结核分枝杆菌三种特异性抗体ELISA检测方法的建立

目的 建立以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68,建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接ELISA检测方法:ESAT6-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA、ESAT6-PPE68-ELISA。并与PPD-ELISA同时检测220例结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清,分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果 ESAT6-ELISA的敏感性为25%,特异性为95%;CFP10-ESAT6-ELISA的敏感性为45%,特异性为93%;ESAT6-PPE68-ELISA的敏感性为48%,特异性为85%。结论 三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于PPD-ELISA,但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于PPD-ELISA,其中CFP10-ESAT6-ELISA检测的效果最佳,PPE68可作为结核特异性诊断的候选抗原。     

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。方法：根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80％可产生高价的抗体。利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果：应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89．4％和79．6％,特异性分别为96．3％和93．9％。结论：高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。     

结核分枝杆菌rCFP10—ESAT6融合蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的实验研究

目的探讨以rCFP10-ESAT6融合蛋白为抗原用皮试法评价其对结核分枝杆菌（Mtb）和卡介苗（BCG）致敏豚鼠的鉴别意义。 方法分别用灭活H37Rv和BCG活菌致敏豚鼠．4wk后用不同剂量的rCFP10—ESAT6对同一只豚鼠作皮试，同时设立5IU结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）阳性对照及生理盐水（NS）阴性对照，于注射后24、48、72h测量红肿或硬结的直径。 结果以rCFP10-ESAT6为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为100．0％（21／21）、90．9％（10／11），以PPD为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为47．6％（10／21）、90．9％（10／11），以rCFP10-ESAT6为抗原的迟发型超敏反应（DTH）中，以1．0μg剂量效果最好．观察时间以皮试后24h效果最好，1．0μg重组融合蛋白在Mtb致敏豚鼠上引发的红肿、硬结比5IU PPD引发的红肿、硬结大。 结论rCFP10-ESAT6能诱导Mtb致敏豚鼠发生DTH，能特异区分Mtb致敏豚鼠及BCG免疫豚鼠，抗原剂量及反应时间是rCFP10—ESAT6诱导豚鼠DTH的主要影响因素。     

结核分支杆菌ESAT6蛋白的表达、纯化及抗原性研究

目的：获得重组ESAT6蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：分别用生理盐水和卡介苗免疫小鼠8周后,以结核分支杆菌接种小鼠。应用基因工程技术表达、纯化ESAT6蛋白,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rESAT6蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测小鼠或人血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-ESAT6在大肠杆菌BL2（DE3）细胞内以包涵体形式存在,分子量约6kDa,每100ml培养菌可获得约18mg纯化的重组蛋白。生理盐水和卡介苗免疫小鼠血后血清中抗ESAT6抗体无区别。结论分支杆菌攻击后,两组小鼠血清中抗ESAT6抗体均明显升高,但只有卡介苗组小鼠抗体水平超过平均值＋2标准误。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,33例正常人和32例结核病人血清一步法和PDD、rESAT6 ELISA检测抗结核抗体的特异性和敏感性分别为：一步法87.9%(29/33),65.6%(21/32),PPD93.9%(31/33),62.5%(20/32);rESAT6 97%(32/33),18.2%(4/32)。结论：pET24b-ESAT6大肠杆菌工程菌能以包涵形式高效表达重组ESAT6蛋白,卡介苗免疫对血清中ESAT6抗体无影响,结核病人血清中抗ESAT6抗体阳性率低,rESAT6纯化蛋白可作为结核病血清学诊断的混合抗原之一。     

以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

目的评价以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例,根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞,观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养,比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性。结果 52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查,其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%;PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%;血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中,ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%,χ2=5.786,P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%,χ2=8.847,P=0.003),与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%,χ2=0.396,P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%,κ=0.498,P=0.001)。结论以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性,可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。     

