SELEX法筛选炭疽芽孢杆菌适配子的研究

目的：利用SELEX（system evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选,找能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的寡核苷酸适配子（aptamer),方法：体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA库,通过SELEX技术,以炭疽牙直菌疫苗株A．16R的芽孢为靶标进行15轮的筛选,利用生物素－亲和素显色系统判断寡核苷酸与牙孢的结合活性,结果：随着筛选轮数的增加,PCR扩增电泳条带渐单纯,寡核苷酸与芽孢结合后显色,D值提高9倍以上,D值随适配子结合量的增加而递增,结论：已初步筛选到与炭疽芽孢具有亲和力的适配子。     

炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析

目的：初步分析由我国炭疽疫苗株A16R所生产的无菌培养滤液中的主要成分。方法：运用免疫蛋白质组学的手段,从炭疽A16R疫苗株无菌培养滤液的二维凝胶电泳中选择与保护性抗体结合和不与该血清结合但丰度高的蛋白质点,进行质谱鉴定和信号肽分析。结果：共选择73个点,从炭疽芽孢杆菌数据库中鉴定出66个。在66个点中,有43个点与保护性血清结合;23个为高丰度蛋白,不与该血清结合。在与保护性血清结合的43个点中,13个点为不同大小的PA分子,其中相对分子质量83×10^3和63×10^3占主导,相对分子质量较小的片段仅4个。其余成分包括炭疽表面蛋白EA1、Sap、胶原黏附蛋白、伴侣分子DnaK等。结论：我们制备的炭疽无菌培养滤液中含有PA成分,PA是炭疽疫苗的重要保护性抗原。但PA以外的其他成分在抗炭疽免疫中起何种作用,是否参与诱发机体免疫应答有待进一步研究。     

炭疽芽孢杆菌突变株AP431与A16R的生物特性比较研究

目的 系统评价所构建的炭疽芽孢杆菌突变株AP431的生物特性,并与出发菌株A16R对比,为后续研究提供数据基础.方法 绘制生长曲线比较突变株AP431和A16R的生长性能;糖酵解实验分析二者生化特性的差异;免疫印迹和流式细胞术检测菌株的保护性抗原PA蛋白表达情况;连续传代共培养分析其竞争关系;过氧化氢灭菌实验和抑菌圈实验分析菌株对活性氧的耐受性;以C57小鼠为动物模型比较二者的毒力大小.结果 与A16R相比,突变株AP431生长稍慢,生化特性基本一致.突变株AP431的PA蛋白在S层呈现表达良好,并且在培养基上清、细胞内和外膜上的表达水平均比A16R高.共培养实验发现AP431的生存竞争能力明显减弱.过氧化氢敏感实验表明,突变株AP431对过氧化氢的敏感性比A16R显著增高.动物毒力实验结果显示,分别在两种注射剂量下,突变株的致死率显著降低,与A16R组相比差异显著(P＜0.01).结论 与A16R相比,炭疽菌突变株AP431保护性抗原PA表达水平明显提高,毒力明显降低,可作为新的疫苗候选株进行进一步研究.     

炭疽芽孢杆菌中和性抗体的研究进展

炭疽芽孢杆菌的中和性抗体在炭疽的被动免疫和治疗中有着重要的意义。抗保护性抗原（protective antigen,PA）抗体既能够抑制芽孢出芽又具有中和毒素的作用。抗致死因子（lethal factor,LE）/水肿因子（edema factor,EF）抗体能阻断致死毒素（lethal toxin,LT）/水肿毒素（edema toxin,ET）发挥活性,荚膜抗体能结合补体导致细菌繁殖体裂解。同时中和性抗体的水平也可以作为保护性免疫的评价标准。另一方面中和性单克隆抗体可以作为分析确定PA的中和性表位的有力工具。对中和性表位的分析既有利于探索炭疽毒素致病机制,也可以为现有炭疽疫苗的使用和发展表位疫苗等新型炭疽疫苗提供理论依据。该文综述了炭疽芽孢杆菌中和性抗体的研究进展。     

