FAK的活化促进悬浮肺肿瘤细胞的积聚、凋亡抑制与增殖

[目的]研究在悬浮状态下细胞聚集与细胞凋亡和增殖的关系,以及参与细胞聚集的分子信号传导.[方法]镜下观察不同肺上皮细胞悬浮状态聚集作用的改变;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;用MTT和台盼蓝细胞排斥实验检测细胞增殖;磷酸化蛋白的检测用免疫沉淀和Western blot;RNAinterference沉默实验采用逆转录病毒载体感染的稳定表达细胞株.[结果]肿瘤细胞在polyHEMA悬浮状态下脱离细胞外基质不仅能够存活,而且不同细胞形成大小不同的聚集体:人类大细胞肺癌H460和人肺腺癌H1792细胞株的细胞聚集体大而紧密;人肺腺癌A549和SK-LU-1细胞聚集体小而松散;正常狗肾上皮细胞MDCK几乎不形成聚集体,这与它们的恶性程度来源有关.在悬浮状态下正常细胞MDCK发生凋亡.细胞聚集体间的相互作用能够促进悬浮状态下肿瘤细胞的增殖.磷酸化FAK的水平和聚集体的大小有关,沉默FAK蛋白的表达能够部分地阻断肿瘤细胞聚集体的形成.[结论]肿瘤细胞脱离细胞外基质形成的聚集能力是判断肿瘤恶性程度和转移特性潜在的标志物.聚集体细胞间的相互作用能够抑制细胞凋亡和促进细胞增殖.聚集体的形成与FAK磷酸化有关.     

FAK阻断对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究RNA干扰（RNAi）抑制黏附斑激酶（FAK）基因表达后对鼻咽癌HNE-1细胞株增殖和凋亡的影响.方法：利用免疫组化法检测鼻咽癌HNE-1细胞株中FAK基因的表达.根据基因库上的FAKmRNA序列,设计合成针对FAK的小干扰RNA（siRNA）并转染HNE-1细胞,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR,WesternBlot等方法检测细胞中FAK基因表达的变化;利用MTT法检测细胞的生长增殖;流式细胞术观察其对细胞周期及凋亡的影响.结果：鼻咽癌HNE-1细胞株中FAK基因呈阳性表达.针对FAK的siRNA使鼻咽癌HNE-1细胞株FAKmRNA和蛋白表达水平分别下调71.4%,59.8%;MTT法检测显示,细胞的生长增殖受到明显抑制,抑制率可达36.8%;转染后48h,鼻咽癌HNE-1细胞G0/G1期细胞量增加,而S期及G2-M期的细胞减少,同时凋亡率增加.结论：干扰鼻咽癌HNE-1细胞内FAK基因的表达,可抑制肿瘤细胞的生长增殖,使细胞周期重新分布并促进凋亡.     

抑制survivin基因表达对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究survivin基因与肺腺癌的关系,探讨survivin对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法合成抑制survivin基因的siRNA,通过脂质体转染到肺腺癌A549细胞中,荧光倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测各组细胞增殖和凋亡指数,Western blot检测survivin编码表达的蛋白,RT-PCR检测survivin mRNA的表达。结果抑制survivin在肺腺癌A549细胞中的表达后,能够抑制A549细胞增殖,诱导细胞的凋亡,survivin基因编码表达的蛋白明显减少。结论应用RNAi抑制survivin基因,可以抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡。survivin能作为治疗肺腺癌的一个潜在的基因靶点。     

去甲斑蝥素体外抑制NCI-H446细胞迁移、增殖及促进凋亡

目的 研究去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)体外抑制人小细胞肺癌H446细胞迁移、增殖和诱导其凋亡作用.方法 以不同浓度NCTD处理H446细胞24h后,采用细胞划痕试验检测NCTD对H446细胞侧向迁移能力的影响;采用细胞计数检测对体外培养的H446细胞的抑制增殖作用;选用不同浓度的NCTD作用H446细胞48 h后,以Hoechst33258染色观察H446细胞形态的变化,研究NCTD对人小细胞肺癌H446细胞凋亡的诱导作用.结果 经较高浓度的NCTD干预24h后,H446细胞的侧向迁移速度明显减慢(P＜0.01).细胞计数结果显示NCTD作用于H446细胞后其细胞群体倍增时间延长.NCTD作用H446细胞48 h后,部分凋亡细胞出现染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变,细胞凋亡率增加(P＜0.01).结论 NCTD能明显影响人小细胞肺癌H446细胞迁移、抑制其增殖并诱导其发生凋亡.     

