Toll样受体4与脑出血的研究进展

<正>脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,是临床上常见的急性危重病[1]。ICH常导致血肿部位及其周围组织水肿、缺氧,发生细胞凋亡、炎症反应等一系列继发性损伤[2],而炎症反应又可加重脑水肿,使病情进一步恶化。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)作为一种模式识别受体,能启动和放大炎症反应,与     

超声靶向微泡破裂技术联合shRNA质粒沉默Toll样受体4基因

目的 Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4表达水平与脑缺血合并高血糖后的痫性发作及脑梗死预后相关,本文探讨超声靶向微泡破裂(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)联合短发夹核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid,sh RNA)干扰技术沉默TLR4的可行性和应用价值。方法将32只实验用Wistar大鼠分为4组:空白对照组(NS)、裸质粒组(P)、质粒联合超声辐照组(P+UTMD)、质粒与Sono Vue联合超声辐照组(P+S+UTMD),每组各8只。裸质粒组注入质粒,质粒联合超声辐照组注入质粒行超声辐照,质粒与Sono Vue联合超声辐照组侧脑室注入质粒和Sono Vue微泡并行超声辐照,处理4 d后每组取5只大鼠行Western Blot检测大脑TLR4蛋白表达,取3只大鼠行免疫组织化学染色。结果质粒联合超声辐照组和质粒与Sono Vue联合超声辐照组抑制效果明显(P+S+UTMD:0.223±0.009,P+UTMD:0.277±0.013,t1,3=4.900,P0.01;t1,4=8.779,P0.01),裸质粒组与空白对照组差异无显著性(NS:0.351±0.030,P:0.339±0.034,t1,2=0.590,P0.05),而质粒与Sono Vue联合超声辐照组与质粒联合超声辐照组相比抑制效果更好(P+S+UTMD:0.223±0.009,P+UTMD:0.277±0.013,t3,4=7.006,P0.05)。免疫组织化学的平均光度值分析显示,质粒联合超声辐照组和质粒与Sono Vue联合超声辐照组抑制效果明显(P+S+UTMD:0.026±0.0013,P+UTMD:0.058±0.0014,t1,3=8.334,P0.01;t1,4=21.027,P0.01),裸质粒组与空白对照组差异无显著性(NS:0.079±0.0048,P:0.077±0.0012,t1,2=0.797,P0.05),而质粒与Sono Vue联合超声辐照组与质粒联合超声辐照组相比抑制效果更好(P+S+UTMD:0.026±0.0013,P+UTMD:0.058±0.0014,t3,4=33.254,P0.05)。结论超声微泡造影剂联合sh RNA质粒可高效稳定沉默TLR4基因。     

小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒载体的构建及体外研究

目的为探讨TNF-α在C型Niemann-Pick病（NPC）神经变性中的作用,构建携带小鼠TNF-α-siRNA的慢病毒载体并进行体外研究。方法设计3个TNF-α-siRNA序列和1个无关对照序列,克隆到酶切的pSIH1-H1-copGFP siRNA载体;重组质粒转染293T细胞,通过实时定量PCR检测筛选出干扰效果最佳的TNF-α-siRNA;筛选出的pSIH-siRNA、pSIH-negative分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成慢病毒;慢病毒感染BV-2细胞和星形胶质细胞,采用RT-PCR以及Elisa检测TNF-α-siRNA的沉默效果。结果成功构建携带TNF-α-siRNA的慢病毒载体,滴度达2×10^8ifu／L;慢病毒感染BV-2和星形胶质细胞,表达GFP且可下调TNF-α表达。结论TNF-α-siRNA能明显下调TNF-α的表达,为研究和治疗神经变性疾病以及TNF-α相关疾病提供了有力的工具。     

Toll样受体4及小胶质细胞在帕金森病中的作用

目的探讨Toll样受体4(TLR4)及小胶质细胞在帕金森病(PD)中的作用。方法将48只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)组和TLR4抗体+MPTP组(TLR4抗体组)。用腹腔注射MPTP法制作PD小鼠模型。免疫组织化学法检测TLR4及CD11b的阳性细胞表达数,RT-qPCR法检测小鼠纹状体内TLR4 mRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达。结果正常对照组、MPTP组及TLR4抗体组TLR4阳性细胞及CD11b阳性小胶质细胞数量差异有统计学意义(F=331. 758,F=131. 856;均P 0. 001)。MPTP组TLR4、CD11b阳性细胞数最高,对照组最低,三组间两两比较差异有统计学意义(均P 0. 001)。正常对照组、MPTP组及TLR4抗体组小鼠中脑TLR4 mRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达量差异有统计学意义(F=36. 385,F=299. 599,F=40. 191;均P 0. 001)。MPTP组TLR4 mRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达量最高,对照组最低,三组间两两比较差异有统计学意义(P 0. 05～0. 01)。结论 MPTP诱导的PD模型CD11b阳性细胞和炎症因子的表达明显上调,而这些上调可以通过TLR4特异性抗体部分阻断。TLR4及小胶质细胞与PD的神经炎症过程密切相关。     

