柔红霉素和Bax过表达对培养人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的　观察柔红霉素 (DNR)和外源 bax基因转染对培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞凋亡的影响 .方法　通过脂质体法将外源 bax基因转入 RPE细胞 .采用 TUNEL荧光染色方法 ,观察 2 0 0 μg·L- 1 DNR作用 12 h对正常和转基因后 RPE细胞凋亡的影响 ;同时采用专用试剂盒 ,通过荧光比色法检测细胞碎片中半胱氨酸蛋白酶 - 3(Caspase- 3)的活性 .结果　正常 RPE细胞可见 TU NEL 阳性着色 ,经 bax基因转染和 DNR作用后阳性细胞比例增加 ,而且染色加深 .经DNR作用不同时间后 ,转基因 RPE细胞的 Caspase- 3活性升高比例均大于正常细胞 Caspase- 3活性升高的比例 (P<0 .0 1) .结论　 DNR可以诱导 RPE细胞的凋亡 . bax基因转染可以促进细胞的凋亡 ,并增加 DNR诱导凋亡的敏感性     

转染反义Bcl-2对柔红霉素诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 :观察转染反义Bcl 2对柔红霉素诱导人视网膜色素上皮细胞 (RPE)凋亡的影响 .方法 :用Annexin V fluo ,琼脂糖凝胶电泳 ,TUNEL分别观察柔红霉素诱导正常RPE与转染反义Bcl 2的RPE的凋亡作用 .结果 :Annex in V fluo法在 4h即可检测到凋亡细胞膜的变化 ,琼脂糖凝胶电泳在 36h可检测到确切的梯状带纹 ,1 80 μg·L-1 柔红霉素作用 72h转染组与正常组凋亡指数分别为 0 .5 9和 0 .4 5 (P <0 .0 1 ) .结论 :转染反义Bcl 2可增加柔红霉素诱导的RPE凋亡的敏感性 .     

肾上腺素诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

目的　观察肾上腺素对体外培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞凋亡的影响 ,探讨细胞凋亡与中心性浆液性脉络膜视网膜病变的关系。方法　通过流式细胞技术 (FCM )、光镜、TUNEL细胞凋亡原位末端标记法检测肾上腺素和 β 受体阻滞剂普萘洛尔对体外培养的人RPE细胞凋亡的作用。 结果　人RPE细胞对低浓度的肾上腺素有一定耐受作用 ,10 pg/ml～ 10 4pg/ml肾上腺素组无明显凋亡的发生 ;10 5pg/ml～ 10 8pg/ml肾上腺素诱导RPE细胞 72h可以检测到凋亡峰 ,与对照组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;加入 10 3 pg/ml普萘洛尔可以提高RPE细胞对肾上腺素毒性作用的耐受 ,未检见RPE细胞凋亡的发生。TUNEL法光镜下观察到细胞核被蓝色染料标记的凋亡细胞。结论　肾上腺素可以诱导培养的人RPE细胞凋亡 ,这可能是中心性浆液性脉络膜视网膜病变早期病理改变的机制之一。     

柔红霉素诱导Jurkat细胞凋亡的实验研究

目的探讨柔红霉素在体外诱导Jurkat细胞发生凋亡的规律.方法应用DNR体外作用于Jurkat细胞,研究DNR诱导Jurkat 细胞凋亡的规律,Annexin V/PI双标法流式细胞仪检测Jurkat细胞凋亡率,PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 0.1～2.0μmol/L浓度范围DNR作用一定时间后,Jurkat细胞的凋亡率随药物浓度的增加与作用时间的延长而升高.DNR作用后Jurkat细胞G2/M期比例明显增加.结论一定浓度的DNR在体外可诱导Jurkat细胞凋亡,在一定的剂量范围内,呈现剂量-效应、时间-效应关系,其机制可能与DNR抑制细胞有丝分裂有关.     

柔红霉素体外对HL-60细胞的凋亡作用

目的：了解柔红霉素（ＤＮＲ）体外作用于ＨＬ－６０　细胞时产生凋亡的规律及一些相关蛋白表达的变化。方法：应用光镜、ＤＮＡ电泳及ＦＣＭ检测ＨＬ－６０细胞发生的凋亡模式；用ＩＣ、ＦＣＭ观察相关蛋白的变化。结果：当ＤＮＲ浓度为０．２μＭ～２μＭ时，ＨＬ－６０细胞发生的凋亡率随浓度的增加与作用时间的延长而升高，可见典型的凋亡细胞及明显的ＤＮＡ梯度条带。１μＭ　ＤＮＲ作用２ｈ时，ｂｃｌ－２与ｃ－ｍｙｃ的荧光强度指数（ＦＩ）降低，ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ－３　的　ＦＩ　升高；而作用５ｈ时，ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ－３的ＦＩ值反而降低。结论：一定浓度的ＤＮＲ在体外可诱导ＨＬ－６０细胞凋亡，它可抑制ｂｃｌ－２与ｃ－ｍｙｃ蛋白的表达，而激活ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白的表达。     

