孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集纯化及在产前诊断中的应用

孕妇外周血中的胎儿细胞主要有三种:滋养叶细胞、有核红细胞和淋巴细胞。最适于富集纯化用于产前诊断的是胎儿有核红细胞。密度梯度离心富集结合胎儿有核红细胞特异性抗原标记CD71,γ珠蛋白阳性选择和白细胞抗原CD45阴性选择纯化是目前从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞的理想方法。已用于产前诊断胎儿性别和一些疾病。     

从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞方法学初探

从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断成为新的研究热点,胎儿有核红细胞被认为是最理想的研究对象［１］。本研究采用简单的不连续密度梯度离心法分离富集孕妇外周血中有核红细胞,进行Ｙ染色体特异性ＤＹＺ１基因的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增以预测胎儿性别,探讨胎儿有核红细胞用于无创性产前诊断的一些问题一、资料和方法　　１．研究对象孕龄６～１４周,年龄２１～３０岁的孕妇共４５例,分为细胞制片组１５例,包括早孕８例,中孕７例;胎儿性别预测组３０例,包括早孕１８例,中孕１２例。此外,以未婚、无妊娠史的２例女…     

孕妇外周血胎儿细胞的分离及其在产前诊断中的应用

孕妇外周血中存在一定数量的胎儿细胞已为许多学者证实，为非侵入性产前诊断提供了一个有广泛应用前景的途径。本文对孕妇外周务胎儿细胞的种类以及胎儿有核红细胞的特点、分离纯化的方法及其在产前诊断中的应用作了简要介绍，并对其中存在的问题进行了探讨。     

胎儿血红蛋白用于分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究

目的研究胎儿血红蛋白(HbF)对单个核细胞的标记情况,并用于孕妇外周血中胎儿有核红细胞(NRBCs)的分选,同时探讨NRBCs的比例与孕周的关系。方法2003-10-2004-04深圳市人民医院选用胎儿特异性抗体HbF对90例正常孕妇外周血、15例未孕妇女和15例胎儿脐血单个核细胞进行标记,并结合流式细胞技术(FACS)对胎儿有核红细胞进行分选。结果孕8~41周的孕妇外周血中HbF阳性标记率为(4·62±3·42)%,与未孕组及胎儿脐血组比较,差异均有极显著性意义(P<0·01)。经流式细胞仪分选出的孕妇外周血中的胎儿NRBCs数在孕12~18周、19~23周最高,分别为412·4±135·5和454·2±153·4。结论早、中、晚期孕妇外周血中均存在胎儿有核红细胞,单抗HbF可以有效地进行识别,利用该细胞进行无创伤性产前诊断的最佳时间宜在妊娠12~23周左右。     

应用转铁蛋白受体和胎儿血红蛋白标记染色方法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究

由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少，Hahn，Holzgreve和Bianchi等报道，孕妇每毫升外周血中仅有1～2个完整胎儿细胞。所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记，并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术，是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的最佳手段。但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体，故不同学者选用的标记性抗体也有所不同。本研究采用荧光激活细胞分离技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS），通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体（transferrin receptor，CD71）单标记染色和胎儿血红蛋白（fetal haemoglobin，HbF）单标记染色与双标记染色情况的比较，探讨CD71与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值。     

胎儿有核红细胞与无创性产前诊断

自妊娠妇女外周血中发现并分离到XY核型的胎儿细胞以来，发现运用母体外周血中胎儿细胞可以进行无创性产前诊断，目前发现妊娠妇女外周血中的胎儿细胞有：胎儿有核红细胞（nucleated red blood cells，NRBCs）、滋养细胞、胎儿淋巴细胞和粒细胞。越来越多的研究发现，胎儿有核细胞，尤其是NRBCs以其独特的细胞学特点倍受关注，就近十年来无创性产前诊断的最佳候选细胞——胎儿NRBCs的细胞学特点、富集、分离和鉴定方法、在临床产前诊断中的应用等综述。     