Toll样受体4在乙醇所致的小胶质细胞激活中的作用

滥用乙醇可以导致脑损害以及神经系统退行性变,但是其对脑损害的神经性炎性反应方面机制的研究还不明确。近年相关研究结果显示小胶质细胞作为中枢神经系统的主要炎性细胞,在乙醇所致的神经性炎性反应中作用非常重要。Toll样受体4(TLR4)是固有免疫系统中的一个重要模式识别受体,在脑损害和神经系统退行性变中起到重要作用。乙醇通过TLR4信号通路激活小胶质细胞,诱导炎性反应介质释放和细胞死亡而导致脑损害,抑制TLR4信号通路可能对减轻乙醇所致的神经性炎性损害具有重要意义。本文对Toll样受体4在乙醇所致的小胶质细胞激活中的作用做一综述。     

Toll样受体4介导的MyD88信号通路在脑缺血损伤中的作用

脑缺血损伤发生机制十分复杂,目前有多种相关学说,大量研究表明炎症反应是脑缺血损伤主要机制之一,然而炎性瀑布反应触发后更加剧了脑损伤的发展,其中炎性受体发挥了重要作用。研究表明Toll样受体4(TLR4)在脑缺血的发生、发展和继发性脑损伤中起重要作用,髓样分化因子88(MyD88)是TLR4信号转导通路中关键的衔接蛋白,能够启动下游炎性因子的转导。对TLR4介导的MyD88信号通路在脑缺血损伤中的作用进展做一综述。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建*

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

Toll样受体4信号通路对脑缺血损伤影响的研究进展

Toll样受体4(TLR4)可以调节固有及获得性免疫反应应答,在多种疾病的发展机制中具有至关重要的作用。研究发现TLR4可通过多种途径参与脑缺血损伤,例如炎症反应、细胞凋亡、高迁移率族蛋白B1、热休克蛋白60、S100A蛋白、缺血预处理等。文中就TLR4对脑缺血损伤的作用机制研究做一综述。     

Toll样受体4与癫痫

Toll样受体4(TLR4)是最早发现的Toll样受体,主要识别细菌细胞壁成分脂多糖(LPS),在免疫应答和炎症反应中起重要作用。目前认为有髓样分化蛋白88(MyD88)依赖性和MyD88非依赖性两条途径参与了TLR4的信号转导。近年来研究发现TLR4及其介导的信号转导参与了癫痫的发生及发展,对癫痫的发病机制与TLR4及其信号传导通路之间联系的深入研究,可能会为癫痫的临床治疗带来新的思路及新的突破点。     

Toll样受体-4依赖的信号转导通路在阿尔茨海默病发病中的作用

Toll样受体(TLRs)是生物进化过程中高度保守的一个跨膜蛋白受体家族,可特异性识别病原相关分子模式(PAMPs)。其中Toll样受体-4(TLR-4)是哺乳动物TLRs家族中首个被发现的成员。近年来,TLR-4依赖的信号转导通路在以阿尔茨海默病(AD)为代表的神经系统变性疾病发病机制中的作用日益受到关注,本文即针对TLR-4依赖的信号转导通路在AD发病过程中的作用作一综述。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。 目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA干扰慢病毒载体。 方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定*☆

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA（shRNA）表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应（PCR）和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。     

靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立

目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA（miRNA）的重组干扰质粒pcDNA^TM6.2-GW/miR和阴性对照质粒pcDNA6^TM6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数（MOI）值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值。结果聚合酶链反应（PCR）提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72 h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04。不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（24 h:p=0.002,0.015;48 h:p=0.030,0.012;72 h:p=0.018,0.010）;但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点（24、48和72 h）SH-SY5Y细胞内pH值差异无统计学意义（p=0.762）。结论最佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具。     

RNA interference targeting Akt promotes apoptosis in hypoxia-exposed human neuroblastoma cells

Overactivation of the PI3 kinase/Akt pathway plays an essential role in the development and progression of various tumors. Akt is a key component of this pathway and hyperactivated in different tumors including neuroblastoma and glioma. In the present study, we tested the therapeutic efficacy of siRNA targeting Akt in inducing apoptotic cell death in NBFL cells (a human neuroblastoma cell line) subjected to anoxia/reoxygenation (A/R), a process that has been shown to modulate growth and progression of malignant tumors. We observed that siRNA targeting Akt effectively induced apoptotic cell death in NBFL cells (as determined by TUNEL assay and activated caspase-3 immunoreactivity) under normoxic conditions, an effect that was greatly enhanced under conditions of A/R. These findings underscore the importance of Akt signaling in promoting survival of neuroblastoma cells and may have potential therapeutic applications.     

