缺氧预适应小鼠脑组织中缺氧诱导因子-1的表达

为探讨缺氧诱导因子 1 (HIF 1 )在缺氧预适应小鼠脑组织中的表达 ,用Western印迹法检测慢性缺氧 (H)和不缺氧 (C)HeLa细胞、急性重复性缺氧 0次 (H0 )、1次 (H1)、4次 (H4 )小鼠脑组织中的HIF 1α。结果 :慢性缺氧HeLa细胞中可检测到较多的HIF 1α,H0 组脑组织中检测不到HIF 1α ,H1组检测到微量HIF 1α,H4 组检测到较多HIF 1α。结果显示 :脑组织中HIF 1α的含量随缺氧预适应的产生而逐步增加 ,提示HIF 1可能参与缺氧预适应的形成。     

缺氧通过HIF-1α/PCSK9信号途径诱导神经细胞凋亡

目的研究缺氧是否通过上调缺氧诱导因子1α(HIF-1α)水平而调控前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)表达并诱导神经细胞凋亡。 方法分别用0、125、250、500 μmol/L氯化钴(CoCl₂)处理PC12细胞,蛋白印迹法检测其PCSK9及HIF-1α表达;Hoechst33258核染色及流式细胞术检测CoCl₂对PC12细胞凋亡的影响。用250 μmol/L CoCl₂处理PC12细胞0、6、12、24 h,蛋白印迹法检测其PCSK9及HIF-1α表达。不同浓度HIF-1α激动剂二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)或HIF-1α抑制剂利非西呱(YC-1)处理PC12细胞24 h,检测PCSK9、HIF-1α、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9的表达及对PC12细胞凋亡的影响。PC12细胞经PCSK9 siRNA转染后与250 μmol/L CoCl₂孵育,检测对PC12细胞凋亡的影响及PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达。 结果PCSK9、HIF-1α的表达及细胞凋亡程度呈CoCl₂浓度与时间依赖性增高。PC12细胞中HIF-1α和PCSK9的表达呈DMOG浓度依赖性增高,Caspase-3、Caspase-9表达及PC12细胞凋亡率呈DMOG浓度依赖性降低;PC12细胞中HIF-1α和PCSK9的表达呈YC-1浓度依赖性降低,Caspase-3、Caspase-9表达及PC12细胞凋亡率呈YC-1浓度依赖性升高。与空白组及无义RNA组比较,PCSK9 siRNA转染组Caspase-3、Caspase-9表达减少,凋亡程度降低。 结论细胞缺氧状态下HIF-1α水平的增高能上调PCSK9表达并调控神经细胞凋亡。     

氯化钴预处理对缺氧预适应小鼠海马组织HIF-1α表达的影响

目的检测氯化钴预处理后小鼠海马组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在急性重复氧过程中的变化及其可能的机制。方法用数字表法将Balb/C小鼠随机分为氯化钴实验组和生理盐水对照组,2组动物分别在实验前3 h注射氯化钴和生理盐水,进行0次(H0)、1次(H1)、4次(H4)缺氧暴露,随即分别取海马组织,用Western blot及EMSA法检测HIF-1α蛋白质含量及HIF-1 DNA结合活性。结果生理盐水预处理后,小鼠的缺氧耐受时间逐次显著递增;氯化钴预处理后缺氧耐受时间恒定增高。氯化钴预处理H0、H1、H4组海马组织的HIF-1α蛋白质含量差异未见统计学意义,但HIF-1 DNA结合活性在H1组升高、H4组降低。生理盐水预处理组海马组织的蛋白质含量及HIF-1 DNA结合活性在H0、H1、H4组均依次增加。结论氯化钴预处理能显著增强小鼠对缺氧的耐受能力、激活海马组织中的HIF-1,但其分子机制可能与急性重复缺氧暴露增强缺氧耐受力的机制不同。     