柔红霉素对人B细胞淋巴瘤OCI-LY7细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的：探讨柔红霉素对人B细胞淋巴瘤OCI-LY7细胞凋亡的影响及其机制,阐明柔红霉素在弥漫大B细胞淋巴瘤中的耐药机制。方法：将体外培养的OCI-LY7细胞分为0、0.1、1.0和10.0 mg·L^-1柔红霉素组。采用MTT法检测各组OCI-LY7细胞存活率,流式细胞术检测各组OCI-LY7细胞凋亡率,Western blotting法检测各组OCI-LY7细胞中凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3和survivin表达水平。后续实验分为对照组、柔红霉素组、柔红霉素+空载体组和柔红霉素+survivin组,按照上述方法检测survivin过表达后各组OCI-LY7细胞存活率、凋亡率和细胞中凋亡相关蛋白表达水平。结果：与0 mg·L^-1组比较,处理48 h后0.1、1.0和10.0 mg·L^-1柔红霉素组OCI-LY7细胞存活率和细胞中survivin蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）,而细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3及Bax蛋白表达水平逐渐升高（P<0.05）。与对照组比较,柔红霉素组OCI-LY7细胞存活率和细胞中survivin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,而细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3及Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;与柔红霉素组比较,柔红霉素+survivin组OCI-LY7细胞存活率和细胞中survivin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,而细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3及Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论：柔红霉素可诱导OCI-LY7细胞凋亡,其作用机制可能与下调survivin蛋白表达有关。     

柔红霉素诱导白血病细胞凋亡和抑制增殖的实验研究

目的 观察不同浓度柔红霉素(DNR)对Jurkat细胞生物学特性的影响.方法 采用不同浓度的DNR作用Jurkat细胞,观察细胞的生长状况,在不同的时间点收获细胞,检测DNR作用前后Jurkat细胞生物学特性的改变.结果 当0.5μmol/L DNR作用12h或18h,可以保证低死亡率的同时,细胞发生凋亡的比率最高;DNR抑制Jurkat细胞bcl-2、PCNA蛋白的表达,使更多细胞受阻于G0/G1期.结论 在合适的DNR浓度及作用时间条件下,可能通过抑制Jurkat细胞bcl-2、PCNA蛋白的表达达到诱导凋亡、抑制增殖的作用.     

金雀异黄素诱导培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的 :探讨金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮细胞 (hRPE)的促凋亡作用 .方法 :将不同浓度的金雀异黄素作用于培养人视网膜色素上皮细胞 ,通过TUNEL染色和光、电镜的形态学观察 ,观察金雀异黄素对培养hRPE凋亡的诱导作用 .结果 :不同浓度的金雀异黄素可以诱导RPE凋亡 ,5 0mg·L-1 金雀异黄素作用 2 4h即有TUNEL阳性的凋亡细胞出现 ,作用时间在 2 4 ,4 8和 72h ,其凋亡细胞百分数的中位数分别为 7.6 % ,9.8%和 1 3.7% ;当金雀异黄素浓度为 75和1 0 0mg·L-1 时 ,以上 3个时间点凋亡细胞百分数的中位数分别为 1 0 .3% ,1 6 .4 %和 2 3.4 % ;1 5 .4 % ,2 1 .2 %和 35 .8% .透射电镜观察 ,5 0mg·L-1 浓度作用于细胞 ,胞核内染色体出现边集 ,表现凋亡的早期征象 ;75mg·L-1 作用呈现典型的凋亡特征 ;1 0 0mg·L-1 作用于细胞 ,除凋亡细胞外 ,部分细胞出现胞质的进行性溶解 ,有胞膜破坏现象 ,坏死细胞比例增多 .结论 :金雀异黄素可诱导RPE凋亡的发生 ,并有剂量和时间效应关系 .1 0 0mg·L-1 金雀异黄素使RPE坏死     