FAK短发夹RNA干扰重组体的构建与鉴定

目的本研究利用RNA干扰技术,以粘附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)为靶基因,设计构建重组体,并对重组体进行鉴定,为下一步探索心肌纤维化的新途径奠定基础。方法设计小发夹结构四条DNA序列,经退火成互补两对双链,再克隆到载体PAVU6 27中构建重组体,转化入JM109菌株,提取质粒进行酶切鉴定、测序分析。结果酶切鉴定和测序分析均提示FAK靶向RNA干扰重组体的构建成功。结论FAK靶向RNA干扰重组体的成功构建,为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中FAK基因的表达,探索心肌纤维化机制打下基础。     

蛇床子素对人肺鳞癌NCI-H520细胞系增殖、凋亡的影响

目的 探讨天然化合物蛇床子素对肺鳞癌NCI-H520细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT比色法检测蛇床子素对NCI-H520细胞增殖的影响;流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测诱导细胞凋亡;Hoechst 33342核染色观察细胞核的形态变化.结果 蛇床子素对NCI-H520有明显的增殖抑制作用,且呈现明显时间剂量依赖性;流式细胞仪AnnexinV/PI双染法结果显示蛇床子素可以诱导细胞凋亡,且凋亡率呈剂量依赖性;药物处理组细胞核经Hoechst 33342染色可见染色质边集、核碎裂等典型的细胞凋亡改变,而空白对照组没有相应的变化.结论 蛇床子素可以抑制NCI-H520细胞的增殖、诱导细胞凋亡.     

阿霉素对K562细胞凋亡及FAK mRNA的影响

目的 探讨阿霉素体外作用于K562细胞后,观察其对细胞增殖的影响,促进细胞凋亡情况,以及调节细胞周期和粘着斑激酶(FAK) mRNA基因,进一步探讨通过调控FAK表达,研究抗白血病的作用机制.方法 应用细胞增殖实验(CCK8法)观察不同浓度阿霉素作用不同时间对K562细胞增殖的影响,应用流式细胞仪观察不同浓度阿霉素对K562细胞细胞凋亡,细胞周期的影响,应用RT-PCR和Western blot技术检测不同浓度阿霉素作用对K562细胞36 h后FAK mRNA以及蛋白表达水平的变化.结果 随着阿霉素浓度增加及作用时间延长,K562细胞的增殖抑制率逐渐升高,同一时间不同浓度之间比较,或者同一浓度不同时间组之间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);阿霉素能引起K562细胞凋亡,且随着药物浓度增加,凋亡率也逐渐增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);阿霉素能引起K562细胞周期阻滞,多停留在S期;阿霉素能引起K562细胞FAK mRNA表达显著降低.阿霉素能引起K562细胞FAK蛋白表达水平的降低.结论 阿霉素抑制分裂期细胞的增殖,诱导细胞凋亡增加,对细胞FAK基因和蛋白水平均显著下调,为进一步研究FAK基因表达的调控与肿瘤细胞凋亡的分子机制提供了实验基础.     

Survivin shRNA促进HL-60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的研究

目的研究RNA干扰Survivin基因表达对HL-60细胞凋亡及其对阿糖胞苷敏感性的影响。方法采用PCR扩增以及定向克隆技术重组构建shRNA的表达载体pshRNA-Survivin,使用脂质体介导转染至HL-60细胞,分为6组：①空白实验组;②阿糖胞苷（Ara-C）组;③阳性质粒组;④阴性质粒组;⑤阳性质粒＋Ara-C组;⑥阴性质粒＋Ara-C组。采用RT-PCR技术检测HL-60细胞内Survivin及其mRNA表达,运用流式细胞仪进行细胞凋亡率改变的检测。结果与空白实验组比较,阳性质粒组的mRNA表达抑制率为57.7%,表达下降,差异有统计学意义（P〈0.05）;阳性质粒组细胞凋亡率为5.87%,阳性质粒＋Ara-C组细胞对Ara-C敏感性明显提高,细胞凋亡率为12.4%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 Survivin siRNA能够高效特异的抑制HL-60细胞内Survivin基因的表达,诱导细胞凋亡,并提高了HL-60细胞对Ara-C的敏感性,这有助于白血病基因治疗的进一步发展。     

