三种肾综合征出血热诊断方法的比较

目的探索一种更为敏感而特异的肾综合征出血热特异性抗体的检测方法。方法采用免疫-PCR、ELISA和IFAT三种方法检测130份HFRS患者血清中抗HFRS-IgG抗体。结果免疫-PCR方法的灵敏度为78．5％，特异性为100％；ELISA法和IFAT法的灵敏度分别为47．7％和49．2％。结论免疫-PCR方法的敏感性高于ELISA法和IFAT法．是适用于肾综合征出血热特异性抗体检测的好方法。     

胶体金免疫渗滤法快速诊断肾综合征出血热的临床研究

目的 建立一种快速，敏感的检测血清中抗汉坦病毒IgM抗体的方法。方法 将抗人IgM抗体点于硝酸纤维素膜上，以捕获患者血清中特异性IgM抗体，向已包被抗体的硝酸纤维素膜上滴加患者血清后，再选后滴加汉坦病毒抗原和鼠抗汉坦病毒抗体，最后滴加金标抗鼠抗体直接显色，阳性反应为红色，整个操作过程一般不超过10分钟。结果 用该法与IgM抗体捕获法ELISA对比检测51份肾综合征出血热（HFRS）患者血清标本，两法均阳性者49份，均阴性者2份。总符合率为100%，敏感性为96%。结论 胶体金免疫渗滤法操作简便，反应迅速，敏感性较高，适于在基层医疗单位中应用，可用于HFRS的早期诊断。     

夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原的研究(英文)

目的建立以多抗为捕获抗体和单抗为检测抗体的夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原。方法利用杂交瘤技术制备抗旋毛虫单抗;旋毛虫抗原免疫家兔,分离纯化兔血清,制备兔抗旋毛虫多抗。多抗作为捕获抗体包被酶标板,单抗为检测抗体,选择适宜多抗和单抗浓度,建立夹心ELISA方法,再利用亲和素和生物素的高结合力连接起标记了生物素的抗体和DNA片段,将抗原抗体特异反应的免疫技术同无限扩增DNA片段的基因检测技术结合,利用PCR反应对DNA片段的扩增能力,提高检测灵敏度。结果制备了兔抗旋毛虫多抗,间接ELISA法筛选出与多种寄生虫抗原无交叉反应的单抗F4C6,夹心ELISA检测旋毛虫抗原最低浓度为0.05μg/ml,免疫PCR方法检测最低浓度为0.1ng/ml。结论首次建立夹心免疫-PCR检测旋毛虫抗原的方法,检测旋毛虫抗原的灵敏度高于传统ELISA方法104倍。     

应用捕获ELISA检测肾综合征出血热患者尿液中特异性IgM抗体

目的检测肾综合征出血热患者尿液中特异性IgM抗体,研究早期诊断方法.方法用MacELISA法检测不同病日HFRS病人尿液中特异性IgM抗体.结果HFRS病人尿夜中特异性IgM抗体总阳性率为76.47%,第3病日即可出现阳性,7-9病日阳性率可达83.87%,与同期HFRS病人血清抗体检测对比无显著性差异(P＞0.05).结论用MacELISA检测HFRS尿液中特异性IgM抗体敏感性高,特异性强,适合早期诊断.     

抗人红细胞—汉滩病毒核衣壳截短蛋白双功能蛋白的构建及表达

为了构建及表达抗人红细胞单链抗体－汉滩病毒核衣壳截短抗原双功能蛋白,用于肾综合征出血热病人血清中抗HFRSV抗体的快速检测,我们将抗人红细胞的鼠单克隆抗体重、轻链可变区基因及汉滩病毒S基因片段N端部分基因克隆在同一个表达载体中,构建成分泌型双功能抗体表达载体pRBC-SN,转化大肠杆菌XL－Blue,IPTG诱导表达。经ELISA测定,证明表达的双功能蛋白,具有抗人RBC和结合抗HFRSV抗体的双重功能。结果提示,表达的双功能蛋白具有双重活性,用于血清学快速检测,还需作进一步改构。     