定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究

目的建立一种简便、快速、定量检测炭疽芽孢杆菌的PCR方法。方法采用TaqMan荧光探针技术,针对炭疽芽孢杆菌质粒pXO1、pXO2上的基因设计引物;用炭疽芽孢杆菌（Sterne株）污染环境土壤来模拟实际样本,比较了从土壤中提取DNA的不同方法对检测效果的影响,并与同类进口试剂进行了平行比对。结果以含有检测目的片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度可达到101拷贝/μl;用Sterne株芽孢悬液污染土壤,检测灵敏度可达2.5×103cfu/g土壤。我们研制的试剂与进口试剂在敏感性和准确性方面一致,且操作简便。结论本研究建立的炭疽芽孢杆菌实时定量PCR检测方法可特异、灵敏地检测土壤标本中可疑目标菌。     

基于蛋白芯片对不同方法预处理疫苗的抗原性评价

目的分别对4种疫苗（A群脑膜炎球菌多糖疫苗、吸附白喉破伤风联合疫苗、麻疹减毒活疫苗、炭疽芽孢杆菌疫苗株裂解液）进行不同的预处理,使其能作为抗原检测所诱导的抗体。方法分别用饱和碳酸钠溶液、重铬酸钾与稀盐酸混合液、80%乙醇处理A群脑膜炎球菌多糖疫苗,用饱和碳酸钠溶液、重铬酸钾与稀盐酸混合液处理吸附白破联合疫苗和麻疹减毒活疫苗,PAGE纯化炭疽杆菌疫苗株裂解液中的抗原,以蛋白芯片比较其抗原性。结果比较了不同方法预处理4种疫苗的效果,初步验证了所处理的疫苗具有良好的抗原性。结论运用恰当的处理方法对疫苗进行预处理,可使其在检测相应抗体时表现出良好的抗原性,为以疫苗作为抗原检测相应抗体打下了基础。     

炭疽芽孢杆菌S-层蛋白功能研究进展

炭疽芽孢杆菌是人畜共患病炭疽的病原菌。目前,对炭疽杆菌2个毒力大质粒（编码主要毒力基因的pXO1与编码合成荚膜基因的pXO2）的研究比较深入;炭疽杆菌细胞壁与荚膜间还存在一种蛋白性质的类晶体（paracrystalline）结构：S-层（surface-layer,表层）结构。炭疽杆菌的S-层蛋白主要为表面排列蛋白（surface array pro-tein,Sap）和胞外抗原1（extracellular antigen 1,EA1）,此外,在炭疽杆菌中还存在其他一些与S-层相关的蛋白,了解这些蛋白的相互作用及免疫机制对深入认识炭疽杆菌的致病机制具有重要意义。本文将就近年来关于炭疽杆菌S-层蛋白成分、与细胞壁的连接、S-层基因的调控、致病性及其与宿主免疫机制的关系等方面的研究进展做一简要综述。     

炭疽芽孢恐怖及其相关问题

美国炭疽芽孢恐怖事件的发生引起了全球的广泛关注。该事件在造成医疗和心理等方面影响的同时 ,对生物战剂的侦察和检验也是一个挑战。本文就炭疽芽孢杆菌的特性、生物恐怖的特点、影响及其相关问题进行了介绍。     

炭疽芽孢杆菌芽孢萌发研究进展

芽孢是炭疽芽孢杆菌为应对不适的外界环境而形成的一种生命形式,休眠期的芽孢可以通过萌发恢复生长成为繁殖体。萌发过程作为关键步骤,可以由营养萌发剂和一些非营养类物质或者在其他情况下触发。在萌发过程中,萌发剂通过与存在于芽孢内膜上的萌发剂受体结合来触发芽孢核内各种阳离子的释放以及芽孢核对水的吸收。在芽孢皮层的肽聚糖被酶水解后,芽孢核逐渐完全水合化,开始进行新陈代谢以及大分子的合成活动,逐渐成长为一个新的营养细胞。该文将从萌发受体、芽孢皮层水解酶功能等方面对炭疽菌芽孢萌发机制进行阐述。     