利用孕妇外周血作非侵入性产前检查的研究进展

近年来人们对利用孕妇外周血作非侵入性产前诊断 (因其材料简便易获 )的研究越来越多。非侵入性产前诊断可用于诊断常见的染色体疾病 ,检测胎儿性别 ,甚至诊断单基因遗传病等。对孕妇外周血的研究主要包括三方面的内容 :血清生化指标测定、胎儿有核红细胞 (NRBC)的研究及胎儿 DNA的研究等     

胎儿有核红细胞与无创性产前诊断

自妊娠妇女外周血中发现并分离到XY核型的胎儿细胞以来,发现运用母体外周血中胎儿细胞可以进行无创性产前诊断,目前发现妊娠妇女外周血中的胎儿细胞有:胎儿有核红细胞(nucleated red blood cells,NRBCs)、滋养细胞、胎儿淋巴细胞和粒细胞.越来越多的研究发现,胎儿有核细胞,尤其是NRBCs以其独特的细胞学特点倍受关注,就近十年来无创性产前诊断的最佳候选细胞--胎儿NRBCs的细胞学特点、富集、分离和鉴定方法、在临床产前诊断中的应用等综述.     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞的出现频率及其与孕周的关系

目的 探讨用检测孕妇外周血中的胎儿有核红细胞（ＮＲＢＣ）进行无创性产前诊断的最佳时间。方法 对４４名孕龄６～４０周的孕妇外周血进行不连续密度梯度离心,将分离后的细胞进行制片,显微镜下行有核红细胞计数,然后用显微操作法一一获取,进行Ｙ染色体特异性ＤＹＺ１基因的聚合酶链反应（ＰＣＲ）,以确定其胎儿来源。结果 ４４名孕妇中有１７例其外周血中检出有ＮＲＢＣ,分布于妊娠第９～２６周,其中以妊娠第１１～２０周     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集方法的比较

目的 从孕妇外周务右分离胎儿有核红细胞（ＮＲＢＣＳ）,并对富集的方法进行比较,搪塞利用此法进行无创性前前诊断的可行性。方法 对５７例５－４０孕周的妇女外周血分别通过单密度梯度离心、免疫细胞化学检测、以及在此基础上流式细胞术分选第三种方法,富集ＮＲＢＣＳ。结果 密度梯度离心后的２７６例样本中,１４例以１－１０个ＮＲＢＣＳ,占５１．８５％。细胞化学检测到ＣＤ７１细胞。流式细胞仪分选出包含ＮＲＢＣＳ的Ｃ     

非侵入性产前诊断技术

非侵入性技术 ,主要包括分离母血中胎儿细胞 ,超声检查以及母血生化指标筛查等 ,对孕妇和胎儿无损伤 ,可重复取材 ,动态观察 ,近年来进展很快。现就这方面的研究作一简要介绍。1　孕妇外周血中的胎儿遗传物质1 1　孕妇外周血中的胎儿细胞1 1 1　胎儿细胞的类型　孕妇外周血中存在胎儿细胞 ,主要包括 :有核红细胞 ,淋巴细胞 ,滋养细胞 ,均能通过胎盘转移到母血循环中。胎儿淋巴细胞是首先在母血中检测到的胎儿细胞 ,但它的产生多在孕中期 ,不适于早期产前诊断 ;同时基于人类白细胞表面抗原 (ＨＬＡ)差异的分离要求了解配偶ＨＬＡ类型 ,并且配…     

孕妇外周血中胎儿细胞的分离、纯化及在无创性产前诊断中的应用

目前,获取胎儿细胞进行产前诊断的方法主要有羊膜腔穿刺、绒毛采取和脐静脉穿刺。这些手段对于胎儿有一定的风险性,有导致流产发生的可能。而从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞用于产前诊断,则属无创性手段,不仅取材方便,易于为孕妇所接受,且风险小,不会对胎儿造成...     