RNA干扰对大鼠脑内水通道蛋白4表达的影响研究

目的探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)对大鼠脑内水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)表达的抑制作用。方法构建特异性抑制AQP4表达的短发夹环质粒载体AQP4RNAi pGenesil-2。Wistar成年大鼠80只随机分为假手术组、脂质体组、对照质粒组和AQP4RNAi组(n=20),采用右侧脑室给药的方法分别于术后2、5、7、15d进行一般情况观察,对双侧大脑半球、脑干和小脑进行光、电镜检查,运用免疫荧光和原位杂交方法分别检测AQP4蛋白和mRNA的表达。结果脑室内注入AQP4短发夹环质粒载体后大鼠的精神、运动、行为未见明确异常,光、电镜病理检查发现神经元和胶质细胞形态、分布和脑室的形态结构与假手术组相比未见明显改变。AQP4蛋白和mRNA的表达呈进行性减少,至术后第7天,分别减少62.75%±3.6%和63.65%±2.35%。结论短发夹环AQP4RNAi质粒载体能有效减少脑内AQP4的表达,对中枢神经的功能无明显影响。     

Interactive role of the toll-like receptor 4 and reactive oxygen species in LPS-induced microglia activation

Microglia are activated by lipopolysaccharide (LPS) to produce neurotoxic pro-inflammatory factors and reactive oxygen species (ROS). While a multitude of LPS receptors and corresponding pathways have been identified, the detailed mechanisms mediating the microglial response to LPS are unclear. Using mice lacking a functional toll-like receptor 4 (TLR4), we demonstrate that TLR4 and ROS work in concert to mediate microglia activation, where the contribution from each pathway is dependent on the concentration of LPS. Immunocytochemical staining of microglia in neuron-glia cultures with antibodies against F4/80 revealed that while TLR4(+/+) microglia were activated the low concentration of 1 ng/ml of LPS, TLR4(-/-) microglia exhibit activated morphology in response to LPS only at higher concentrations (100-1,000 ng/ml). Additionally, tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) was only produced from higher concentrations (100-1,000 ng/ml) of LPS in TLR4(-/-) enriched microglia cultures. Diphenylene iodonium (DPI), an inhibitor of NADPH oxidase, reduced TNF-alpha production from TLR4(-/-) microglia. The influence of TLR4 on LPS-induced superoxide production was tested in rat enriched microglia cultures, where the presence or absence of serum failed to show any effect on the superoxide production. Further, both TLR4(-/-) and TLR4(+/+) microglia showed a similar increase in extracellular superoxide production when exposed to LPS (1-1,000 ng/ml). These data indicate that LPS-induced superoxide production in microglia is independent of TLR4 and that ROS derived from the production of extracellular superoxide in microglia mediates the LPS-induced TNF-alpha response of both the TLR4-dependent and independent pathway.     

Nurrl基因shRNA表达载体的构建及其鉴定

目的构建针对小鼠核受体相关因子1(Nurr1)的短发夹RNA(shRNA)表达载体,为进一步体内外研究Nurr1基因的功能奠定基础。方法选择两段RNA干扰靶序列,在体外分别合成两段互补的寡核苷酸,退火后与线性化的pSilenCirele质粒连接、转化感受态细胞DH5α,扩增、纯化得到所需质粒,通过酶切后琼脂糖电泳以及基因测序鉴定其分子量及插人片段的序列。结果纯化质粒的大小为4．6kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。结论成功构建了针对:Nurr1基因的shRNA的表达载体。     

RNA干扰及其在胶质瘤基因治疗中的应用

RNA干扰（RNA interference。RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）降解特异性靶基因转录出的mRNA。从而抑制靶蛋白表达的现象。自从二十世纪九十年代发现RNAi这一现象以来，RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。随着分子生物学、分子遗传学等学科的发展．发现了许多与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因。经过大量临床前期试验表明，针对特异性靶基因的小干扰RNA（short／small interfering RNA．siRNA）治疗胶质瘤是行之有效的。为基因治疗胶质瘤提供了新的思路。[第一段]