生物素-亲合素系统-时间分辨荧光免疫分析法检测抗核抗体方法学的建立和临床应用

目的 建立高灵敏度、宽量程的定量检测患者血清中抗核抗体的生物素.亲合素系统.时间分辨荧光免疫分析( BAS-TRFIA)方法.方法 以hela细胞核和抗人免疫球蛋白(GAM)分别作为固相抗原和生物素化抗体,Eu3+示记亲合素;标准品或样品中抗核抗体与固相核抗原、生物素GAM、Eu3+标记亲合素形成同相核抗原.抗核抗体.生物素化抗体-Eu3+标记亲合素的多层夹心免疫反应复合物;加入荧光增强液解离Eu3+,形成强荧光螫合物,荧光强度与样品中待测抗核抗体的含量呈正比,建立BAS-TRFIA方法检测抗核抗体;对建立的BAS-TRFIA 法检测抗抗核抗体的精密度、检测范围、稳定性等进行分析.收集50名健康献血者、105例系统性红斑狼疮、109例类风湿关节炎、25例原发性胆汁性肝硬化、29例干燥综合征、23例硬皮病、25例混合性结缔组织病患者血清标本,采用建立的BAS-TRFIA法检测这些患者血清中的抗核抗体,计算阳性率.结果 BAS-TRFIA法检测抗核抗体高、中、低3种浓度混合血清的批内(n=20)精密度分别为3.13％、3.74％和5.76％,批间(n=8)精密度分别为5.31％、6.25％和7.46％,均优于酶联免疫吸附试验( ELISA)法;方法的灵敏度为2.24 U/ml;平均回收率为100.74％;该方法测定值与进口ELISA法所得结果高度相关( R2=0.989);BAS-TRFIA法检测健康献血者、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、原发性胆汁性肝硬化、干燥综合征、硬皮病、混合性结缔组织病患者血清标本抗核抗体,阳性率分别为0、100％、23％、96％、38％、91％、92％;一强阳性标本,BAS-TRFIA法测抗核抗体的曲线良好线性范围在稀释浓度1∶12.5～1∶409 600的范围内;ELISA法测抗核抗体的曲线良好线性范围在稀释浓度1:100—1:51 200的范围内,BAS-TRFIA法与ELISA法相比,抗核抗体可测量范围明显提高;试剂盒置于37℃水浴箱7d后,BAS-TRFIA法结合率仅下降15.9％,而ELISA法结合率下降58.4％,BAS-TRFIA法试剂盒稳定性较好.结论 首次建立稳定的高灵敏度和宽检测范围的BAS-TRFIA法检测人血清中的抗核抗体,对早期诊断自身免疫病及监测疗效具有重要意义,有望在各检验科室得以普遍应用.     

重组多肽酶联免疫吸附法检测抗Scl-70抗体的初步应用

目的制备人Scl-70抗原207～765位氨基酸片段融合蛋白作为自身抗原,探讨ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性和特异性。方法构建编码Scl-70抗原第207至第765位氨基酸片段的重组体,在宿主菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后,免疫印迹法鉴定抗原性,ELISA检测北京协和医院免疫科血清库中系统性硬化（SSc）及部分其他结缔组织病患者血清抗Scl-70抗体。结果重组融合蛋白在宿主菌中获得可溶性表达,免疫印迹法鉴定表明其能与标准抗Scl-70抗体阳性血清反应,而与正常血清、其他抗血清无反应。在36份SSc患者血清中,天然抗原免疫双扩散（DID）法共检出的6份阳性血清用重组多肽ELISA检测有5份呈阳性,30份经天然抗原DID法检测为阴性的血清用重组多肽ELISA检测有3份呈阳性;20份其他结缔组织病患者血清用重组多肽ELISA检测均为阴性。结论重组的207—765位氨基酸片段是Scl-70抗原的主要抗原表位区域,以重组多肽为基质ELISA检测抗Scl-70抗体的敏感性较高,为进一步研究抗体水平与临床病情变化的相关性奠定了基础。     