过表达miR-140-5p促进前列腺癌细胞凋亡抑制其增殖

［摘要］ 目的研究miR-140-5p在前列腺癌细胞中的表达情况,探讨 miR-140-5p在前列腺癌细胞中的生物学功能。 方法RT-qPCR方法检测前列腺癌细胞株PC3细胞及DU145细胞中miR-140-5p表达;PC3细胞中转染miR-140-5p模拟物或抑制物,CCK-8及AnnexinV/PI双染流式细胞学检测细胞活力及细胞凋亡。TCGA数据库分析高表达miR-140-5p与前列腺癌患者总生存率的关系。 结果miR-140-5p在DU145及PC3细胞中的表达明显低于RWPE-1细胞,miR-140-5p在PC3细胞中的表达明显低于DU145细胞（P＜0.05）。转染miR-140-5p模拟物的 PC3细胞中miR-140-5p相对表达量明显高于阴性对照组（P＜0.05）。miR-140-5p的模拟物转染PC3细胞48 h,过表达组细胞增殖率低于阴性对照组,凋亡率高于阴性对照组（P＜0.05）。转染miR-140-5p抑制物的PC3细胞中miR-140-5p相对表达量明显低于阴性对照组（P＜0.05）。敲低miR-140-5p表达组细胞增殖率明显高于阴性对照组,凋亡率明显低于阴性对照组（P＜0.05）。低表达miR-140-5p组患者总生存率低于高表达miR-140-5p组患者（P＜0.05）。 结论miR-140-5p在前列腺癌细胞株低表达,低表达miR-140-5p前列腺癌患者预后不良;过表达miR-140-5p可促进前列腺癌细胞凋亡,抑制其增殖。     

抑制miR-31表达对人角质形成细胞增殖、凋亡的影响研究

目的探讨miR-31对人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖和凋亡的影响以及可能机制。方法培养HaCaT细胞,利用瞬时转染的方法,对不同组细胞进行转染。反义寡核苷酸技术（ASO）组:转染微小RNA（miR）-31 ASO;对照ASO组:转染对照ASO;空白对照组:转染空白质粒。MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,Annexin V-FITC/PI双染色检测不同转染组细胞凋亡情况,PI单染色法检测不同转染组细胞周期,Western blotting检测不同转染组细胞中Rho相关结构域BTB蛋白质1（RhoBTB1）蛋白表达。结果ASO组细胞中miR-31表达量明显低于对照ASO组和空白对照组（P < 0.01）;ASO组细胞在24、48、72、96 h时吸光度值均低于对照ASO组和空白对照组（P < 0.05~P < 0.01）,且3组细胞随着时间推移,吸光度值均较之前逐渐增加（P < 0.01）;ASO组细胞凋亡率、G₀/G₁期细胞比例、RhoBTB1蛋白表达量明显高于对照ASO组和空白对照组（P < 0.01）;而S期和G₂期细胞比例明显低于对照ASO组和空白对照组（P < 0.01）。结论miR-31可能参与了人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖、凋亡过程,可能通过调控RhoBTB1蛋白表达而实现这一生物学过程。     

FAK与肿瘤关系的研究进展

随着对肿瘤分子生物学水平研究的逐步深入,人们逐渐认识到,酪氨酸激酶与肿瘤的发生发展密切相关,酪氨酸激酶活性过高或过度磷酸化,激活下游信号途径,导致细胞过度增生、对抗细胞凋亡、促进细胞生存,最终导致肿瘤的形成。黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）是近几年备受关注的一种非受体酪氨酸激酶,在多种肿瘤中均有表达,FAK参与细胞的增生、迁移和存活,与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。     

三氧化二砷抑制人肺癌细胞NCI-H460增殖并促进其凋亡实验研究

目的:探讨三氧化二砷对人肺癌细胞NCI-H460增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:体外培养人肺癌细胞株NCI-H460,利用CCK-8法、集落形成实验、流式细胞技术分别检测三氧化二砷对NCI-H460细胞的增殖、集落形成、细胞周期和凋亡,Western bolt检测相关细胞周期因子和凋亡蛋白的表达。结果:三氧化二砷能够明显抑制NCI-H460细胞的增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,并且呈浓度依赖性。Western bolt显示:随着药物浓度的增加,B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)、原癌基因(c-Myc)表达下调,BCL2相关蛋白-x(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Caspase-9表达上调。结论:三氧化二砷能够抑制NCI-H460细胞的增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,其机制可能通过下调Bcl-2、CDK1、c-Myc蛋白表达,上调Bax蛋白表达,激活Caspase-9、Caspase-3蛋白酶实现的。     