以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

目的 评价以CFP10／ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法 选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例,根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞,观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养,比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性。结果 52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查,其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%;PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%;血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中,ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%,χ²=5.786,P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%,χ²=8.847,P=0.003),与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%,χ²=0.396,P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%,κ=0.498,P=0.001)。结论 以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性,可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶（6kDa early secretory antigenic target,ESAT6）和培养滤液蛋白10（culture filtrate protein 10,CFP10）的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a（＋）构建成重组质粒pET—cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western—blot和ELISA分析。结果重组质粒pET—cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功（1：10^4）。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。     

胸腔积液中结核抗体检测对结核病的诊断价值

目的 :评价胸水中结核抗体在结核病诊断中的价值。方法 :观察胸腔积液中结核抗体在实验组 72例结核性胸膜炎患者和对照组 46例患者中的特异性和敏感性 ,并与PPD试验相比较。结果 :胸腔积液中结核抗体诊断结核性胸膜炎的特异性为 89.1 %,敏感性为 75 .0 %;而 PPD试验的特异性敏感性分别为 6 7.4%、6 3 .9%。结论 :胸腔积液中结核抗体的检测对结核性胸膜炎的诊断具有较高价值。     

T-SPOT.TB、TB-DNA、PPD、TB-DOT/TB-CK检测在结核病诊断中的临床价值

目的评价T-SPOT.TB、TB-DNA、PPD、TB-DOT/TB-CK检测在结核病诊断中的临床应用价值.方法利用T-SPOT.TB技术,测定120例确诊结核病患者,62例非结核疾病患者外周血单个核细胞中结核感染特异的效应T淋巴细胞的频率.同时检测两组患者的TB-DNA、PPD和TB-DOT/TB-CK.结果 T-SPOT.TB敏感性、特异性分别为88.3%、91.9%,TB-DNA敏感性、特异性分别为75.9%、98.2%,PPD敏感性、特异性分别为62.4%、71.9%,TB-DOT/TB-CK敏感性、特异性分别为76.3%、80%.结论 T-SPOT.TB较其它传统方法TB-DNA、PPD、TB-DOT/TB-CK对结核病诊断有高度的敏感性和特异性,值得临床推广.     

蛋白芯片法检测结核抗体在活动性结核病的诊断价值

目的:评价蛋白芯片法检测结核抗体对结核病的诊断价值。方法:采用蛋白芯片法对163例痰涂片阴性的肺结核患者、156例肺外结核患者及95例非结核病变患者血清标本进行检测,并对上述所有病例同时行PPD试验。结果:PPD试验对诊断结核病的敏感性为55.8%,特异性为62.3%,蛋白芯片法对诊断结核病的敏感性为60.5%,特异性为95.8%。肺结核患者与肺外结核患者PPD试验结果相比差异无统计学意义(P>0.05),肺结核患者与肺外结核患者蛋白芯片法检测结果相比差异有统计学意义(P<0.05)。PPD试验与蛋白芯片法联合检测阳性率为74.9%,优于单一的PPD试验或蛋白芯片法(P<0.05),差异有统计学意义。结论:蛋白芯片法诊断结核病特异性高,联合PPD试验具有较高的诊断价值,可以作为诊断结核病,特别是肺外结核病的重要辅助诊断方法。     

比较结核感染T细胞斑点试验、结核菌素试验以及血清结核抗体检测对诊断肺结核的价值

目的：比较结核感染T细胞斑点试验(T-cell spot of tuberculosis,T-SPOT.TB)、结核菌素试验(purified protein derivative,PPD)以及血清结核抗体(Tuberculosis antibody,TB-Ab)检测对肺结核的诊断价值。方法随机选取自2014年1月—2016年8月在该院确诊为肺结核患者60例,作为肺结核组;确诊非肺结核就诊者30名作为非肺结核组,两组就诊者均接受了T-SPOT.TB、PPD以及TB-Ab检测。比较两组接受不同检测方法对诊断肺结核灵敏性与特异性的差异。结果 T-SPOT.TB检测诊断肺结核的敏感性为73.30%,特异性为80.00%;PPD试验诊断肺结核的敏感性为60.00%,特异性为86.70%;血清TB-Ab检测检测诊断肺结核的敏感性为53.30%,特异性为66.70%。结论 T-SPOT.TB诊断肺结核的敏感性高于PPD试验和血清结核抗体检测;T细胞斑点试验T-SPOT.TB诊断肺结核的特异性高于血清结核抗体检测,与PPD试验差异无统计学意义。     