急性重复性缺氧小鼠脑组织中儿茶酚胺类神经递质含量变化的研究

用高效液相-电化学检测器测定急性重复性缺氧小鼠脑组织中DOPA、DA、NE和Ep等儿茶酚胺类物质的含量。结果发现:与空白对照组(A组)比较,缺氧1次的实验对照组(B组)及急性重复缺氧4次实验组(C组),随缺氧次数增加,小鼠脑组织中的DA含量显着上升(P<0.01),NE、DOPA含量明显降低(P<0.05或<0.01);A组与急性重复4次缺氧后饲养2d的实验对照组(D组)小鼠脑组织中儿茶酚胺类含量接近,没有统计学意义(P=23.77).结果提示脑组织中儿茶酚胺类物质可能参与急性重复缺氧小鼠的耐缺氧能力的形成,而且是一个可逆的快反应。     

缺氧时乳腺癌细胞HIF-1α与CXCR4表达及迁移调控的实验研究

目的探讨缺氧时乳腺癌细胞缺氧诱导因子HIF-1α(HIF-1α)与趋化因子4(CXCR4)的表达及其对乳腺癌细胞迁移调控的影响。方法将MDA-MB-231乳腺癌细胞置入缺氧盒中,建立3%缺氧微环境,设为缺氧24 h组及缺氧48 h组,对照组为正常培养的乳腺癌细胞;采用MTT法测定乳腺癌细胞的增殖能力,RT-PCR法检测HIF-1α与CXCR4mRNA表达量,同时检测添加维生素C(Vit C)后HIF-1α与CXCR4mRNA的mRNA表达水平:Transwell小室测定各组细胞的迁移能力。结果与对照组比较,缺氧24、48 h组细胞增殖能力明显增加;缺氧24h组、缺氧48 h组HIF-1α、CXCR4 mRNA表达和细胞的迁移能力明显高于对照组(P<0.05);缺氧24 h+Vit C组、缺氧48 h+Vit C组HIF-1α、CXCR4 mRNA表达和细胞的迁移能力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧能增加细胞的增殖能力,能增加乳腺癌细胞HIF-1α、CXCR4mRNA表达和迁移能力,但能被抗氧化剂Vit C有效阻断,提示HIF-1α可望成为抑制乳腺癌转移的治疗靶点。     

HIF-1α表达在新生大鼠缺氧/缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡中的作用

目的 探讨缺氧缺血性脑损伤时缺氧诱导因子la(HIF-1a)表达及其与神经元凋亡的关系.推测HIF-1α在神经元凋亡中所起的作用.方法 10日龄SD大鼠分为假手术组、单纯缺氧组和缺氧缺血组,在缺氧后4、8和24 h处死取脑.免疫组织化学方法检测HIF-1α、凋亡标志蛋白activated caspase-3的表达,TUNEL法检测凋亡细胞,HE染色观察脑组织病理改变.结果 单纯缺氧组和缺氧缺血组HIF-1α的表达趋势相似,予缺氧后4 h升高,8 h达到高峰,24 h后下降.Activated caspase-3在两组中的表达趋势也相似,于缺氧后4 h、8 h有少量表达,24 h明显升高,TUNEL染色显示缺氧后随着时间的延长凋亡细胞数逐渐增多,24 h时明显增高.HE染色显示单纯缺氧和缺氧缺血组神经细胞有不同程度的损伤,24 h时细胞损伤程度重,细胞溶解缺失明显.对同一时间点的上述指标进行比较,单纯缺氧组HIF-1α表达高于缺氧缺血组(P<0.05),activated caspase-3表达、TUNEL阳性细胞及细胞损伤程度则低于缺氧缺血组(P<0.05).结论 缺氧缺血脑损伤时,HIF.1α表达与activated caspase.3表达趋势相反,HIF-1α表达量与损伤程度呈反相关关系.推测HIF-1α可能对神经元有保护作用.     

缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对PC12细胞的影响

为研究缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对PC1 2细胞的影响 ,在PC1 2细胞培养液中加入缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液及其去蛋白提取液 ,检测缺氧 2 4h和 4 8h后PC1 2细胞LDH和MTT代谢的变化。结果发现 ,未去蛋白的脑匀浆组PC1 2细胞活性显著增加 ,而去蛋白组细胞活性未见显著变化。提示预适应脑组织中有某种或某些蛋白质类神经保护性物质生成     

缺氧对食管癌Eca109细胞系HIF-1α和VEGF表达及放射敏感性的影响

目的观察化学缺氧剂二氯化钴(CoCl2)诱导缺氧条件下,Eca109食管癌细胞中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的变化,并观察缺氧对放射敏感性的影响。方法CoCl2用于建立Eca109食管癌细胞体外缺氧培养模型,并设对照组(CoCl2浓度为0μmol/L)。观察缺氧培养不同时相(0、8、16、24h)Eca109细胞HIF-1α和VEGF的表达及对放射敏感性的影响。反转录聚合酶链反应方法检测HIF-1α和VEGF mRNA的转录水平,免疫印迹实验(WesternBlot)检测HIF-1α和VEGF蛋白表达情况。集落形成实验观察细胞的放射敏感性。结果逆转录聚合酶链反应检测HIF-1α和VEGF mRNA结果显示,CoCl2缺氧处理后(0、8、162、4 h),HIF-1α和VEGF mRNA表达增加;但随着缺氧时间的延长(8、16、24 h),HIF-1αmRNA的表达没有明显改变(P>0.05);VEGF mRNA转录在缺氧培养8、162、4 h后显著升高,且不同时间组间存在显著性差异(P<0.05)。Western Blot检测结果显示,缺氧处理后HIF-1α和VEGF蛋白表达显著提高(P<0.05)。克隆形成实验结果显示,照射4Gy后,缺氧加放射组、单纯放射组细胞存活分数分别为48.3%和21.7%(P<0.05)。结论食管癌细胞系Eca109在缺氧条件下,HIF-1α和VEGF蛋白表达上调,放射敏感性降低。     

下调HIF-1α/PLOD2信号通路对缺氧肾透明细胞癌786-0和ACHN细胞株增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨缺氧条件下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)影响肾透明细胞癌（ccRCC）细胞迁移、侵袭和增殖的机制。方法 体外培养人ccRCC细胞,分为正常对照组（NG组）、缺氧组（Hypoxia组,1%O2）和缺氧+HIF-1α抑制剂组（Hypoxia+PX-478组,55μmol·L-1/45μmol·L-1）。用CCK-8法检测细胞活力;用Western blot实验检测各组ccRCC细胞中HIF-1α、2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2)蛋白表达量;用细胞划痕实验检测ccRCC细胞迁移能力;用Transwell实验检测ccRCC细胞迁移、侵袭能力;用克隆形成实验检测ccRCC细胞增殖能力。结果 HIF-1α抑制剂加入后的细胞活力降低,且随着药物浓度升高而降低;与NG组相比,Hypoxia组HIF-1α、PLOD2蛋白表达量均增加（P均<0.05）,与Hypoxia组相比,Hypoxia+PX-478组HIF-1α、PLOD2蛋白表达量发均降低（P均<0.05）;与NG组相比,Hypoxia组ccRCC细胞786-0的迁移、侵袭和增殖能力均提高（P均<0.01）,...     

缺氧预适应对小鼠海马脑片LTP的影响

目的:观测缺氧预适应对小鼠海马脑片LTP的影响.方法:小鼠缺氧0次(H0)、1次(H1)、4次(H4)后取海马组织,制备成离体海马脑片,刺激海马CA3区Schaffer侧枝,在CA1锥体细胞层记录各组LTP.结果:H1组海马CA1区LTP诱出率最低,H0、H4组诱出率均高于H1组.H0和H4组小鼠海马脑片在高频强直串刺激后PS增幅的百分率和fEPSP斜率增幅的百分比变化均显著高于H1组(P＜0.01).H0组与H4组差异无统计学意义(P＞0.05).结论:缺氧抑制LTP的诱导,缺氧预适应可以恢复对LTP的诱导,突触可塑性的变化可能参与缺氧预适应小鼠脑保护.     