应用免疫-PCR检测弓形虫循环抗原的实验研究

目的　控索弓形虫感染早期诊断方法。方法　用链亲素将生物素化的二抗和生物素化的 DNA偶联起来 ,通过PCR扩增标记 DNA检测固定的抗原 ,建立了弓形虫循环抗原免疫— PCR检测技术 ,用该技术和 EL ISA法平行检测系列稀释的弓形虫的感染鼠阳性血清中的 CAg以及实验感染鼠血清中 CAg的动态变化 ,对比研究二者之间的敏感性。结果　免疫—PCR法检测弓形虫 CAg吴阳性的血清最高稀释度为 1∶ 10 0 0 ,EL ISA法检测弓形虫 CAg呈阳性的血清最高稀释度为 1∶ 5 ,免疫— PCR最早在鼠感染弓形虫后第 3天测到 CAg,EL ISA最早在鼠感染弓形虫后第 5天测到 CAg。结论　免疫— PCR是一种特异性强、敏感性高的弓形虫 CAg检测方法 ,敏感性较 EL ISA法提高了 2 0 0倍 ,免疫— PCR检出阳性结果时间早 ,为弓形虫病早期诊断提供了科学依据     

弓形弓形虫抗原检测方法的研究

本研究制备了与多种寄生虫抗原无交叉反应的抗弓形虫单抗B6C3和兔抗弓形虫多抗,多抗为捕获抗体,单抗为检测抗体,建立单-多抗夹心ELISA方法。用亲和素连接分别标记生物素的抗体和酶,建立ABC(avidin-biotin-peroxidase complex)-ELISA[D1]方法。同样用亲和素连接标记生物素的抗体和DNA片段,利用PCR反应对DNA片段巨大的扩增能力,提高检测灵敏度,发展单-多抗夹心ELISA为免疫-PCR(I-PCR)检测弓形虫抗原。单-多抗夹心ELISA检测弓形虫抗原最低浓度为0.6μg/ml,ABC-ELISA检测最低浓度为0.075μg/ml。I-PCR检测最低浓度为0.1ng/ml,检测弓形虫抗原灵敏度高于传统ELISA法6000倍,高于ABC-ELISA法750倍。     

抗心磷脂抗体检测在肾综合征出血热中的临床意义

目的 探讨抗心磷脂抗体（ACA）检测在肾综合征出血热（HFRS）中的临床意义。方法 ELISA法分别检测HFRS患者54例、狼疮性肾炎52例、儿童肾病综合征69例和50例体格检查者（对照组）血清ACA-IgM和ACA-IgG。阳性率比较采用χ^2检验。结果 对照组未检测出ACA-IgM和ACA-IgG；HFRS组ACA-IgM阳性率为85．2％，ACA-IgG为24．1％；狼疮性肾炎组分别为25．0％和21．2％；儿童肾病综合征组分别为13．0％和8．7％。HFRS组ACA-IgM阳性率显著高于对照组、狼疮性肾炎组和儿童肾病综合征组（P〈0．01），其ACA-IgG阳性率均显著高于对照组（P〈0．01）和肾病综合征组（P〈0．05）。结论 ACA可能参与HFRS的免疫发病过程。     

PCR-ELISA用于HFRS病人早期诊断的研究

目的　建立检测HFRS患者血清标本中HV基因的PCR -ELISA方法。方法　设计并合成互补于HVS基因片段的标记引物 ,对 98例HFRS患者血清进行RT -nestedPCR扩增 ,并用酶免方法分析扩增产物。结果　 98例患者不同病日采集的血清标本的RT -nestedPCR平均检出率仅为 6 0 .2 % ,而PCR -ELISA平均检出率为 80 .6 %。结论　PCR -ELISA用于早期HFRS患者的HV基因检测是一种理想的检测方法     