RNA干扰抑制CD59对非小细胞肺癌GLC-P细胞株增殖的影响

目的运用RNAi技术抑制CD59基因的表达,观察其对非小细胞肺癌细胞株GLC-P增值、凋亡的影响。方法合成可抑
制CD59基因的片段,并运用RNA干扰技术,构建重组质粒,通过脂质体转染法将重组质粒转染至非小细胞肺癌细胞株GLC-P,
并筛选出稳定表达细胞后,采用PCR、MTT、ELISA 法检测该稳定表达细胞株的增值、凋亡所受到的影响。结果干扰后的
GLC-P细胞株中CD59 mRNA表达量较未干扰组显著降低（P<0.05）,同时MTT、ELISA实验检测显示肺癌GLC-P细胞增殖能
力降低,可诱导肺癌细胞的凋亡。结论肺癌患者肿瘤细胞中存在CD59高表达,抑制CD59基因表达的同时可抑制GLC-P细
胞的增殖能力并诱导细胞凋亡,为非小细胞肺癌的靶向治疗提供了新靶点、新思路。
     

RNA干扰技术抑制SHBG基因表达对滋养细胞凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制SHBG基因表达对滋养细胞凋亡的影响.方法 在体外通过RNA干扰技术,将SHBGsiRNA转染至原代培养的人绒毛滋养层细胞中,双染流式细胞术检测绒毛滋养层细胞凋亡情况.结果 成功原代培养人绒毛滋养层细胞.滋养细胞转染时分成6组:Ⅰ组为正常对照组(未经转染的细胞);Ⅱ组为空白对照组(只转染脂质体,无特异性siRNA);Ⅲ组为阴性对照组(转染Nonspecific siRNA);Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组为转染组(分别转染SHBGsiRNA-Ⅰ、SHBGsiRNA-Ⅱ、SHBGsiRNA-Ⅲ).成功将SHBGsiRNA转染人绒毛滋养层细胞,结果显示与正常对照Ⅰ组、空白对照Ⅱ组和阴性对照Ⅲ组相比,各转染Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的滋养层细胞凋亡率明显增加(分别为14.61±3.05、14.37±2.47、16.91±2.61、8.89±0.36、8.64±0.87和9.24±0.60,P＜ 0.05)差异均有统计学意义.结论 siRNA可以有效干扰滋养层细胞SHBG基因的表达,可导致滋养层细胞过度凋亡.     

siRNA沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响

目的：观察沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡和周期及增值的影响．方法：采用siRNA-3转染人恶性黑素瘤LiBr细胞后分别应用TUNEL法和AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用免疫荧光细胞化学技术检测siRNA对凋亡效应蛋白Caspase-3表达的影响及应用MTY法检测siRNA对细胞增殖的作用．结果：siRNA．3转染LiBr细胞72h可诱导细胞凋亡（P〈0．05）和引起细胞G0／G1期阻滞（P〈0．05）;可下调Caspase-3蛋白表达（P〈0．05）及抑制细胞增殖（P〈0．05）．结论：Livin可做为应用RNA干扰技术探索恶性黑素瘤基因治疗的潜在靶基因．     

Survivin表达抑制影响鼻咽癌细胞的增殖与凋亡

目的研究Survivin表达抑制对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨Survivin在鼻咽癌中的生物学功能。方法采用脂质体将Survivin特异性SiRNA(small interfering RNA)转入鼻咽癌细胞株5-8F,培养48h后,收集细胞。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分别检测Survivin mRNA和蛋白在细胞中表达。流式细胞仪检测细胞凋亡与周期,显微镜下计数检测细胞增殖抑制。结果SiRNA抑制5-8F细胞Survivin表达后,细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.01);S/G1比值显著高于对照组(P<0.01);细胞增殖抑制率也显著高于对照组(P<0.01);脂质体对照组与阴性SiRNA对照组比较,细胞凋亡、周期和增殖差异无显著性(P>0.05)。结论Survivin表达抑制,诱导鼻咽癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