结核感染T细胞斑点试验、PPD、CRP在儿童结核诊治的临床意义

目的：分析儿童结核病诊断中结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT-TB）的应用价值。方法随机选取2014年1月—2015年7月在福建省福州肺科医院住院的儿童结核及非结核性肺部疾病患儿90例,包括结核病47例（A组）和非结核性肺部疾病患儿43例（B组）,采用SPSS 18.0统计学软件进行分析,采用χ2检验比较T-SPOT-TB与痰抗酸杆菌涂片、结核分枝杆菌培养、结核抗体、PPD试验,比较其检测结果,以P<0.05为差异有统计学意义,同时对两组患儿进行C反应蛋白（CRP）测定,分析CRP在结核病鉴别诊断中的意义。结果 T-SPOT-TB检测诊断结核病的敏感度为87.2%（41/47）,特异度为97.7%（42/43）,PPD试验诊断结核病的敏感度为48.9%（23/47）,特异度为67.4%（29/43）,与PPD试验相比,T-SPOT-TB检测诊断结核病的敏感度及特异度均比 PPD试验高,差异均有统计学意义（χ2=11.15,11.07,P<0.05）。结核病患儿T-SPOT-TB检测的阳性率为87.2%,显著高于结核抗体检测、抗酸杆菌涂片、结核分枝杆菌培养,差异均有统计学意义（χ2=25.03、31.03、16.41,P<0.05）。 CRP测定结核病组的平均值为（33.09±19.96）,非结核病组的平均值为（26.79±18.13）,两组统计学比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 T-SPOT-TB检测具有较高的敏感度和特异度,是诊断儿童结核的快速敏感方法,在儿童结核早期临床诊断中有重要的应用价值。结核病中C反应蛋白可升高,但是单纯的C反应蛋白测定在鉴别结核病与非结核性疾病中意义不大。     

血清抗结核抗体检测对肺结核诊断的价值

（1）目的 比较血清抗结核分支杆菌抗体、结核菌素（PPD）皮试及痰结核菌涂片对活动性结核病诊断的意义。（2）方法 检测血清抗结核分支杆菌抗体在各类结核病人中的灵敏度和特异度以及与痰涂片查结核菌、PPD皮试的一致性。（3）结果 血清抗结核分支杆菌抗体诊断结核病的灵敏度为70．4％，特异度为94．0％，与痰涂片阳性和PPD皮试阳性的一致率分别为67．4％和64．8％。（4）结论 血清抗结核分支杆菌抗体与PPD皮试及痰结核菌涂片一样，可作为诊断结核病的一种辅助检查方法。     

T-SPOT.TB在涂阴肺结核早期诊断中的价值研究

目的观察结核感染T细胞斑点试验(T cell spot test of tuberculosis infection,T-SPOT.TB)对涂阴肺结核早期的诊断价值。方法随机选取我院2015年4月~2017年10月收治的60例涂阴肺结核病患者以及140例非结核健康者为本次实验研究对象,实验对象均行结核菌素纯蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of Tuberculin,PPD)试验检测、T-SPOT.TB检测和结核抗体(Tuberculosis Antibody,TB-AB)测试,比较三种检测方式对肺结核的临床检出效果。结果 60例涂阴肺结核病患者T-SPOT.TB敏感性为96.7%,T-SPOT.TB检测敏感性明显优于TB-AB、PPD,140例非结核健康者T-SPOT.TB特异性为97.9%,T-SPOT.TB检测特异性明显优于TB-AB、PPD,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 T-SPOT.TB诊断涂阴肺结核的敏感性、准确性和特异性均较高,具有较高的临床应用价值。     