TOFA协同柔红霉素诱导肠癌细胞株HCT-8细胞凋亡

目的研究TOFA及柔红霉素（DNR）联合应用对肠癌细胞株HCT-8的作用,探讨其联合应用于临床的可能性。方法将1×10^4个HCT-8细胞种植于96孔板,采用MTT比色法测定不同浓度TOFA或／和DNR对同步化处理后的HCT-8细胞的生长抑制效果;DNA降解分析法（DNA Fragmemation）检测TOFA与DNR联合使用对HCT-8细胞DNA的损伤。Westernh10t检测TOFA与DNR联合使用对凋亡蛋白p53以及PARP的水解作用。结果单用TOFA或DNR均可呈浓度依赖性抑制肠癌细胞HCT-8的生长,其IC50值分别为7．5μg／mL和0．18μmoL／L;当用20μg/mLTOFA或0．6μmol／LDNR处理时,活性细胞只有正常对照组（无药物处理组）的26．2％±5．1％或22．3％±4．5％。当用20μg/mLTOFA和0．6μmol/LDNR两药联合应用时,活性细胞只有正常值的10．4％±3．0％。同时联合应用可显著增加肿瘤细胞DNA的降解;并显著诱导凋亡蛋白p53表达,促进PARP的水解。结论TOFA与DNR联合应用可协同抑制肠癌细胞株HCT-8细胞的生长,其效应与药物诱导细胞凋亡有关。     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

人参皂苷Rg3对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的 研究人参皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3)对体外培养视网膜色素上皮(RPE)细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法 通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度(10、20、50、80、100、150mg/L)Rg3和Rg3 80mg/L在不同作用时间(6-120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果 Rg3组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rg3 100mg/L具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rg3组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论 Rg3可能通过抑制钙内流促进钾外流改变细胞膜电位、干扰RPE细胞代谢，对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

道诺霉素抑制视网膜色素上皮细胞炎前因子的表达

目的　观察道诺霉素对视网膜色素上皮细胞细胞(RPE)炎前因子表达的影响 .方法　培养的人 RPE经 IL- 1β(10μg· L- 1 )刺激以及不同浓度的道诺霉素作用后 ,用EL ISA、免疫组化和原位杂交等方法 ,检测培养的人 RPE炎前因子 m RNA和蛋白质的表达 .结果　 EL ISA显示对照组培养 RPE在 IL- 1β刺激 8h后 ,上清中 IL- 6与 IL- 8分别为2 0 0 0 pg· m L- 1· 10 - 6 cells和 5 0 0 0 pg· m L- 1· 10 - 6 cells.使用 10 0 μg·L- 1 道诺霉素作用于培养的 RPE后 IL- 6与 IL-8分别为 180 pg· m L- 1 · 10 - 6 cells (P <0 .0 1)和 32 0pg· m L- 1· 10 - 6 cells(P<0 .0 1) .免疫组化和原位杂交亦显示不同浓度道诺霉素可以不同程度地抑制 RPE内炎前因子蛋白质与 m RNA的表达 .结论　道诺霉素能有效地抑制 IL -1β诱导的培养的 RPE IL - 6和 IL - 8的表达     

人胚胎视网膜色素上皮细胞的体外培养和吞噬作用

目的探讨人胚胎视网膜色素上皮（RPE）细胞分离培养的特性及其吞噬作用。方法取发育至13-15周的新鲜人胚胎眼球,显微解剖后采用机械胰酶消化法分离培养RPE细胞,应用免疫荧光法观察人胚胎RPE细胞吞噬视网膜光感受细胞外节膜盘。结果人胚胎发育至13-15周后,RPE细胞可应用标准的培养方法进行体外培养和传代。根据测定的人胚胎RPE细胞生长曲线,取2—6代细胞用于实验培养的人胚胎RPE细胞具备吞噬功能。结论改进了人胚胎RPE细胞的培养方法,证明人胚胎RPE细胞在体外具有吞噬能力。     

汉防己甲素对兔视网膜色素上皮细胞Bax、Bcl-2表达的影响

目的：评价汉防己甲素（Tet）对兔视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖的抑制作用及对凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。方法：MTT法检测Tet对体外培养兔RPE细胞增生的影响,流式细胞仪检测Tet对兔RPE细胞增殖周期、凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果：Tet对兔RPE细胞的抑制率均随作用时间的延长而增高,各时间点之间差异均有统计学意义（P〈0.05）;抑制率均随药物质量浓度的增高而增高,除Tet10μg/ml、15μg/ml外,各质量浓度之间差异有统计学意义（P〈0.05）;Tet10μg/ml作用72 h后,出现G0/G1期细胞明显增多,S期与G2/M期细胞降低,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值下降,以上与对照组相比均有显著性差异（P〈0.05）。结论：Tet可能通过干预RPE细胞Bax与Bcl-2蛋白的表达而对其增殖产生抑制作用。     