双色共变性荧光原位杂交产前诊断胎儿唐氏综合征

目的 探讨双色共变性荧光原位杂交用于非侵入性产前诊断胎儿唐氏综合征的可行性。方法 对11例孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行抗血型糖蛋白磁珠直接标记,再经磁激活细胞分选法富集,以Y和21号染色体专一探针对分离的胎儿有核红细胞行双色共变性荧光原位杂交,预测胎儿21号染色体倍性和性别,并用羊水染色体核型分析结果,验证预测准确性。结果 11例胎儿21号染色体倍性均正常,与羊水染色体核型分析结果相符。其中5例为男性胎儿,男性胎儿有核红细胞数量为9－65个,平均为25个,男性胎儿有核红细胞纯度为1．4％－18．8％;6例为女性胎儿,孕妇外周血中未见男性胎儿有核红细胞;性别预测结果与羊水染色体型分析结果一致。结论 双色共变性荧光原位杂交用于分析胎儿21号染色体倍性及性别,诊断胎儿唐氏综合征准确、可靠。     

母血中胎儿有核红细胞数量与胎儿异常的关系

目的 :探讨母血中胎儿有核红细胞数量与胎儿异常的关系 ,为将它用于无创性产前诊断提供实验依据。方法 :对孕 6～ 40周的 86例妇女 (包括胎儿正常组 68例、胎儿异常组 1 8例 )的外周血进行单密度梯度离心、瑞氏染色和细胞计数 ,分析母血中胎儿有核红细胞数量与孕周、胎儿异常及胎儿性别的关系。结果 :胎儿正常组 ,母血中胎儿有核红细胞平均数量为 1 4.2 3±1 2 .0 1 /ml,与妊娠周数呈直线相关 (R >R0 .0 5)。胎儿异常组中 ,母血中胎儿有核红细胞平均数量较正常胎儿组显著增加 ,约为 3 8.73± 2 4.97/ml,且与妊娠周数无明显直线相关性。母体外周血中胎儿有核红细胞数量与胎儿性别无统计学相关性。结论 :胎儿发生异常时母血中胎儿有核红细胞数量较正常妊娠时增加。母血中胎儿有核红细胞数量在胎儿正常时随孕周而增加 ,且不受胎儿性别的影响。母血中胎儿有核红细胞计数可以辅助用于产前筛查胎儿异常的发生。     

胎儿细胞父源性人类白细胞抗原DQA基因检测

随着应用孕妇外周血中胎儿细胞进行无创性产前诊断研究的进展 ,多数研究者利用聚合酶链反应 (ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ,ＰＣＲ)或荧光原位杂交的方法检测性别决定基因(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎＹ ,ＳＲＹ) [1 3 ] ,作为鉴定胎儿细胞存在或已成功分离的手段 ,但这些方法仅局限于检测妊娠男性胎儿的孕妇外周血中的胎儿细胞。人类白细胞抗原 (ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ ,ＨＬＡ) ＤＱＡ基因属于ＨＬＡ Ⅱ类抗原[1] ,该基因的多态性和高变异性使ＨＬＡ ＤＱＡ基因位点具有较好的…     

运用流式细胞术分析孕妇外周血中胎儿有核红细胞的比例与孕周的关系

目的 :探讨母亲外周血中胎儿有核红细胞 (NRBCs)的比例与孕周的关系。方法 :分离纯化孕 11～ 34周、2 1～ 35岁的 6 1例孕妇外周血中的胎儿细胞 ,采用荧光激活细胞分离技术 (FACS)分选表达转铁蛋白受体的阳性细胞 (CD71+ 细胞 )。将孕妇组、未孕组及新生儿脐血组进行对照。结果 :孕 11～ 34周孕妇外周血中CD71+ 细胞的比例为 (0 .35± 0 .2 5 )× 10 -2 ,与未孕组及新生儿脐血组差异均有高度显著性 (P <0 .0 1)。CD71+ 细胞在外周血中的比例在孕 17、18周达峰值 ,分别为 (0 .6 4± 0 .2 5 )× 10 -2 和 (0 .5 4± 0 .35 )×10 -2 。结论 :早、中、晚期孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞。利用母血循环中的胎儿细胞进行产前诊断的最佳时间应在妊娠 17～ 18周     

