Notch3表达下调的血管平滑肌细胞模型的建立

目的通过RNA干扰建立Notch3表达下调的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)模型,探讨Notch3在VSMC表型转化中的作用。方法根据Notch3序列设计siRNA,建立腺病毒表达载体;VSMC分为空白组、空载体组及试验组;将载体导入VSMC中,通过荧光实时定量PCR检测Notch3表达水平。结果在感染复数为300时,VSMC的感染效率最高。以空白组为基准,试验组Notch3的相对表达量为0.64,下降了36%,而空载体组为0.88,仅下降了12%。结论成功构建Notch3表达下调的VSMC模型,为后期研究奠定了良好的基础。     

富含半胱氨酸蛋白61RNA干扰质粒抑制血管平滑肌细胞的增殖

目的 观察富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)RNA干扰质粒(pCyr61-shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响.方法 构建Cyr61 RNA干扰质粒转染大鼠血管平滑肌细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应及Western blot检测Cyr61 RNA和蛋白表达;采用MTT法检测细胞增殖;3H-标记胸腺嘧啶掺入法检测细胞DNA含量.结果 测序证实成功构建Cyr61 RNA干扰质粒;转染pCyr61-shRNA组mRNA及蛋白表达均明显降低(P<0 01);pCyr61-shRNA组细胞数、吸光度值和DNA含量均明显降低(P<0 01).结论 Cyr61 RNA干扰质粒抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖.     

富含半胱氨酸蛋白61 RNA干扰质粒抑制血管平滑肌细胞的增殖

目的观察富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)RNA 干扰质粒(pCyr61-shRNA)对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法构建 Cyr61 RNA 干扰质粒转染大鼠血管平滑肌细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应及 West-ern blot 检测 Cyr61 RNA 和蛋白表达;采用 MTT 法检测细胞增殖;~3H-标记胸腺嘧啶掺入法检测细胞 DNA 含量。结果测序证实成功构建 Cyr61 RNA 干扰质粒;转染 pCyr61-shRNA 组 mRNA 及蛋白表达均明显降低(P<0.01);pCyr61-shRNA 组细胞数、吸光度值和 DNA 含量均明显降低(P<0.01)。结论 Cyr61 RNA 干扰质粒抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖。     

RNA干扰技术选择性下调大鼠血管紧张素Ⅱ 1a型受体及其作用的实验研究

目的用RNA干扰技术选择性下调大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）上血管紧张素Ⅱ1a（AT1a）型受体的表达,并检验其对细胞活性及增殖的影响。方法构建携带U6启动子和AT1a特异短发夹RNA（shRNA）编码序列的质粒载体pAT1a-shRNA1,pAT1a-shRNA2,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con（pCon）为对照,转染原代培养的大鼠主动脉VSMCs,通过半定量RT-PCR和Western blot法检测AT1a、AT2受体的表达情况,以内参照β-肌动蛋白进行标化。用四甲基氮唑盐（MTY）比色法（测A490nm值）检验其对细胞活性及血管紧张素Ⅱ促增殖效应的影响。结果pAT1a-shRNA1使AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低82％和69％,pAT1a-shRNA2使之分别降低77％和56％,差异有统计学意义。转染对照质粒组与空白对照组AT1a受体表达差异无统计学意义;各组AT2受体表达差异无统计学意义。单纯转染质粒各组A490nm差异无统计学意义,给予血管紧张素Ⅱ刺激后,pAT1a-shRNA1、pAT1a-shRNA2组A490nm显著低于空白对照组和对照质粒组。结论RNA干扰技术能选择性下调原代培养的VSMCs AT1a受体的表达,并显著抑制血管紧张素Ⅱ促细胞增殖的效应,无明显细胞毒性。这可能为相关基因的功能研究提供新的方法,亦可能为心血管疾病基因治疗的探索开拓新的思路。     

前蛋白转化酶枯草溶菌素9小分子干扰RNA对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因沉默后对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,初步探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)蛋白表达在其中的作用。方法建立PCSK9小分子干扰RNA(siRNA)模型,培养VSMC,分为空白对照组、阴性转染组和阳性转染组,选取转染效率最高的PCSK9siRNA对VSMC进行干预,分别于12、24、36、48、60h用MTT法测定吸光度(A)值,绘制增殖曲线,观察其对VSMC增殖的影响,转染48h后用Western blot印迹法检测细胞内LRP-1蛋白表达情况。结果与阴性转染组比较,阳性转染组24、36、48和60h的A值明显下降(P<0.05),PCSK9siRNA抑制VSMC的增殖(P<0.05)。与空白对照组和阴性转染组比较,阳性转染组LRP-1蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论 PCSK9siRNA能有效抑制VSMC的增殖作用,且这种作用可能与LRP-1蛋白表达上调有一定的关系。     