抗炭疽芽孢杆菌菌体抗原单克隆抗体的制备及其鉴定

炭疽芽孢杆菌 (简称炭疽菌 )是经典的生物战剂 ,被列入国际禁止生物武器公约生物战剂清单。“9·11”事件以后 ,在被列入美国国家反恐预案红色警报 (最高级别 )的可引起生物恐怖的烈性病原微生物中 ,炭疽菌是第一个。炭疽菌用于生物恐怖袭击一般是以喷洒和放置的形式实施。快速侦检是确定是否发生生物恐怖袭击的重中之重 ,“炭疽邮件”事件后 ,美国投入大量经费对环境中炭疽菌污染的快速检测进行研究。美国 2 0 0 2年报道了抗炭疽细胞壁和荚膜多糖抗原单克隆抗体 (McAb)用于直接免疫荧光法 (DFA)检测。在 2 30株炭疽菌中 ,只有 1株未检出 …     

靶标诱导变构解离SELEX技术筛选皮质醇特异核酸适体

目的通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术获得皮质醇特异性核酸适体,建立高品质、超敏、易用和稳定的皮质醇检测试剂盒。方法人工合成两端固定序列,中间为35 bp随机序列,生成80 bp长度ssDNA文库,捕获序列固定在磁珠上,文库与其退火组装,皮质醇的特异核酸适体通过我们建立的靶标诱导变构解离SELEX（TISSD-SELEX）技术获得。最后一轮的PCR产物经克隆测序,MegAlign和RNAstructure软件分析其一级和二级结构。实时（real-time）apta-PCR方法分析G12的亲和活性。结果经过12轮筛选后,获得10个皮质醇的核酸适体。序列分析显示,特异核酸适体以高G含量核酸序列为主,软件预测其中8个序列主要以G四联体二级结构为主,候选核酸适体G12显示了可以作为生物探针用于皮质醇检测。结论成功建立TISSD-SELEX技术,获得小分子靶标皮质醇核酸适体。小分子靶标无需将其偶联在固相介质或大分子上,对靶分子结构、性质无特殊要求,因而有望成为小分子靶标核酸适体筛选的通用技术方法。     

特异识别已分化PC12细胞的ssDNA适体的结构和功能研究

目的：研究特异识别已分化PC12细胞的ssDNA适体的二级结构及截短前后的适体与已分化PC12细胞的结合能力。方法：利用RNA structure3．5软件对截短前后的适体的空间结构进行模建，体外合成这些截短适体，利用流式细胞术和荧光显微镜研究适体与已分化PC12细胞的结合能力。结果：单茎环结构是适体与已分化PC12细胞结合的二级结构；截短后的适体与已分化PC12细胞的结合能力明显大于与未分化PC12细胞结合能力；AP17-38与已分化PC12细胞结合的荧光强度明显大于与未分化PC12细胞结合的荧光强度；截短前后的适体均能够特异识别混合物中已分化PC12细胞。结论：截短后的适体能够保留适体的空间结构，而且与已分化PC12细胞的亲合力不会降低。     

Anti-MUC1 aptamers: radiolabelling with Tc and biodistribution in MCF-7 tumour-bearing mice

