高特异性和敏感性,可用于临床快速检测肠遭病毒。     

食品标本处理方法对大肠埃希菌检出限影响

目的 研究快速、敏感、低成本的食品标本处理方法。方法 在牛肉馅中接种不同浓度的大肠埃希菌O157：H7，经离心、过滤，去除PCR抑制剂。浓缩菌株，用煮沸法和酶／冻融法裂解菌株，制备模板DNA。通过PCR检测大肠埃希菌O157：H7志贺毒素基因以评价该处理方法的可行性。结果 在未增菌条件下，PCR最低能检测到103CFU／g牛肉馅，增菌6h，最低能检测1CFU／g牛肉馅，整个检测过程只需要12h。结论 所采用的标本处理方法是一种灵敏、省时、低成本的方法，能显著地提高PCR检测食品标本中的大肠埃希菌O157：H7的灵敏度。