RNA干扰下调钙调蛋白激酶Ⅱδ表达对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响

目的:用RNA干扰技术下调乳鼠心肌细胞钙调蛋白激酶Ⅱδ(CAMKⅡδ)的表达,观察CAMKⅡδ对心肌细胞肥厚及细胞内钙浓度的影响。方法:构建针对CAMKⅡδ基因的特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pCAMKⅡδshRNA-1,pCAMKδshRNA-2,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-HK(pHK)为对照,转染原代培养的乳鼠心肌细胞,通过半定量RT-PCR和Western blot法检测CAMKⅡδ表达情况,以内参照GAPDH进行标化。用钙荧光指示剂Fura-2/AM结合图像分析各组心肌细胞内钙离子浓度,用3H-LEU掺入量来检验各组心肌细胞在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激下促心肌细胞肥大效应的影响。结果:①pCAMKⅡδshRNA-1使CAMKⅡδ的mRNA和蛋白质表达较对照组分别降低62%和50%,pCAMKⅡδshRNA-2使之分别降低40%和35%,差异有统计学意义。pHK与空白对照组CAMKⅡδ表达差异无统计学意义。②给予AngⅡ(10-7mol/L)刺激48h后,pCAMKⅡδshRNA-1,pCAMKⅡδshRNA-2组的3H-LEU掺入量和细胞内钙浓度显著低于空白对照组和对照质粒(P<0.01)。结论:RNA干扰技术能选择性下调原代培养的乳鼠心肌细胞CAMKⅡδ的表达,并显著抑制AngⅡ的促细胞肥大和促细胞内钙超载的效应。     

RNA干扰选择性下调心肌细胞血管紧张素Ⅱ受体AT1a

目的用RNA干扰技术选择性下调乳鼠心肌细胞上血管紧张素Ⅱ1a型受体(AT1aR)的表达。方法用携带U6启动子和AT1a特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pAT1a-shRNA1,pAT1a-shRNA2,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesil-Con(pCon),转染原代培养的乳鼠心肌细胞,通过半定量RT-PCR和Western-blot法检测AT1a,AT2受体的表达情况,以内参照β-actin进行标化。结果pAT1a-shRNA1使AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低70%和67%,pAT1a-shRNA2使之分别降低66%和52%,转染对照质粒组较空白对照组AT1a受体表达及各组AT2受体表达无显著差异。结论RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌细胞AT1a受体的表达,为心血管疾病基因治疗的研究提供了新的思路。     

RNA干扰选择性下调心肌细胞血管紧张素Ⅱ受体AT1a

目的用RNA干扰技术选择性下调乳鼠心肌细胞上血管紧张素Ⅱ1a型受体(AT1aR)的表达.方法用携带U6启动子和AT-1a特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pAT1a-shRNA1, pAT1a-shRNA2,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesil-Con(pCon),转染原代培养的乳鼠心肌细胞,通过半定量RT-PCR和Western-blot法检测AT1a,AT2受体的表达情况,以内参照β-actin进行标化.结果 pAT1-shRNA1使AT1a的mRNA和蛋白质表达分别降低70%和67%,pAT1a-shRNA2使之分别降低66%和52%,转染对照质粒组较空白对照组AT1a受体表达及各组AT2受体表达无显著差异.结论 RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌细胞AT1a受体的表达,为心血管疾病基因治疗的研究提供了新的思路.     

微小RNA let-7c通过抑制血小板源性生长因子受体表达促进小鼠血管平滑肌细胞衰老

目的 探讨微小RNA(miRNA)let-7c参与小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)衰老的机制。方法 选择C57BL/6J小鼠40只,将小鼠分为对照组、老年组各20只,通过qPCR技术检测小鼠血清及主动脉血管中let-7c miRNA表达水平。从C57BL/6J小鼠主动脉中提取并原代培养VSMC。通过博来霉素体外诱导细胞衰老模型。使用Lipo2000脂质体转染法过表达或抑制细胞let-7c miRNA表达。将VSMC分为阴性对照(NC)组、博来霉素组、博来霉素+let-7c过表达组、博来霉素+let-7c抑制组,通过衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色评估组织或细胞衰老水平。将VSMC分为控制组、血小板衍生生长因子(PDGF)组、PDGF+let-7c过表达组,采用Western blot检测各组细胞蛋白表达。将VSMC分为空白组、let-7c过表达组、突变组、突变+let-7c过表达组,使用双荧光素酶报告基因验证let-7c靶点。结果 老年组小鼠主动脉和血清中let-7c miRNA相对表达水平显著高于对照组(6.37±0.81 vs 1.00±0.00,P<0.05;5....     