染色质重塑因子1在肺癌中过表达并促进肺癌增殖能力

目的 检测染色质重塑因子1(Rsf-1)对肺癌增殖能力的影响,初步探讨Rsf-1促进肺癌增殖的分子机制.方法 应用Western blot方法筛选Rsf-1高表达人肺癌H1299、H460细胞系,通过小干扰RNA (siRNA)方法干扰内源性Rsf-1表达,并检测干扰效率.应用集落形成、流式细胞术检测Rsf-1干扰前后肺癌细胞增殖能力的变化.应用Western blot检测干扰内源性Rsf-1表达前后肺癌细胞中增殖相关因子的变化.结果 Western blot结果显示:肺癌细胞中Rsf-1蛋白表达水平明显高于正常支气管上皮HBE细胞系,其中H1299、H460细胞中存在非常明显的Rsf-1高表达.转染Rsf-1特异的siRNA于高表达Rsf-1的H1299和H460细胞后,其克隆形成明显少于对照组(H1299细胞中对照组和干扰组分别为123±15和83±9; H460细胞中对照组和干扰组分别为218±18和112±17)(P＜0.05).流式细胞术结果显示:干扰内源性Rsf-1表达后,H1299和H460细胞中Gt期细胞比例增多(H1299细胞中对照组和干扰组分别为56％±5％和71％±7％;H460细胞中对照组和干扰组分别为53％±4％和70％±6％),S期细胞比例减少(H1299细胞中对照组和干扰组分别为17％±2％和11％±5％;H460细胞中对照组和干扰组分别为19％±2％和10％±5％).细胞周期相关蛋白检测结果:干扰内源性Rsf-1表达后,H1299和H460细胞中cyclinD1和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)水平明显下调.干扰Rsf-1在下调H1299和H460细胞pERK蛋白表达的作用结果与应用细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂U0126相似.结论 Rsf-1可通过cyclinD1/ERK相关通路促进肺癌细胞的增殖.     

抑制Hsp90对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的原发性肝癌恶性程度高，病情发展迅速，难以治愈，因此，寻找新的治疗手段十分必要。而分子伴侣Hsp90是维持一系列恶性肿瘤中起重要作用的蛋白质，特别是其在信号转导系统中所起的作用。如本实验通过特异性抑制剂格尔德霉素(Geldanamycin，GA)抑制Hsp90功能的方法研究Hsp90在肝癌细胞中的作用。方法培养人肝癌细胞株HepG2，采用Western印迹杂交法检测GA作用后HepG2细胞内蛋白激酶B／Akt磷酸化状态的变化、MTT法检测细胞和活力，并应用流式细胞术分析细胞周期与凋亡；MTT法检测单独应用丝裂霉素(mitomycin，MMC)或者将其与GA联合应用时对HepG2细胞的抑制情况、计算两药相互作用指数，同时采用流式细胞术分析这两种情况下细胞凋亡率的变化。结果400．mol／L的GA处理细胞后，HepG2细胞内磷酸化AKT的水平明显下降(24h为对照组的66．03％，48h为对照组的34．02％)；经过GA的作用，细胞呈现G2／M期阻滞，48h可见到凋亡率显著增加；同时MTT法显示GA对HepG2细胞有生长抑制作用，用药时间越长抑制率越高，24h和48h的抑制率分别为4．09％和21．74％。400．mol／L GA可以增强MMC对HepG2细胞的抑制作用，两药相互作用指数小于1。单独应用15．mol／L MMC细胞的凋亡率为7．65％，将400．mol／L GA与15．mol／L MMC联合使用，凋亡率上升到21．34％。结论在肝癌细胞中Hsp90可以通过增强信号转导系统中蛋白激酶的稳定性而维持癌细胞的生长优势，抑制Hsp90功能能够明显抑制肝癌细胞的生长并促进其凋亡，同时增强常用化疗药物对肝癌细胞杀伤效应，Hsp90可以成为肝癌治疗中的一个新靶点。     

siRNA抑制RASSF1A表达对Hela细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨RASSF1A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌Hela细胞系生长增殖及凋亡的影响。方法采用LipofectamineTM2000介导的脂质体法将特异性siRNA瞬时转染进Hela细胞,半定量RT-PCR检测转染前后RASSF1A mR-NA表达变化,免疫细胞化学法检测RASSF1A蛋白表达水平变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 RT-PCR与免疫细胞化学检测结果显示,转染siRNA后RASSF1A基因的表达下降,细胞增殖加快,而细胞凋亡率则显著降低。结论靶向RASSF1A基因的siRNA可有效降低宫颈癌Hela细胞中该基因的表达,用于RASSF1A基因功能研究;RASSF1A基因表达下调促进细胞增殖,同时导致细胞凋亡减少。     

siRNA抑制survivin的表达诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的研究

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构建有效siRNA的表达载体,转染卵巢癌SKOV-3细胞,分析sur-vivin基因的表达及细胞凋亡情况。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA,能显著下调SKOV-3细胞内的survivin表达,并导致SKOV-3细胞凋亡。结论利用RNA干扰能有效抑制survivin基因表达并诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡,为进一步的靶向survivin分子的体内抗肿瘤研究奠定了基础。