酶斑点杂交法与双抗体夹心法检测汉坦病毒感染的比较

目的将酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法,检测汉坦病毒感染,探索价格低廉早期HFRS诊断试剂。方法以戊二醛偶联辣根过氧化物酶和抗汉坦病毒NP抗原单链抗体,制备酶标单链抗体,并应用于酶斑点杂交法和双抗体夹心法中,检测56份早期HFRS患者血清及66份阴性对照血清。结果56份HFRS患者血清中,双抗体夹心法检测出29例阳性,阳性率为51.79%,酶斑点杂交法检测出28例阳性,阳性率为50.00%,两方法检测66例阴性对照血清,结果均为阴性。统计学处理,两方法差异不显著。结论以酶标抗汉坦病毒NP抗原单链抗体制备的酶斑点杂交和双抗体夹心诊断试剂,均为稳定性好、假阳性率低、造价低廉、诊断可靠的诊断试剂。     

血清旋毛虫P49抗原IgG抗体的斑点金免疫渗滤法检测

目的 建立一种快速诊断人体旋毛虫感染的新途径。方法 以基因工程表达的猪旋毛虫融合蛋白p49/GST为抗原,将其结合于硝酸纤维素膜上,以胶体金颗粒结合的羊抗人IgG作为标记抗体,建立斑点金免疫渗滤法(Dot-immunogoldfiltration assay,DIGFA),检测人血清抗旋毛虫p49抗原IgG抗体。共检测76份旋毛虫患者血清并与酶联免疫吸附试验(ELISA)作对比研究。结果 抗原抗体通过渗滤在膜上反应,10min肉眼即可观察到结果,在76份患者血清的检测中,阳性率为98.68％,显著高于ELISA法的检出阳性率86.84％,(X2=7.94,P<0.01)。交叉试验与重复试验结果显示DIGFA具有较好的特异性及稳定性。结论 以纯化的融合蛋白p49/GST为抗原建立的DIGFA可快速准确检测旋毛虫病人血清特异性旋毛虫IgG抗体,具有推广应用的价值。     

陕西延安地区肾综合征出血热流行情况研究报告

目的 明确陕西延安地区为肾综合征出血热疫源地及病毒基因型别。方法 择有疫情报告地,进行人群疫情调查及健康人群特异性抗体检测;用夹夜法捕鼠,调查鼠种及鼠密度,采集鼠肺、血标本。人血、鼠血分别用IFA和ELISA法检测IgG抗体;鼠肺采用RT-PCR检测汉坦病毒(HV)RNA,测定PCR产物并与HV代表株76-118和Seoul序列进行比较。结果 对延安市防疫站2001年统计的7例HFRS患者进行流行病学调查,均属在当地感染;检测延安市洛川县交口河镇245例人血标本HV特异性IgG抗体,阳性50例,人群隐性感染率为20.41％。22份鼠肺及鼠血标本,IFA抗HV IgG阳性3例,ELISA阳性5例。从一只鼠血抗体阳性的鼠肺中检测到HV RNA,序列测定符合Seoul S片段序列(94％)。结论 延安市洛川县交口河镇为HFRS疫源地及新疫区,洛川交口河镇健康人群、褐家鼠、小家鼠中有HV感染,病毒型别为SEO型。     

Nucleolar staining cannot be used as a screening test for the scleroderma marker anti–RNA polymerase I/III antibodies

Objective

Anti–RNA polymerase I/III (anti–RNAP I/III) antibodies are clinically useful markers of scleroderma, and their presence is associated with diffuse skin disease and an increased risk of cardiac and kidney involvement. Although RNAP I antibodies localize to the nucleolus, nucleolar staining by many anti‐RNAP antibody–positive sera is not always observed. Nucleolar staining by anti‐RNAP antibody–positive sera was examined by double staining with antifibrillarin antibodies to evaluate whether nucleolar staining can be used as a screening test for anti–RNAP I/III antibodies. In addition, the relationships between nucleolar staining and levels of anti–RNAP III antibodies were examined by enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoprecipitation (IP) assay.

Methods

Sera were tested using immunofluorescent antinuclear antibodies on HEp‐2 cell slides, by anti–RNAP III ELISA, and by IP assay using ³⁵S‐labeled K562 cell extract. Nucleolar staining by anti‐RNAP antibody IP‐positive sera was confirmed by double staining using antifibrillarin monoclonal antibodies. The levels of anti–RNAP III antibodies were quantitated by ELISA and by IP assay using a serially diluted reference serum as a standard, and their relationship was analyzed.