Mer-/-视网膜色素上皮细胞在吞噬光感受器外节盘膜中的基因表达谱的改变

目的： 研究在视网膜色素上皮细胞（RPE）吞噬光感受器外节盘膜（POS）时,由于RPE的Mer基因敲出（Mer-/-）后,所导致的基因表达谱的改变。 方法： 将RPE从Mer-/-小鼠（实验组）和野生型小鼠（对照组）中分离出后,并培养至第3代。在实验组和对照组中,将提取的POS加入含有20nMGas6和Protein S的培养液中,以激活Mer受体通道所介导的RPE特异性吞噬POS。在刺激吞噬后3小时和12小时终止实验,在两组中分别通过显微镜评价RPE吞噬POS的能力,通过基因表达谱芯片筛选出差异表达的基因。并且,在相同的实验条件下,在实验组和对照组中,分别重复3次吞噬实验,采用QPCR,对于其中5个差异表达的基因进行确认。 结果： 显微镜下观察到不论在3小时还是12小时,与对照组相比,实验组中内吞的POS颗粒少。在基因表达谱芯片中发现,反应3小时和反应12小时,实验组中分别有38个和45个已知基因上调,68个和59个已知基因下调。与对照组相比,实验组中RPE内吞POS能力的下降与基因表达谱中差异表达的基因相一致,比如,发现信号转导（WNT,MAPK）、吞噬（Vav3, Hsd11b1）、细胞骨架成份（Myo7a）和代谢等方面相关的基因在不同的时间点均有不同的表达谱改变。QPCR结果发现Vav3、Hsd11b1、Myo7a、Rtn2等基因的表达变化与基因芯片结果相一致。 结论： Mer-/-基因敲出后的RPE在吞噬过程中随时间变化而出现的不同的基因表达谱的改变,给研究Mer受体通道介导的RPE吞噬POS的分子机制提供了新的研究方向和线索,特别有利于MerTK基因突变所致的人类视网膜色素变性患者发病机制的研究。     

Gene expression profile changes caused by the dysfunction of Mer during retinal pigment epithelium phagocytosis

Background  Studies indicated that Mer might be the main contributor to the specific internalization of photoreceptor outer segments (POS) in retinal pigment epithelium (RPE). It is very important to understand the mechanism of POS phagocytosis under the pathway of Mer and its ligands. The objective of this study was to identify changes in gene expression profiles caused by Mer gene knockout (Mer-/-) during phagocytosis of POS in RPE.

Methods  RPE from both Mer-/- and wild-type (WT) mice were isolated and cultured to the 3rd passage. POS were subjected to culture medium with 20 nmol/L Gas6 and protein S to activate specific mer-mediated phagocytosis. RPE phagocytosis was evaluated by phagocytosis assays and differential gene expression identified by microarray at 3 and 12 hours; the 0-hour time point served as the control. Three independent samples for each Mer-/- or WT RPE were subjected to the same protocol of microarray. Five genes were confirmed by real-time quantitative PCR (QPCR).

Results  The Mer-/- RPE had less internalized POS than WT RPE after both 3 and 12 hours in phagocytosis assay. Compared to WT RPE and the 0-hour control, 38 and 45 different known genes were increased and 68 and 59 known genes were decreased in Mer-/- RPE after 3 and 12 hours, respectively. Abnormal POS phagocytosis in Mer-/- RPE was associated with significant gene expression changes in, for example, signal transduction (WNT, MAPK), phagocytosis (Vav3, Hsd11b1), cytoskeleton components (Myo7a), and metabolism, in a time-specific manner. QPCR results showed Vav3, Hsd11b1, Myo7a, Rtn2 and Itga8 in those independent samples were consistent with microarray.

Conclusion  Gene expression profiles modulated in a time-specific manner in Mer-/- RPE indicate a possible internalization mechanism for abnormal POS phagocytosis, which gives insight into the mechanism of retinitis pigmentosa caused by the mutation of MerTK in humans.

     

人参皂甙Rb2对培养人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的：研究人参皂甙Rb2(Ginsenoside-Rb2)对体外培养视网膜色素上皮细胞增生的直接抑制作用及可能机制。方法：通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度（250、200、120、100、50、10μg/ml）Rb2t Rb2 150μg/ml在不同作用时间（6－120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果：Rb2组细胞增殖受到抑制并出现细胞脱落，Rb2 200μg/ml具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，96h达高峰。Rb2组A值明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论：Rb2可能通过阻滞钙通道降低细胞内钙浓度、干扰RPE细胞代谢对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。