γ干扰素释放实验在早期膝关节结核临床诊断中的应用价值

目的:探讨γ干扰素释放实验（IGRA）在早期膝关节结核诊断中的应用价值。方法:随机抽取123例非结核患者,和已经穿刺活检明确诊断,但是X线未有明显病理改变的149例早期膝关节结核患者,以及明确诊断并伴有X线明显病理改变的138例中晚期患者（所有患者半年内均无新发肺结核）,进行IGRA实验以及PPD实验,比较两种方法的特异性和敏感度。比较IGRA实验阳性的早期患者和阴性早期患者的疾病相关因素,寻找IGRA实验漏诊的原因。结果:非结核患者实验结果显示,IGRA实验特异性为95.1%,而临床上常规使用的PPD实验特异性仅为64.2%,差异具有统计学意义（P<0.05）;对于早期膝关节结核的患者,IGRA实验敏感度为83.2%,PPD实验敏感度为67.8%,差异具有统计学意义（P<0.05）;而对于中晚期患者,IGRA实验敏感度为100%,PPD实验敏感度上升为83.3%,差异具有统计学意义（P<0.05）;IGRA阳性患者血沉（ESR）为（38±4.11） mm/h,阴性患者为（14±3.72） mm/h,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:IGRA实验对于膝关节结核诊断的敏感度明显高于PPD实验。诊断早期膝关节结核时,如果患者的血沉速度大于20 mm/h, 并且IGRA实验阳性,则患者患有膝关节结核的可能性较大,临床医师可以进行穿刺活检以明确诊断。IGRA实验对于早期膝关节结核的临床诊断有重要的辅助意义,有较大的推广价值。     

酶联免疫斑点法检测结核性胸水T淋巴细胞分泌IFN-γ的免疫功能

目的:研究结核性胸膜炎患者胸水T淋巴细胞(TLC)特异性分泌γ-干扰素(IFN-γ)的免疫反应,为结核性胸水的诊断提供依据。方法:应用淋巴细胞分离技术分离13例结核性胸水和11例恶性胸水TLC,体外利用PPD抗原刺激,用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测两组胸水TLC分泌IFN-γ的免疫反应。每例患者院内常规做PPD试验。结果:结核性胸水TLC分泌IFN-γ的免疫反应阳性率为84.62%(11/13例),明显高于恶性胸水组18.18%(2/11例),两者之间差异有显著性(P<0.01)。ELISPOT和PPD试验的敏感性分别为84.62%,46.15%,两者之间有明显差异性(P<0.01)。而ELISPOT和PPD试验的特异性分别为81.82%,90.91%,两者之间差异不明显。结论:ELISPOT检测结核性胸膜炎的敏感性和特异性均较高,有助于临床上对结核性胸水的鉴别诊断。     

三种方法联合检测对菌阴肺结核的诊断价值

目的：探讨血清抗结核抗体(LAM)、痰聚合酶链反应(PCR)、结核菌素的纯蛋白衍生物(PPD)5IU皮内注射试验三种方法联合检测对菌阴肺结核的诊断价值。方法：以PCR，LAM，PPD 5IU皮试三种方法对42例初治菌阴肺结核患、46例初治菌阳性肺结核患及36例健康人进行检测。结果：单项检测敏感性与特异性依次为LAM67．4％，94．4％；PCR95．7％，97．2％；PPD56．5％，97．2％。单项检测对菌阴性肺结核的检出率分别为PCR47．6％。LAM31．0％，PPD21．4％。联合检测对菌阴性肺结核的检出率明显高于单项检测，联合检测特异性大于90％。结论：三种方法联用对菌阴肺结核的检出率明显增加，特异性好，值得推广。