Results

All 18 anti–RNAP I/III antibody–positive sera showed nuclear speckled patterns, but nucleolar staining was readily noticeable in only 44% of the sera. A positive correlation was found between ELISA and IP units for anti–RNAP III antibodies. The levels of anti–RNAP III antibodies and anti–RNAP I antibodies correlated well, with the exception of a few sera. Levels of anti–RNAP III antibodies were low in sera with nucleolar staining, whereas several sera with high levels of anti–RNAP I antibodies clearly showed nucleolar staining.

Conclusion

Although some sera positive for anti–RNAP I/III antibodies clearly stain nucleoli, nucleolar staining is inconsistent and cannot be used to screen for anti–RNAP I/III antibodies.

     

RT-PCR定量检测汉坦病毒RNA及在临床诊断中的价值

目的建立敏感特异的检测肾综合征出血热(HFRS)病人血清中汉坦病毒RNA的定量RT-PCR方法,探讨HFRS患者血清中病毒RNA持续时间,水平及其病情严重程度的关系。方法应用套式RT-PCR扩增引物,自行设计和制备标准品获得标准曲线,使用实时荧光定量PCR技术检测了HFRS(SEO型)血清中的汉坦病毒的载量。结果14例HFRS病人血清中,SEO RNA阳性11例,SEO型病人的病毒载量一般可达102~104copies/ml。其中2例发病第8天,2例第9天的病人血清PCR结果仍为阳性。结论:我们采用的实时荧光定量PCR方法可很好的反映HFRS病人血清中汉坦病毒RNA含量,HFRS病人病毒血症持续时间可超过1周,血清中RNA水平与病情严重程度有关。     

Comparison of haemagglutination test, enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence antibody test for determination of rubella immune status

Comparative evaluations of immune status for rubella are described for the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), indirect immunofluorescence (IFA) and two standard haemagglutination inhibition tests (HAI kaolin; HAI heparin-MnCl2). In general, a reasonably good correlation was obtained between the level of rubella antibodies measured by the HAI (kaolin) test and by ELISA, but an appreciable proportion (15%) of ELISA positive specimens were encountered among HAI (kaolin) negative sera. All of these HAI negative, ELISA positive sera, except one were found to be positive for rubella antibodies by IFA. Neutralization test performed on this serum positive by ELISA only, confirmed the presence of protective rubella antibodies. Of all the tests evaluated ELISA appeared unequivocally to be the most sensitive test followed closely by IFA. The standard HAI (heparin-MnCl2) was more suitable than the HAI (kaolin), for the determination of immune status. Further, no linear relationship between single rubella virus HAI and ELISA values was observed.     

三种ELISA法检测大鼠血清肾综合征出血热病毒特异性抗体的研究

肾综合征出血热(HFRS)是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的自然疫源性疾病。本病的传染源除黑线姬鼠、褐家鼠、欧洲棕背外,能作为家鼠型或实验动物型HFRS传染源的动物,还有实验大白鼠。近十年来世界各地相继暴发了由实验大鼠引起的HFRS流行,日益引起了人们的高度重视,迫切需要一些快速、简便、敏感、特异的检测手段以用于野生及实验动物的HFRS病毒流行病学监测及检疫,以预防野鼠型、家鼠型及实验室型HFRS的发生。虽然间接免疫荧光试验(IFA)一直是主要可靠的血清学诊断手段,但由于需用昂贵的仪器,并且判定结果有一定的主观性,降低了它的应用价值。我们建立了三种检测实验大鼠体内HFRS病毒抗体的ELISA方法,并对这些方法的敏感性。 (一)取代试验:1.用相应包被液或稀释液代替反应系统中一种或二种成分,结果均为阴性(见表1)。2.以JEV抗原和抗体,HSV抗原和抗体分别取代HFRS病毒抗原和A35McAb、Mark-1 McAb及免抗HFRS病毒免疫血清r-G。以酶标免抗人IgG取代酶标Mark-l,酶标H7 McAb和PAP复合物,羊抗人IgG取代桥抗免抗大鼠血清,结果均为阴性(见表2)。