脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

目的:探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达,并观察其致瘤性。方法:使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞,用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化,通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后,用RT-PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达;收集培养后7d的MSCs,接种于裸鼠皮下,观察是否有增生物的出现,并观察细胞组织形态学变化。结果:脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形,诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34,CD11a和CD11b,强表达CD29,符合MSCs特征。诱导后,NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强(P<0.05),48h达高峰,然后逐渐减弱;细胞接种后12周,在裸鼠皮下不能形成肿瘤,与对照组相比,细胞形态学未出现恶性变化。结论:脐血中存在MSCs,分离后可以体外扩增,诱导后分化为神经元样细胞,并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。     

脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞（MSCs）。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT—PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞（NSCs）标志物巢蛋白（Nestin）及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CDllb，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强（P〈0．05），48h达高峰，然后逐渐减弱；细胞接种后12周．在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs，分离后可以体外扩增．诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。     

脐血单个核细胞体外培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达

目的:探讨人脐血单个核细胞(human cord blood monocytes,HCMNCs)培养增殖过程中的形态变化及诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达.方法:采用OLYMPUS倒置显微镜观察培养过程中HCMNCs形态的变化;RT-PCR方法鉴定MNCs用神经生长因子(NGF)和维甲酸(RA)诱导前后神经干细胞(neural stem cells,NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达.结果:HCMNCs培养前,胞体较小,呈均一的圆形;培养后,细胞胞体增大,有破骨样细胞和间质样细胞两种形态.破骨样细胞胞体较大,呈圆形,多个核.间质样细胞胞体呈较均一的长梭形,形态类似于骨髓MSCs,但较骨髓MSCs稍小.RT-PCR检测提示,诱导前HCMNCs中Nestin弱表达,Musashi-1无表达;诱导后两者均表达增强,之后逐渐减弱.结论:使用密度梯度离心法可以从脐血中分离得到具有多向分化潜能的HCMNCs,经过EGF和RA诱导后,神经干细胞标志表达一过性增强后减弱.     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

 【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养与扩增实验研究

目的探讨脐血来源的人间充质干细胞（HMSCs）在体外分离培养与扩增的可行性。方法在无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经复合枸橼酸钠抗凝,用相对密度为1．077g／L的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以30％胎牛血清进行培养和扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞接种于特定培养基后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,经传几代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达GD14、CD19,强表达CD105、CD44。结论来源于人脐血的MSCs在体外可以分离培养、扩增,为MSCs的进一步研究奠定基础。     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

刺五加体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 研究刺五加体外诱导骨髓基质细胞(MSCs ) 分化为神经元样细胞.方法 采用全骨髓贴壁筛选法分离培养MSCs.含刺五加的无血清DMEM/ F12 诱导MSCs 的分化.间接免疫荧光法、Western blot及RT-PCR检测巢蛋白(nestin)、β-Tubulin III及GFAP蛋白和mRNA的表达.结果 MSCs在体外传代扩增至第3代,CD44 、CD54表达阳性已达90%以上,而CD14表达阳性下降至2.37%.刺五加诱导后,MSCs胞体收缩,突起伸出,类似神经元;免疫荧光、Western blot及RT-PCR均显示刺五加诱导后的细胞nestin、β-Tubulin III蛋白和mRNA表达阳性,而GFAP表达阴性.结论 刺五加可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)体外扩增不同诱导剂向神经元样细胞诱导分化的潜能。方法：采用贴壁筛选法分离Wistar大鼠股骨rMSCs，体外扩增5-10代后，分别用2-巯基乙醇、硫代甘油等无血清的DMEM培养液诱导hMSCs分化为神经元。用流式细胞仪鉴定rMSCs特异抗原表达，免疫组化鉴定诱导后神经元样细胞的神经元烯醇化酶(NSH)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果：大鼠MSCs体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示rMSCsCD27、CD44、CD90呈阳性表达；将rMSC加入2-巯基乙醇和硫代甘油等诱导剂3h后，rMSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性，GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间充质干细胞在体外-定条件下可以分化为神经元样细胞。     

人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

目的 从脐血中获得间充质干细胞（MSC），探索体外诱导MSC向肝细胞分化的实验条件。方法 无菌采血，分离脐血单个核细胞。以贴壁培养法获得MSC，采用流式细胞术检测细胞表面标志。分别用联合诱导法(联合诱导组)以及阶段诱导法(阶段诱导组)诱导MSC向肝细胞分化。采用RT-PCR检测ALB、AFP及CK19mRNA的表达情况。结果 MSC呈长梭形，第三代（P4）后增殖较快。流式细胞术检测表明：CD29及CD44阳性，而CD34及CD45阴性。诱导6周后，联合诱导组无变化，而阶段诱导组细胞由长梭型变为不规则型，并检测到AFP mRNA的阳性表达,而未见ALB、CK19 mRNA的表达。继续诱导2周，检测到AFP、ALB、CK19 mRNA的表达。结论 脐血中的MSC对高密度、高血清的依赖性高。在体外，阶段诱导方法可将MSC诱导成肝细胞。     

Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells in vitro

INTRODUCTION The therapy of Parkinson’s disease is difficult, sopeople have been exploring more effective methods.Drugs can only treat symptoms of the diseases, andbrain tissue transplantation has been the most prosp-ective way, but the sources of transplantation cells needto be explored. The people have a new viewpoint ofthe central nervous system (CNS) regeneration andthe therapy of CNS diseases[1,2] because of the recentdiscovery of stem cell populations in CNS. But adultneura…     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。     

神经细胞特有分子在人脐血细胞中的表达

目的 :探讨神经细胞相关标志物nestin ,NF M及MAP2mRNA在脐血细胞中的表达情况。方法 :采用RT PCR方法对脐血单个核细胞进行检测。结果 :nestin ,NF M及MAP2mRNA表达在脐血单个核细胞中呈阳性。结论 :脐血单个核细胞中存在着神经干细胞     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法 体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果 两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论 BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血，分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC)，分别用B-巯基乙醇(B—ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6．7％、12．4％和20．8％。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36％，B—ME、DMSO分别为33％和25％。结论脐血MSC具有神经干／祖细胞的特性，在一定条件下能向神经元样细胞分化。