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1.
目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础.方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13 F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定.利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG 30%诱导4 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定.结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1 248 bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白. 相似文献
2.
目的克隆十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶(GST)AduGST-1基因,并在大肠埃希菌中表达获得重组AduGST-1。方法设计特异引物,以十二肠钩虫成虫cDNA为模板,通过PCR扩增AduGST-1基因。将获得的AduGST-1编码序列克隆至原核表达载体pETHF,构建重组表达质粒pETHF/AduGST-1。重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达、Ni亲和层析分离纯化重组AduGST-1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达及纯化情况。结果成功扩增到AduGST-1全长编码序列,并登记到GenBank(accession no.JQ812812)。AduGST-1编码序列长度为624bp,编码307个氨基酸残基。成功构建了重组表达质粒pETHF/AduGST-1,在BL21(DE3)中表达并纯化了重组AduGST-1。结论首次报道从十二指肠钩虫中分离到GST基因,该基因可在大肠埃希菌中高效表达,并分离纯化了重组GST蛋白,为进一步研究AduGST-1功能与应用奠定了基础。 相似文献
3.
目的 构建重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的原核表达质粒并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用RT-PCR法,从骨髓细胞总RNA中扩增获得人BMP-2成熟肽cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建BMP-2的重组原核表达质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western印迹和ELISA进行鉴定.结果 测序表明,重组基因序列与人BMP-2成熟肽基因完全一致.Western印迹和ELISA检测显示,表达产物的相对分子量(Mr)与预期结果相符,与相应抗体有结合活性.结论 获得了人BMP-2成熟肽的编码基因,并构建了含有该基因的重组质粒pBV220/BMP-2,在大肠埃希菌中可高效表达人BMP-2. 相似文献
4.
目的 构建志贺毒素1-A亚单位(Stxl-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以大肠埃希菌0157 DNA为模板扩增Stxl-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌B121(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶协鉴定和测序分析后证实构建成功.重组蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stxl-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带.结论 成功构建了pET32a( )/Stxl-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stxl-A蛋白,为进一步制备抗Stxl-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础. 相似文献
5.
目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致.为进一步的研究奠定了基础。 相似文献
6.
目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。 相似文献
7.
家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性 总被引:4,自引:0,他引:4
目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因,构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUCm-T/Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a( )和pGEX-4T-1,构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a(a )/Attacin和pGEX-4T-1/Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制,从pET30a( )/Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T-1/Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。 相似文献
8.
目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体. 相似文献
9.
目的构建含VLDL-R配体结合结构域融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达与纯化。方法利用PCR技术扩增LBR1-8的DNA片段,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,随后将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌Rosetta中,利用IPTG诱导蛋白表达并优化其表达条件,表达产物经Ni -NTA亲和层析柱纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR,酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主经过IPTG诱导成功表达了LBR1-8,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建pET28a( )-LBR1-8表达质粒,表达并经纯化得到了LBR1-8。 相似文献
10.
GE Yiyue CUI Lunbiao SHI Zhiyang JIAO Yongjun ZENG Xiaoyan QI Yuhua TANG Zheng SHAN Yunfeng WU Tao WANG Hua Microbiological Laboratory of Jiangsu Centers for Diseases Prevention Control Nanjing China 《医学分子生物学杂志》2008,(4)
目的构建志贺毒素1-A亚单位(Stx1-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值。方法以大肠埃希菌O157DNA为模板扩增Stx1-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。重组蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stx1-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带。结论成功构建了pET32a( )/Stx1-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stx1-A蛋白,为进一步制备抗Stx1-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
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人受精相关抗原-1的基因克隆及原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的为了阐明免疫性不孕不育的原因,检测血清中存在的抗精子抗体的种类,构建重组人受精相关抗原-1(recombinant human Fertilization antigen-1,rhFA-1)的原核表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。方法采用RT-PCR法,从人睾丸组织总RNA中扩增获得人FA-1的cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建人源性FA-1的重组原核表达质粒pBV220/FA-1。重组质粒经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌JM109并在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白。结果测序表明重组基因序列与人FA-1基因完全一致。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的相对分子量为14.6KDa与预期结果相符。结论获得了人FA-1的编码基因,并在大肠杆菌中表达了人的FA-1蛋白。 相似文献
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目的小鼠PD-1胞外段(ePD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆PD-1胞外段基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ePD-1,转化至E.coli DH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-ePD-1转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-ePD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的PD-1胞外段融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-ePD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-ePD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论成功地克隆、表达和纯化了小鼠ePD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴... 相似文献
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人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达。方法:以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中,扩增并克隆PD-L1的cDNA,构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果:克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列,经DNA测序证明其与已报道的序列一致。同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-LI胞外区基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。免疫印迹分析表明,在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白,相对分子质量(Mr)为25000,与理论值的大小相符。该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应。结论:成功地克隆PD-L1基因,其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达,为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件。 相似文献
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结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达 总被引:4,自引:0,他引:4
目的:构建结核分枝杆菌(MTB)lhp和基因原核表达载体并进行表达。方法:用PCR扩增MTB lhp基因,并克隆入pQE30质粒。测序正确后,再亚克隆入pET32a( )质粒,构建pQE30—CFP10和pET32a( )—CFP10重组体。结果:以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后,经IPTG诱导,pQE30—CFP10未表达目的蛋白;而pET32a( )—CFP10则表达出Mr为20000左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高:表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的38%,用Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化,获得纯度为93%的重组蛋白。结论:成功地构建原核表达载体pET32a( )—CFP10,并获得重组CFP10蛋白,为MTB重组抗原的应用奠定了基础。 相似文献
15.
BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定 总被引:2,自引:3,他引:2
目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。 相似文献
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目的:在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3,并鉴定其活性。方法:用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因,将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接,构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性;测序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L,构建pQE80L-scFv3重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,酶切鉴定。IPTG诱导表达蛋白后,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的抗体活性。结果:PCR扩增scFv3 DNA片段约为750 bp,与预期结果相同;克隆载体pGEM-scFv3酶切后显示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy质粒;测序验证插入片段全序列无改变;表达载体pQE80L-scFv3酶切图谱与预期相同;SDS-PAGE显示,在分子量约为27 kD处可见目的蛋白带,Western blot证实scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建并表达了抗GBM抗体的单链抗体scFv3蛋白,为进一步研究scFv3的生物学特性和基因工程抗体的制备奠定了基础。 相似文献
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目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础. 相似文献
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目的:在原核细胞中表达、纯化人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)E1蛋白并制备HPV-16 E1特异性抗体。方法:PCR扩增HPV-16 E1基因,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度与IPTG浓度优化HPV-16 E1蛋白可溶性表达的条件,并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下及足垫免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot检测血清效价和特异性。结果:酶切和测序结果表明HPV-16 E1基因已克隆入pMAL-p2x。经优化筛选出HPV-16 E1融合蛋白诱导表达的最佳条件为28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L。经麦芽糖亲和层析法纯化获得了HPV-16 E1可溶蛋白,纯度达到95.7%。West-ern blot检测证明制备的抗血清能与HPV-16 E1蛋白特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1∶640 000以上。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得了HPV-16 E1蛋白,该蛋白免疫新西兰白兔制备了高效价的HPV-16 E1蛋白抗血清,为HPV-16 E1功能研究提供了抗原和检测用抗体。 相似文献
19.
目的:构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段,并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中,实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论:成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24,并在E.coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白,为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。 相似文献
20.
目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。 相似文献