运用流式细胞技术分析孕妇外周血中胎儿有核红细胞的比例与孕周的关系

目的 :探讨母亲外周血中胎儿有核红细胞 (NRBCs)的比例与孕周的关系。方法 :对 6 1名孕龄为 11～ 34周、年龄为 2 1～ 35岁的妇女的外周血中的胎儿细胞进行分离纯化 ,采用荧光激活细胞分离技术 (FACS)分选表达转铁蛋白受体的阳性细胞 (CD71+细胞 )。将孕妇组、未孕组及新生儿脐血组进行对照。结果 :孕 11～ 34周的孕妇外周血中 CD71+细胞的比例为 (0 .35± 0 .2 5 )× 10 - 2 ,与未孕组及新生儿脐血组均有极显著性差异。CD71+细胞在外周血中的比例在孕 17～18周达峰值 ,分别为 (0 .6 4± 0 .2 5 )× 10 - 2和 (0 .5 4± 0 .35 )× 10 - 2。结论 :早、中、晚期孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞。利用母血循环中的胎儿细胞进行产前诊断的最佳时间应在妊娠 17～ 18周     

孕妇血浆中游离胎儿DNA测定在产前诊断中的应用

传统的羊膜腔穿刺和绒毛吸取是目前许多医院较为常用的产前诊断技术，因其操作易导致流产、胎儿损伤或死亡、宫内感染、羊膜破裂等，使其在临床上的推广和应用受到了限制。利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行遗传学诊断一直是无创性产前诊断的重要探索途径。但由于孕妇外周血中的胎儿细胞数量少，而且存在个体差异，目前很难从外周血中分离出完整的胎儿细胞，这无疑限制了这种方法在临床上的应用。1997年，有学者研究发现，孕妇血液循环中存在较丰富的游离胎儿DNA，这一发现为无创性产前诊断和筛查开辟了新领域。     

富集孕妇外周血中胎儿细胞行胎儿性别诊断

目的探讨对孕妇外周血中胎儿细胞进行非侵入性产前诊断的可行性。方法对６４例孕８～４０周孕妇外周血进行密度梯度离心法,富集胎儿细胞,并经显微镜下观察计数各种细胞所占百分比。同时,对所富集细胞经提取ＤＮＡ进行人Ｙ染色体特异ＤＮＡ扩增,判定胎儿性别并与新生儿性别进行对照。结果６４例孕妇外周血中,２５例观察到有核红细胞,占３９．０６％。６４例孕妇分娩３３例男性婴儿,其中２８例扩增出Ｙ特异带;另外３１例分娩女性婴儿,除１例出现Ｙ特异带,其余未见特异带。诊断的灵敏度为８４．８５％,特异度为９６．７７％,总符合率为９０．６３％。结论密度梯度离心法可从孕妇血中富集胎儿细胞,且所获得细胞已基本满足体外扩增Ｙ染色体基因所需要的模板量。     

孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿DNA的检测

目的　建立从孕妇外周血中分离有核红细胞 (NRBC)及DNA的可靠方法 ,并鉴定其来源。方法　对88例孕妇外周血分别通过密度梯度离心法 ,流式细胞术 (FCM )和荧光激活细胞分离技术 (FACS)分离NRBCs。应用套式PCR技术对 6 5例孕妇血浆DNA进行正常男性SRY基因检测。结果　①NRBCs:2 7例样品经密度梯度离心 ,其中 14例分选到 1～ 10个NRBCs。FACS技术对 6 1例样品进行转铁蛋白受体阳性细胞 (CD71+ )分选 ,所有样品均有CD71+ 细胞 ,其浓度为 (0 35± 0 2 5 )× 10 -2 。②胎儿DNA :4 6例怀男胎孕妇血浆DNA中SRY基因检测出率为 6 5 2 2 % (30 / 4 6 ) ,怀女胎的 19例样品SRY基因未检出率为 94 74 % (18/ 19)。结论　从孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展。利用母血中胎儿细胞及DNA诊断遗传性疾病可望成为最佳非创伤性产前诊断技术