Ap-1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨Ap-1基因RNA干扰抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）基因对VSMCs增殖的影响。方法以Ap-1基因RNA干扰VSMCs基因,应用MTr比色试验检测VSMCs增殖情况,流式细胞仪检测VSMCs细胞周期,免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原（PCNA）表达。结果siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组Ap-1基因表达水平均降低;VSMCs的MTY吸光度值和PCNA表达量均降低;VSMCs出现明显的G0／G1期阻滞。结论RNA干扰介导的Ap-1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

JAK-STAT信号传导通路和血管平滑肌细胞

JAK-STAT信号传导通路是目前心血管分子生物学研究领域的热点。血管平滑肌细胞的增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节。JAK-STAT信号传导通路为调控血管平滑肌细胞增殖和迁移的基因治疗提供了新的思路。     

化学合成小干扰核糖核酸抑制大鼠血管平滑肌细胞组织因子表达

目的:探讨血管壁组织因子小干扰核糖核酸(siRNA)对大鼠血管平滑肌细胞组织因子基因沉默作用的可行性和有效性.方法:设计并合成针对大鼠组织因子的25 bp双链siRNA分子.使用组织因子siRNA、对照siRNA转染大鼠血管平滑肌细胞,同时设立空白对照,实验共分6组(各组n=5).荧光显微镜观察转染效率.血小板源性生长因子-BB刺激血管平滑肌细胞后逆转录多聚酶链反应检测组织因子信使核糖核酸表达,免疫印迹和免疫组化检测组织因子蛋白表达.结果:siRNA成功转染到血管平滑肌细胞,转染效率约(90.0±2.3)%.3对候选siRNA筛选出基因抑制效率最高一对,与阴性对照组相比,转染24 h组织因子信使核糖核酸表达减少(86.0±0.6)%,转染48 h蛋白质印迹分析组织因子蛋白表达减少(92.0±1.0)%,同时免疫组化检测组织因子表达明显减弱.结论:RNA干扰能明显下调大鼠血管平滑肌细胞组织因子表达.     

蛋白激酶GIa基因在蛛网膜下腔出血后对血管调控作用的研究

目的观察血性脑脊液对大鼠脑动脉平滑肌细胞(CASMC)的促增殖作用以及携带蛋白激酶GIa(PKGIa)基因的重组腺病毒载体(Ad-PKGIa)的干预作用,探讨PKGIa基因在蛛网膜下腔出血后继发慢性脑血管痉挛分子机制中可能的调控作用。方法相同密度(10~6/cm~2)接种后分为血性脑脊液组(B组)、生理盐水转染组(AN组)、血性脑脊液空载体组(KB组)和血性脑脊液转染组(AB组)。另设生理盐水对照组(N组)。采用组织块法原代培养CASMC。采用RT-PCR和Western blot检测Ad-PKGIa转染CASMC后PKGIa基因的表达。采用MTT法、~3H-TdR掺入法检测血性脑脊液对CASMC增殖的刺激作用以及Ad-PKGIa的抑制作用。结果与转染前比较,Ad-PKGIa转染后1 d,CASMC内PKGIa mRNA水平和蛋白表达明显增高(P0.05)。与N组比较,B组、KB组~3H-TdR和MTT明显增多和升高(P0.05);与B组比较,AN组和AB组~3H-TdR和MTT明显减少和降低(P0.05);与KB组比较,AB组~3H-TdR和MTT明显减少和降低(P0.05)。结论 PKGIa信号途径在蛛网膜下腔出血后,继发慢性脑血管痉挛分子机制中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一。     