抑制低氧诱导因子-1α对PC12细胞存活的影响

目的通过抑制低氧诱导因子-1α转录活性,研究低氧诱导因子-1α在低氧诱导的细胞死亡中的作用。方法①将PC12细胞接种于12孔板,在20%常氧和3%低氧环境中培养24 h,在光镜下拍照并应用计数方法记录PC12细胞的生长情况。②将PC12细胞接种于96孔板,在常氧和低氧环境中培养24 h后,用细胞活力检测剂(a novel tetrazolium compound,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt,MTS)检测PC12细胞的生长情况。③在常氧和低氧条件下分别用5 nmol/L、50 nmol/L、500 nmol/L的低氧诱导因子-1α抑制剂棘霉素处理PC12细胞24 h和48 h后,用MTS法检测细胞活力。结果①细胞计数和MTS法检测细胞活力的结果均显示3%的低氧条件可明显诱导PC12细胞死亡。②不同浓度的低氧诱导因子-1α抑制剂棘霉素处理PC12细胞24 h之后,低氧和常氧的细胞活力没有显著区别。③不同浓度的低氧诱导因子-1α抑制剂棘霉素处理PC12细胞48 h之后,低氧不再促进细胞死亡,相反,低氧条件处理的细胞活力明显好于常氧。结论低氧会促使PC12细胞死亡,棘霉素抑制HIF-1α的转录活性24 h后,低氧对PC12细胞的促死亡作用减弱;48 h后,低氧组的细胞活力还可超过常氧组。这表明,低氧下过量的HIF-1α转录激活对细胞是有害的。     

低氧环境下西尼地平抑制HIF-1α下调宫颈癌HeLa细胞VEGF表达的研究

目的 探讨西尼地平能否在低氧环境下,通过抑制HIF-1α下调宫颈癌HeLa细胞VEGF的表达.方法 将HeLa细胞分为常氧组（Normoxia组）、低氧环境组（Hypoxia组）、低氧环境＋3μM西尼地平组（Hypoxia＋3μM Cilnidipine组）和低氧环境＋30μM西尼地平组（Hypoxia＋30μM Cilnidipine组）.在低氧环境（1% O2、5% CO2和94% N2）下,对Hypoxia＋3μM Cilnidipine组和Hypoxia＋30μM Cilnidipine组细胞使用西尼地平（3μM和30μM）干预,在干预后不同时间点（0、24、48和72 h）使用MTT法对HeLa细胞活性进行测定;在干预72h后,使用RT-PCR法对细胞表达的VEGF和HIF-1α mRNA进行测定,使用Western blot法对细胞表达的VEGF和HIF-1α蛋白进行测定.结果 在低氧环境下,西尼地平干预后,HeLa细胞的细胞活性呈时间和剂量依赖性降低（P均〈0.05）;在干预72 h后,细胞VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平较未干预细胞降低并呈剂量依赖性（P均〈0.05）.结论 在低氧环境下,西尼地平可能是通过抑制HIF-1α的表达下调HeLa细胞VEGF的表达,导致肿瘤的增殖能力降低.     