IntroductionAptamers previously selected against the protein core (AptA) or the tumour glycosylated (AptB) MUC1 glycoprotein have been conjugated to MAG2 and labelled with ^99mTc, for the potential use as radiopharmaceuticals for diagnostic imaging of breast cancer.MethodsThe conjugation was achieved in high yield using standard peptide coupling reactions between an amino modification on the aptamer and the activated carboxylic group on the ligands. The retention of the affinity of the MAG2 modified AptA for the MUC1 protein core was confirmed using a fluorescent intercalator displacement binding assay. The labelled aptamers were separated from free ^99mTc using ultrafiltration and monitored by high-performance liquid chromatography at all stages, to ensure that only radiolabelled aptamers were produced. The biodistribution properties of the two aptamer-radionuclide conjugates were analysed in MCF-7 tumour bearing mice and compared.ResultsEfficient and convenient labelling of the two aptamers with ^99mTc was achieved as the last step of the synthesis (post-conjugation labelling). Both the aptamer-chelator conjugates had strong ^99mTc binding properties and the resulting complexes were stable in vivo, both in terms of nuclease degradation and leaking of the metal. The radiolabelled aptamers showed a high renal clearance and a high uptake in the intestine.ConclusionsAptA and AptB have been successfully conjugated in high yield to the ligand MAG2 and labelled with ^99mTc. The radiolabelled aptamers showed different tumour uptake and clearance, but will require further development prior to diagnostic use.     

Extending the lifetime of anticoagulant oligodeoxynucleotide aptamers in blood

We have investigated (123)I and (125)I DNA aptamer analogs of anticoagulant DNA aptamers to thrombin exosite 1 and exosite 2 for thrombus imaging potential. Two severe problems are rapid clearance from circulating blood and blood nuclease. With aptamers (unlike antisense) the nucleotide analogs used in polymerase chain reaction-selection cycles also must be used in the radiotracer. We investigated 3'-biotin-streptavidin (SA) bioconjugates of the aptamers to alleviate these problems. Blood nuclease assays and biodistribution analysis were used in the mouse and rabbit. We found that 3'-biotin protected the aptamers significantly from blood nuclease in vitro, but it did not slow in vivo clearance. In contrast, the 3'-biotin-SA bioconjugates were resistant to blood nuclease in vitro and were also longer-lived (10-20 times) in vivo. Bioconjugate aptamers retained affinity for thrombin. Two solutions emerge: 1) In noncirculating blood (within a thrombus) 3'-biotin extends aptamer lifetime, whereas 2) in circulating blood (the transport medium), where more aggressive clearance is encountered, 3'-SA extends aptamer lifetime.     

金纳米棒制备、修饰及与寡核苷酸适配子的耦联

目的金纳米棒的制备、修饰及与寡核苷酸适配子的耦联。方法利用种子调制生长法制备了金纳米棒,采用化学桥联方法对金纳米棒进行m-SH-PEG修饰及与靶向定位乳腺癌细胞的寡核苷酸适配子的耦联。结果成功制备了金纳米棒,以CTAB包裹的金纳米棒表面光滑、尺寸均一、分散性和稳定性良好;Zeta电位检测表明m-SH-PEG已成功修饰金纳米棒,琼脂糖电泳证实寡核苷酸适配子与金纳米棒成功耦联。结论成功地进行了金纳米棒的制备、修饰及与寡核苷酸适配子的耦联。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组非编码区的序列测定及分析

目的对西尼罗病毒(WNV)Chin-01株基因组非编码区(UTR)序列进行测定,了解其与已报道毒株的序列差异及系统发育关系。方法采用5′和3′RACE法对Chin-01株病毒基因组的UTR进行RT-PCR扩增,测定扩增产物序列,采用DNAstar软件对该株及其他9株WNV的UTR进行序列同源性分析,同时构建了基于3′UTR的系统发育树,并用RNA structure软件预测其二级结构。结果Chin-01株基因组5′和3′UTR分别为96nt和630nt,序列同源性分析的结果表明,其5′UTR与其他9株的同源性均达到99%或100%,而3′区UTR与埃及Eg101株的同源性最高,达98·1%。5′UTR的起始核苷酸为AG,并含有一段与3′UTR互补的14nt序列。3′UTR的末端为CUOH,包含一段完全保守的5nt序列,以及三个保守的称为CS2、RCS2和CS1的基序。二级结构预测发现,Chin-01株5′UTR呈长茎环结构,3′UTR的3′端也可形成多个保守的茎环结构。结论Chin-01株与埃及Eg101株亲缘关系最为密切。     