阿托伐他汀对家兔动脉粥样硬化VSMC凋亡的影响及其相关分子机制

目的分析家兔动脉硬化时大电导钙激活钾通道(BKCa)的表达以及阿托伐他汀干预后的变化,探讨阿托伐他汀对家兔动脉硬化血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响及其相关分子机制。方法家兔分为正常组、动脉粥样硬化组、阿托伐他汀组,HE染色观察家兔动脉粥样硬化病变,TUNEL检测VSMC凋亡并计算凋亡指数(AI),原位杂交法检测兔胸主动脉BKCaβ亚单位KCNMB1基因的表达,蛋白印迹法检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达。结果动脉粥样硬化组胸主动脉内膜显著增厚,呈较典型的动脉粥样硬化病变;阿托伐他汀组VSMC凋亡指数较正常组、动脉粥样硬化组明显升高(36.51%±1.53%比6.80%±1.08%、27.83%±1.36%,P0.01);动脉粥样硬化组KCNMB1基因的表达较正常组明显下调(105.12±5.50比147.33±5.76,P0.01),而阿托伐他汀组KCNMB1基因的表达较动脉粥样硬化组明显增加(116.43±6.92比105.12±5.50,P0.01);阿托伐他汀组p-ERK1/2表达量低于动脉粥样硬化组(0.90±0.14比3.48±0.91,P0.01)。结论阿托伐他汀诱导动脉粥样硬化VSMC凋亡,该现象可能与其上调BKCa的KCNMB1基因表达及抑制ERK信号途径磷酸化有关。     

应用RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制和表达

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默(PTGS)过程中,与双链RNA有同源序列的单链RNA(如mRNA)被降解,从而阻断基因表达。RNAi过程的关键是由双链RNA     

RNAi技术在胰腺癌中的应用

RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默的过程,是一种高效、高特异性的抑制基因表达的新途径。现将RNAi技术的作用机制及RNAi在胰腺癌中的应用作一综述。     

Regulation of plasminogen activator inhibitor-1 secretion by urokinase and tissue plasminogen activator in rat epithelioid-type smooth muscle cells

Tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase (uPA) are targets of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) inhibition. We have previously shown that both proteases can also induce PAI-1 secretion in rat smooth muscle cells (SMCs). We now report that both proteases appear to use very similar cellular mechanisms for signal transduction. They induced PAI-1 secretion using a pathway(s) involving protein kinase C (PKC). They also activated the Raf/Mek/mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, which lies downstream of PKC activation. Activation of protein kinase A (PKA), however, lowered PAI-1 secretion induced by uPA and tPA, as a result of an inhibition of the PKC pathway and inhibition of Raf, Mek and MAPK phosphorylations. Src and syk family non-receptor tyrosine kinases (TK) were also involved in PAI-1 induction. The mechanisms of interaction of these tyrosine kinases with other pathways appeared to be quite different: src appeared to act within the PKC and PKA pathways, while syk operated independently of these pathways. Furthermore, whereas src inhibition resulted in inhibition of Raf/Mek/Erk phosphorylations, syk inhibition could only inhibit Mek and Erk phosphorylations but not the phosphorylation of Raf. These multiple pathways utilized by uPA and tPA to modulate PAI-1 secretion might be involved in determining the proteolytic or antiproteolytic potential of the SMCs under different pathophysiological conditions.     

肝细胞生长因子受体在血管平滑肌细胞增殖凋亡中的表达

目的研究球囊扩张术后血管平滑肌细胞(VSMCs)中肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-Met)mRNA表达的变化,明确HGF受体与VSMCs增殖凋亡分子机制的相关性。方法用逆转录聚合酶链式反应检测36只兔腹主动脉球囊损伤前后不同时间点VSMCs中c-Met的mRNA表达水平;体外实验将选择性c-Met蛋白抑制剂NK-4作用于免VSMCs,运用MTF分别于0、24、48及72h检测细胞增殖状态;流式细胞仪观察NK-4对细胞凋亡的影响,进一步采用Western blot检测药物作用前后细胞周期蛋白(Cyclin D1)、凋亡蛋白(Bcl-2)的表达。结果球囊损伤后VSMCs c-Met mRNA的表达水平明显高于正常VSMCs(P＜0．01),平均为对照组2．42倍;对照组S及G_2/M期DNA百分含量与处理组比值分别为1．31,1．62(P＜0．01),NK-4呈时间、剂量依赖性方式抑制VSMCs增殖,促进其凋亡。72h时对照组与NK-4(1．0mg/L)处理组Cyclin D1、Bcl-2表达水平比值分别为2．37和3．81(P＜0．01),故两者表达水平随NK-4作用时间延长而下降。结论c-Met在球囊扩张术后血管平滑肌细胞中高表达可能在VSMCs过度增殖、凋亡受阻中起重要作用。选择性c-Met蛋白抑制剂NK-4可能通过Cyclin D1,Bcl-2影响VSMCs的增殖与凋亡,提示c-Met抑制剂可作为预防血管成形术后再狭窄新的候选药物。