HIF-3α在线粒体的表达及意义

  目的  探究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)定位至线粒体的现象及其生理、病理意义。  方法  ① 低氧(1%O₂)或脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)、氯化钴(CoCl₂)模拟低氧处理人宫颈癌细胞系HeLa和人肾癌细胞系ACHN后,蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光(IF)检测HIF-3α在细胞中的分布及其在线粒体中的表达;②通过酶敏感实验观察HIF-3α的线粒体亚结构定位;③采用Western blot检测HIF-3α在正常小鼠不同器官组织、人肝癌组织线粒体中的表达情况。  结果  ① 在检测的2种细胞系(HeLa和ACHN细胞)中,HIF-3α在常氧及缺氧条件下均可定位至线粒体,且缺氧组HIF-3α在线粒体中的表达高于常氧组;②HIF-3α的消化模式与线粒体外膜蛋白一致;③HIF-3α在小鼠多种器官组织中均可定位线粒体,HIF-3α在人肝癌组织线粒体中的表达高于正常及癌旁组织。结论HIF-3α在常氧及缺氧条件下均可定位至线粒体外膜,低氧可促进其线粒体定位;该现象可能与肝癌的发生发展相关。     

低氧对帕金森病模型大鼠脑内神经干细胞的影响

目的观察间歇性低氧对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁大鼠脑内神经干细胞增殖和分化的影响。方法应用6-OHDA损毁大鼠内侧前脑束。将损毁大鼠每天置于气压0.3 Mpa的低氧环境中4 h,持续2周。分别在低氧2周和低氧2周、复氧2周时进行动物行为学测试,并切片染色鉴定新生细胞增殖和分化情况。结果低氧未对损毁大鼠行为学产生影响。免疫学鉴定显示,低氧可促进脑内原位神经干细胞的增殖,新生细胞主要出现在脑室下层。这些增殖的神经干细胞分化能力弱,未见向神经元和胶质细胞分化;在损毁的纹状体脑区,也未见新生细胞向酪氨酸羟化酶阳性的多巴胺能神经元分化。结论间歇性低氧可以激活成体脑内神经干细胞的增殖,但不足以诱导新生细胞分化,并形成特定神经元表型,提示单纯的损伤因素不能诱导特定神经元的分化。如果联合其他因素如神经营养因子等,可能有利于成体神经干细胞的定向分化,并应用于相应疾病的治疗。     

组织缺氧在黄体形成过程中的作用

黄体是雌性动物生殖周期中形成和退化的一种暂时性的内分泌组织,由排卵后残留的卵泡组织发育而来,这一过程与血管的快速增生密切相关。血管内皮生长因子(VEGF)是调节血管增生过程的最重要的刺激因子,在新生黄体形成中同样具有重要调节作用。VEGF受缺氧诱导因子(HIF)-1α亚单元和β亚单元组成的异二聚体转录因子HIF-1调控。由于卵巢卵泡的破裂排卵以及新生血管网的缺乏,导致卵巢局部处于缺氧状态,诱导了HIF-1α表达的增加,并通过VEGF依赖性血管增生参与新生黄体的形成过程。本文主要从排卵前与排卵后卵巢局部缺氧情况阐述黄体形成过程中卵巢功能与组织结构的变化情况,旨在进一步理解缺氧在黄体形成与卵巢生理调节中的重要作用。     

二氯化钴所致缺氧对A549细胞增殖抑制和凋亡的影响

目的:探讨CoCl2作用不同时间所致缺氧对体外培养的人肺腺癌A549细胞株增殖、凋亡和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响。方法:对肺腺癌细胞A549分别进行常氧和氯化钴模拟缺氧培养,采用MTT法检测CoCl2作用不同时间所致缺氧对A549细胞增殖的影响;半定量RT-PCR法测定缺氧不同时间HIF-1αmRNA表达水平的变化。AnnexinV-FITC/PI双标记染色,流式细胞术检测CoCl2作用不同时间缺氧肿瘤细胞凋亡情况。结果:CoCl2对A549细胞增殖抑制作用表现出时间依赖性抑制作用。常氧条件下的A549细胞即有一定水平的HIF-1αmRNA的表达,随着CoCl2作用时间的延长,HIF-1αmRNA水平呈升高趋势,与正常对照组比较,各缺氧组差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组、CoCl2作用4、12、24、48 h组细胞凋亡率分别为(0.60±0.10)%、(1.10±0.10)%、(8.63±0.75)%、(12.80±0.85)%和(19.33±0.80)%。结论:CoCl2对A549细胞具有上调HIF-1αmRNA表达作用,可抑制细胞的增殖和一定的凋亡诱导作用,这些说明HIF-1α可能在肺癌的发展中扮演着重要的作用。     