E型肉毒神经毒素(BoNT)基因序列分析及其B细胞表位预测

目的：分析不同E型肉毒梭菌的肉毒神经毒素（BoNT）基因序列的同源性，预测E型BoNT的B细胞表位。方法：用LaserGene软件中的MegAlign程序比对GenBank中5株不同E型肉毒梭菌的BoNT基因序列；分别利用BioSun和LaserGene软件分析E型BoNT的表位参数、蛋白质二级结构及氨基酸序列保守性，利用三维结构显示软件Cn3D，分析E型BoNT可能的B细胞表位的空间定位，进而预测E型BoNT的B细胞表位。结果：5个E型BoNT基因核酸序列同源性为97．2％-100％，氨基酸序列同源性为95％-100％；E型BoNT轻链中的62-78，111-127区段，重链中443-465，661-677，693～709，727-743，853-869，1093-1109，1128-1144，1163-1179区段最有可能是其B细胞优势表位。结论：我们利用不同分析软件，结合多参数综合预测出了E型BoNT的多个B细胞表位，为进一步鉴定E型BoNer的B细胞表位及其多表位疫苗的研究奠定了基础。     

核酸适体和胶体金检测皮质醇含量的方法与应用

目的通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术获得皮质醇特异性核酸适体,应用核酸适体和胶体金建立一种灵敏的定量检测皮质醇含量的方法。方法采用柠檬酸钠还原法和硼氢化钠还原法制备胶体金,用核酸适体、胶体金聚集显色法检测皮质醇含量。结果相比20nm胶体金,采用5nm和13nm胶体金颗粒具有较好的灵敏度、重复性和线性范围,5nm胶体金颗粒用于皮质醇的检测的线性范围为10．1～320μmol／L,标准曲线相关系数r为0．9993,其重复性较好,标准差小于平均值10％。结论本实验建立了一种高灵敏性的能特异性地检测皮质醇标准品含量的方法。     

Sequential use of ferumoxide particles and gadolinium chelate for the evaluation of focal liver lesions on MRI

This study describes the sequential use of ferumoxide (superparamagnetic iron oxide) particles and nonspecific extracellular gadolinium chelate (Gd) for evaluation of focal liver lesions on MRI to evaluate order of contrast administration and imaging effect of the first contrast agent on sequences acquired after the second contrast agent. Thirteen patients underwent MR examinations that included ferumoxide and Gd. The order and timing of administration were as follows: separate sessions (three patients; Gd study 4-19 days before ferumoxide study), same session, Gd first (seven patients; Gd study 1-2 hours before ferumoxide study), and same session, ferumoxide first (three patients; ferumoxide administered less than 1 hour before Gd study). Postcontrast sequences were reviewed in a randomized, blinded fashion by two separate investigators. Determination was made regarding whether (a) the presence of the first agent administered could be detected on sequences obtained after the second agent and (b) the presence of the first agent interfered with the image quality of those sequences. No evidence for the presence of Gd was appreciated by either observer on postferumoxide sequences acquired in separate session studies. In same session, Gd first studies, the presence of Gd was observed in six of seven patients on T1-weighted spoiled gradient-echo (SGE) images obtained after ferumoxide administration. The presence of Gd was not apparent in seven of seven patients on T2-weighted fat-suppressed images obtained after ferumoxide. In same session, ferumoxide first studies, the presence of ferumoxide was appreciated on post-Gd sequences in two of three patients. The presence of ferumoxide did not appreciably diminish image quality on those sequences. Exact agreement was achieved by the independent investigators. Our results suggest that Gd and ferumoxide can be administered sequentially within one study session without substantial loss of diagnostic information obtained on sequences performed after administration of the second contrast agent. Administrating Gd first resulted in less of an effect of the visualization of the first agent on sequences acquired after the second agent.