缺氧影响PTEN磷酸化和核定位

目的观察缺氧(hypoxia)对第10号染色体缺失并与张力蛋白同源的磷酸酶(phosphatase and tension homolog deleted onchromosome ten,PTEN)磷酸化及核定位的影响。方法以1%O2条件下培养的COS-7细胞为缺氧模型,在缺氧处理不同时间点0、1、8、24、32 h收集细胞,应用Western blotting方法检测PTEN磷酸化水平及其下游信号分子磷酸化蛋白激酶B(phosphorylatedprotein kinase B,p-Akt)的表达变化;分别应用细胞核、质分离技术,共聚焦显微镜观察缺氧24 h前后PTEN亚细胞定位的变化。结果 COS-7细胞缺氧处理24 h与未缺氧对照细胞相比,PTEN磷酸化水平显著降低,p-Akt亦明显减少;细胞核中PTEN表达量则显著升高。结论 PTEN磷酸化水平和核质分布受到细胞缺氧的调节。在细胞缺氧反应中,PTEN去磷酸化而活化,通过抑制其下游分子Akt磷酸化,从而抑制缺氧诱导的细胞增殖信号通路活化;并且部分入核发挥核内PTEN功能。     

低氧抑制人脐静脉血管内皮细胞miR-26a的表达

目的 观察低氧对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）miR-26a及PTEN/AKT/VEGF通路相关因子表达的影响。方法 分常氧组和低氧组培养48h。荧光定量RT-PCR和Western blot法检测miR-26a及PTEN/AKT/VEGF通路相关因子的表达。结果 RT-PCR结果显示低氧组HUVEC中miR-26a和PTEN的相对表达量为0.42±0.02和0.62±0.03,显著低于常氧组的1.00±0.34和1.00±0.35（P<0.05）。Western blot法检测结果显示,与常氧组相比,乏氧组HIF-1、VEGF和AKT蛋白表达明显升高,PTEN 蛋白明显降低（P<0.05）。结论 低氧抑制HUVEC miR-26a的表达并继发下游PTEN/AKT/VEGF因子的序贯反应,可作为创面改善缺血状态治疗的新靶点。     

Hypoxia Down-regulates Secretion of MMP-2, MMP-9 in Porcine Pulmonary Artery Endothelial and Smooth Muscle Cells and the Role of HIF-1

Summary： Primary cell culture, techniques of gene transfection, gelatin zymography, and Western blot were used to investigate the effect of hypoxia on the secretion of MMP 2 and MMP-9 in pulmonary artery endothelial cells （PAEC） and smooth muscle cells （PASMC）, and the role of HIF-1. Our results showed that （1） after exposure to hypoxia for 24 h, the protein content and activity of MMP-2 in the PAEC medium as well as these of MMP-2 and MMP-9 in PASMC medium （P〈0. 01 ） decreased significantly in contrast to those in normoxic group （P（0.05） ; （2） after transfection of wild type EPO3＇ enhancer, a HIF-1 decoy, the content and activity of MMP 2 and MMP-9 in hypoxic mediums became higher than those in normoxic group （P〈0. 01）, while transfection of mutant EPO3＇-enhancer didn＇t affect the hypoxia-induced down-regulation. It is concluded that hypoxia could inhibit the secretion and activity of MMP 2 and MMP-9 in PAEC and PASMC, which could he mitigated by the transfection of EPO3 ＇-enhancer and that H1F-1 pathway might contribute to hypoxia-induced down regulation of MMP-2 and MMP-9.